Metodiche per la determinazione delle mutazioni di EGFR

Il materiale biologico da cui estrarre gli acidi nucleici per la determinazione dello stato mutazionale di EGFR è costituito da tessuto neoplastico, ottenuto mediante resezione chirurgica, biopsia, citologico o brushing bronchiale. I fattori limitanti la diagnosi molecolare di tali mutazioni sono uno scarso numero di cellule neoplastiche nel campione, la loro diluizione con cellule non tumorali dello stroma e l’eterogeneità del tessuto tumorale. 78

Varie metodiche possono essere impiegate per determinare lo stato mutazionale di EGFR (Figura 2.7). Quelle più frequentemente utilizzate sono le seguenti:

- sequenziamento con metodo Sanger degli esoni comunemente mutati dopo amplificazione con PCR;

- metodi che sfruttano reazioni di PCR come Rotor-Gene® e Therascreen®;

- sequenziamento con Sequenom, un metodo che sfrutta la spettrometria di massa MALDI-TOF;

- tecniche di next-generation sequencing che includono pannelli di geni tra cui EGFR, come ad esempio quelli disponibili per MISeq (Illumina) o ionTorrent (Life Technologies);

Ogni metodo presenta peculiari caratteristiche di specificità e sensibilità, consentendo al clinico una diversa capacità di identificare le mutazioni ricercate. Le metodiche di screening, come il sequenziamento secondo Sanger e il pirosequenziamento, permettono di valutare l’intero

32 spettro mutazionale e di effettuare diagnosi del tipo specifico di mutazione, mentre le metodiche a bersaglio molecolare permettono di individuare la presenza di specifiche mutazioni già note. La metodica più comunemente impiegata per le analisi mutazionali è il sequenziamento diretto secondo Sanger che ha una sensibilità di circa il 10-20%. Questo significa che il sequenziamento diretto identifica la presenza di una mutazione solo se questa è presente nel 10-20% del DNA, ovvero nel 20-40% delle cellule presenti, poiché le mutazioni si sviluppano in eterozigosi e solamente un allele è mutato. 79 Nel caso del sequenziamento secondo Sanger occorre procedere con due distinte amplificazioni PCR, una senso e l’altra anti- senso, complessivamente 4 reazioni per ogni campione. E’ considerato positivo per mutazione il campione che presenta una alterazione di sequenza in almeno due diverse reazioni, una senso e l’altra antisenso, derivanti da PCR distinte. Ciò consente di evidenziare artefatti legati al materiale di partenza, fissato in formalina o in scarsa concentrazione, ed evitare refertazioni falsamente positive. 79

Il pirosequenziamento è una tecnica che si basa sul monitoraggio della sintesi del DNA rilevando la bioluminescenza prodotta al termine di una cascata di reazioni enzimatiche innescata dall’incorporazione di un nucleotide. Ha una sensibilità del 5-10% e consente, a differenza del sequenziamento secondo Sanger, l’utilizzo di kit disponibili in commercio per la determinazione delle mutazioni geniche di EGFR attraverso l’analisi degli hot spot mutazionali degli esoni 18-19-20-21. Questi kit diagnostici, validati per l’impiego clinico in Europa (CE-IVD), risultano più sensibili, consentono

33 una standardizzazione e includono controlli positivi e negativi, col fine di ottenere un risultato diagnostico attendibile. 79

