METODI

Valutazione clinico-auxologica

L’altezza dei pazienti è stata misurata con lo statimetro di Harpenden ed è stata espressa sia come valore in cm sia come z-score rispetto alla media per l’età, per il sesso e per la razza. La velocità di crescita, espressa in cm/anno, è stata calcolata utilizzando la formula:

altezza t2 (cm) - altezza t1 (cm)

intervallo di tempo (mesi): 12

[t1=altezza al controllo precedente; t2= altezza all’ultimo controllo]

È stato poi calcolato l’MPH di ogni soggetto, tramite la formula adeguata per il sesso. Lo sviluppo puberale è stato valutato secondo il metodo di Tanner-Whitehouse19, mentre l’età ossea è stata determinata utilizzando il metodo di Greulich e Pyle.

Il target genetico di ciascun paziente è stato paragonato con la PAH (Predicted Adult Height) determinata in base dell’età ossea secondo il metodo di Bayley e Pinneau111. La statura e la velocità di crescita sono state valutate prima dell’inizio della terapia (T0), a un anno dall’inizio della terapia (T1), a due anni (T2), a tre anni (T3) e alla sospensione della terapia sositutiva con r-hGH (T4).

Ai tempi T1, T2, T3, T4 e T5 (retesting) è stato calcolato il BMI di ciascun paziente utilizzando la formula:

I valori, poi, sono stati espressi in z- score con la formula:

valore del paziente – valore normale per età e sesso SD del valore normale per età e sesso

La statura finale è stata considerata raggiunta nel momento in cui la velocità di crescita è arrivata a <2 cm/anno e l’età ossea raggiunta è risultata sovrapponibile a quella cronologica e/o pari ad almeno 16 anni nel maschio e 14 anni nella femmina.

Dati di laboratorio

Ogni paziente ha effettuato prelievi ematici (al mattino e a digiuno) per la valutazione dei parametri ormonali e biochimici. Il valore della glicemia e dell’HbA1c è stato ricavato con le comuni metodiche di laboratorio, mentre i valori di altri analiti sono stati ottenuti tramite formule specifiche o tecniche immunologiche. L’HOMA-IR è stato ricavato applicando la formula:

Insulinemia a digiuno (µU/mL) x glicemia a digiuno (mg/dL) 405

Sono stati ritenuti normali valori di HOMA-IR <2,42 nei soggetti prepuberi e <3,73 nei soggetti in fase puberale112_{. Il valore dell’insulinemia è stato ottenuto con metodo} immunoenzimatico. I livelli sierici di IGF-1 sono stati dosati con una metodica di chemioluminescenza. È stato, infatti, utilizzato il kit in chemioluminescenza (IDS-iSYS) a due siti in fase solida, dopo dissociazione dell’IGF-1 dalle proteine di legame in fase acida. Tali analiti sono stati valutati ai tempi T0, T1, T2, T3, T4 e T5.

anticorpi policlonali di capra anti-hGH. Con questa metodica, il cut-off per la diagnosi di GHD è di 5,15 g/L50.

In ottemperanza alla nota AIFA n. 39 sono stati condotti due test di stimolazione farmacologica, in due diversi giorni, in fase diagnostica ed uno soltanto al momento del retesting. In questo studio, sono stati eseguiti i seguenti test:

• Test ITT: è stata somministrata per via endovenosa l’insulina umana regolare (HUMULIN®R fl 100UI/ml – Eli Lilly Italia), alla dose di 0,1 U/Kg. I prelievi di sangue per il dosaggio dei livelli circolanti dell’ormone sono stati effettuati ai tempi -20, 0, +20, +40, +60, +80 e +100 minuti, intendendo con “tempo 0” il momento di infusione dell’insulina;

• Test con Arginina: È stata somministrata Arginina Cloridrato 30% per via endovenosa in un tempo di 30 minuti alla dose di 0,5 g/kg. Anche in questo caso, i prelievi sono stati

effettuati ai tempi -20, 0, +20, +40, +60, +80 e +100 minuti;

• Test con L-Dopa: La L-Dopa è stata somministrata per os sotto forma di compresse costituite da una miscela di L-Dopa e Carbidopa (Sinemet® 100 mg + 25 mg cp - MSD), alla dose di 290 mg/m², riferita alla L-Dopa. I tempi di prelievo sono gli stessi dei test precedenti, protraendosi però fino a +120 minuti;

• Test con GHRH+ARG: inizialmente è stato somministrato il GHRH (fiale da 50 µg/mL) in bolo endovena alla dose di 1 µg/kg, seguito dall’infusione endovenosa in 30 minuti di Arginina Cloridrato 30%, alla dose di 0,5 g/kg. Il prelievo dei campioni ematici è stato effettuato ai tempi -30, 0 (basale), + 5, + 15, + 30, + 45, + 60, + 90 minuti.

È stata effettuata la rivalutazione della secrezione di GH alla statura finale (Retesting). In tale fase è stato utilizzato l’ITT e sono stati considerati indicatori di un’adeguata secrezione di GH valori >5 µg/L55.

Bioimpedenziometria

La Bioimpedenziometria (Bioelectrical Impedance Analysis, BIA) è una metodica che esegue un’analisi qualitativa e quantitativa della composizione corporea ed è molto utilizzata per la sua semplicità di esecuzione, il basso costo e la non invasività. I parametri che vengono ricavati dalla BIA riguardano la massa magra (Free Fat Mass, FFM), la massa grassa (Fat Mass, FM) e l’acqua totale corporea (Total Body Water, TBW)113.

Figura 7 Bilancia impedenziometrica TANITA (Body composition analizer BC-418) della Sezione di Endocrinologia Pediatrica dell’Azienda Ospedaliero-Universitaria Pisana utilizzata per analizzare la % di massa grassa dei soggetti analizzati.

In questo studio la BIA è stata eseguita tramite la bilancia impedenziometrica Tanita (Body composition analizer BC-418). La valutazione è stata eseguita al mattino, a digiuno, preferibilmente 2-3 ore dopo il risveglio e a temperatura ambiente confortevole (20-24°C). Per la misurazione ogni paziente è stato posto in stazione eretta sulla piattaforma di misurazione, dopo aver rimosso indumenti e calzature. Il valore percentuale della FM è stato, in seguito, confrontato con quello standard per età e sesso. Tale misurazione in questo studio è stata effettuata una sola volta al momento della sospensione della terapia.

Calorimetria indiretta

La calorimetria indiretta è una metodica che permette di valutare il metabolismo basale del paziente. Il calorimetro è composto da un casco trasparente (canopy) connesso ad un ventilatore (blower) che garantisce il flusso d’aria all’interno del casco stesso, entrambi, poi, sono collegati a un software. Poiché il metabolismo basale, oltre a dipendere da fattori individuali, sesso, età, e stati patologici è anche influenzato dall’assunzione di farmaci, dall’alimentazione, dall'attività sportiva e dalla temperatura ambientale, il soggetto in esame è stato invitato a rimanere a digiuno almeno 4-6 ore prima dell’esame e ad evitare fattori che avrebbero potuto provocare eccitazione fisica e/o mentale (fumo, sforzi fisici, uso di farmaci). Inoltre, la calorimetria è stata effettuata in un ambiente confortevole, a temperatura

ambientale e con pressione atmosferica standard. Per eseguire l’esame è stato utilizzato il

calorimetro COSMED fitmate CANOPY, con un tempo di registrazione di circa 12 minuti. Ogni paziente ha effettuato l’esame sul lettino in posizione semiseduta, indossando l’apposito casco e rimanendo a riposo ma in stato di veglia. Il parametro ricavato da tale esame è l’RMR (Resting Metabolic Rate) espresso in Kcal/die, indice della spesa energetica a riposo. I valori ottenuti sono stati confrontati con i valori standard per età e sesso. Tutti i pazienti studiati sono stati sottoposti a calorimetria indiretta al momento della sospensione della terapia o in fase di retesting.

Figura 8 Calorimetro COSMED fitmate CANOPY utilizzato nella sezione di Endocrinologia Pediatrica dell’Azienda Ospedaliero-Universitaria Pisana. Nella figura sono mostrati il casco ventilato (Canopy), il blower e il fitmate PC Software.