Fra le metodiche a bersaglio mutazionale, la Real Time PCR è quella che negli ultimi anni si è imposta maggiormente. Tale procedura è stata utilizzata per la preparazione di kit commerciali, talora basati su processi di amplificazione selettiva dell’allele mutato, quali primer ARMS (Amplification Refractory Mutation System), che rendono i test particolarmente sensibili. Tra i kit attualmente in commercio, il test cobas® 4800 EGFR Mutation Test (Roche® Molecular Systems) è degno di una particolare menzione, in quanto associa ad un test diagnostico molto sensibile ed automatizzato su strumentazione dedicata, una procedura certificata per l’estrazione del DNA. È inoltre attualmente disponibile in commercio un kit basato sulla tecnologia ARMS/Scorpion, in grado di individuare 29 diverse mutazioni dell’EGFR, tra cui quelle più frequentemente descritte in letteratura nei pazienti con NSCLC (TheraScreen®: EGFR29 Mutation Kit). La sensibilità teorica della metodica è tale da individuare mutazioni quando le copie di DNA mutato rappresentano circa l’1% del DNA totale. Tuttavia, è da sottolineare che la metodica individua una mutazione se nel campione sono presenti almeno 5- 10 copie di DNA mutato. Pertanto, l’analisi effettuata su un numero esiguo di cellule potrebbe comunque dare dei falsi negativi. 79

È altresì possibile sviluppare metodiche alternative di Real Time PCR basate sulla discriminazione allelica per la individuazione di mutazioni dell’EGFR. Queste dovrebbero essere in grado di individuare le principali mutazioni dell’EGFR riportate in letteratura negli esoni 19 e 21 ed, eventualmente, negli esoni 18 e 20.

34 La spettrometria di massa (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization- time of flight, MALDI-TOF) è una tecnologia multiplex hot-spot che permette la genotipizzazione del campione analizzato mediante l’amplificazione del DNA, seguita da una reazione di estensione a singola base di primer adiacenti ai siti polimorfici di interesse. Per ciascun sito polimorfico si ottengono uno o più analiti di massa nota, ciascuno corrispondente al genotipo wild-type oppure mutato del campione analizzato. La sensibilità analitica è di circa 1-5%. Ad oggi sono disponibili in commercio kit validati per l’uso diagnostico, basati sulla spettrometria di massa MALDI-TOF, che permettono, mediante l’utilizzo di PCR multiplex, la rivelazione delle principali mutazioni di EGFR. Uno dei principali vantaggi di questa tecnica è quello di permettere l’analisi mutazionale completa del campione con una quantità di DNA limitata ed inferiore a quella richiesta dalle altre metodologie. I kit disponibili forniscono anche gli opportuni controlli positivi e negativi da includere in ogni singola seduta di analisi. L’applicazione di questa metodica ha consentito di ottimizzare i tempi di refertazione grazie all’elevata processività e alla completa genotipizzazione del campione. 80

Le tecniche di next generation sequencing (NGS) si basano sull’amplificazione clonale delle singole molecole di DNA, che vengono sequenziate indipendentemente e ripetutamente. A differenza del sequenziamento classico, in cui l’elettroferogramma è un segnale derivante dalla somma di sequenze mutate e wild-type, nella NGS la rappresentazione digitale delle singole sequenze ne aumenta notevolmente la sensibilità. Inoltre, i sequenziatori di nuova generazione consentono di analizzare in un singolo esperimento quantità di genoma di gran lunga maggiori rispetto al

35 sequenziamento classico. Sono disponibili in commercio diversi pannelli di NGS che contengono i geni EGFR, come MISeq di Illumina o IonTorrent di Life Technologies. La sensibilità analitica dei pannelli disponibili in commercio varia tra il 2% ed il 5%. Il vantaggio dell’impiego dell’NGS è rappresentato dalla possibilità di effettuare in una singola analisi una caratterizzazione completa delle mutazioni della neoplasia. Le metodiche di NGS sono tuttavia complesse, richiedono competenze di biologia molecolare e di bioinformatica ed il loro impiego dovrebbe quindi essere limitato a laboratori con elevata esperienza. 59

Figura 2.7. Aumento della sensibilità dei metodi di identificazione delle mutazioni di EGFR negli anni: dal Sanger sequencing disponibile nel 2004 ai sistemi basati su RT-PCR disponibili nel 2011 ai più evoluti sistemi di next generation sequencing.

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