QUS

L’ultrasonometria ossea quantitativa (Quantitative UltraSound, QUS) è una tecnica, utilizzata per la valutazione dello stato minerale osseo periferico, che si basa sull’analisi della trasmissione degli ultrasuoni attraverso la porzione distale della diafisi della falange prossimale, in prossimità dei condili (Region of Interest, ROI) delle ultime quattro dita (II-V) della mano non dominante. I condili della diafisi sono una sede di repere adeguata per ridurre l’eventuale errore da riposizionamento nel caso di misurazioni seriate114, 115 e, inoltre, l’estremità distale della diafisi della falange prossimale (a livello della ROI) contiene sia osso corticale che trabecolare.

Sulle superfici laterale e mediale di ogni falange sottoposta a misurazione vengono posizionati due trasduttori (uno emittente ed uno ricevente) del diametro di 12 mm. Le

superfici mediale e laterale della stessa falange sono approssimativamente parallele, riducendo così la dispersione dell’onda ultrasonica116. Per migliorare la trasmissione degli ultrasuoni tra i trasduttori e la cute si ricorre all’uso di gel ecografico standard. Prima della misurazione a livello delle falangi viene misurata la velocità con cui gli ultrasuoni attraversano i tessuti molli, a livello del triangolo compreso tra la base del pollice e la base del dito indice. Lo strumento calcola poi la velocità dell’ultrasuono attraverso il rapporto tra la distanza tra i due trasduttori (che corrisponde alla larghezza del dito) e il tempo che l’onda impiega a percorrerla. La velocità dell’ultrasuono è espressa in m/s ed è denominata AD-SoS (Amplitude-Dependent Speed of Sound) in quanto ampiezza-dipendente: il tempo calcolato corrisponde a quello impiegato dal segnale emesso per essere ricevuto e per raggiungere per la prima volta un valore di ampiezza minima prefissata (2 mV)117.

Lo strumento, inoltre, calcola il tempo di trasmissione del segnale ultrasonografico attraverso l’osso (Bone Trasmission Time, BTT, espresso in µs) come differenza tra il tempo in cui il primo picco del segnale ricevuto raggiunge il suo massimo ed il tempo che verrebbe misurato se tra i trasduttori fosse presente soltanto tessuto molle, in assenza di tessuto osseo. Il risultato finale è la misura media di AD-SoS e BTT calcolata sulle quattro dita della mano115.

Figura 9 A) Rappresentazione schematica della metodica ultrasonografica falangea; B) Modalità di calcolo dei parametri ultrasonometrici tramite la QUS.

L’esame è stato effettuato con l’apparecchio DBM Sonic, (IGEA, Carpi, Modena)115. I valori di AD-SoS e BTT misurati nei pazienti sono stati comparati con i valori di riferimento per il sesso e l’età ed espressi in z-score, mediante la stessa formula di calcolo utilizzata per le variabili auxologiche. È stato calcolato anche che il coefficiente di variazione (Coefficient of Variation, CV) intra- e inter-operatore sia per l’AD-SoS e che per il BTT118. La QUS è stata eseguita, al retesting, in un sottogruppo di pazienti (17/26; 4 F, 13 M).

Figura 10 Apparecchio DBM Sonic, (IGEA, Carpi, Modena) presente nella sezione di Endocrinologia Pediatrica dell’Azienda Ospedaliero-Universitaria Pisana che ha effettuato le QUS dei soggetti presi in esame.

Consenso informato

Analisi statistica

I dati riportati sono stati espressi come valore medio ± DS, se non altrimenti specificato. Dopo la verifica della distribuzione normale dei vari parametri, i confronti tra i gruppi sono stati effettuati con il test ANOVA. L’esistenza di una relazione tra i vari parametri presi in esame è stata analizzata con il test della correlazione multivariata. È stato considerato statisticamente significativo un valore di p<0,05.

L’analisi statistica è stata elaborata utilizzando il software JMP versione 12 (SAS Institute Inc, Cary, NC, USA).

3-RISULTATI