Metodo sperimentale per correzione effetto schermatura

La considerazione di partenza è che in ciascun pozzetto il segnale di fluorescenza in uscita a seguito dell’eccitazione (quello rilevato dallo strumento) possa essere differente al variare della concentrazione e dell’acclimatazione delle microalghe (quindi al contenuto di clorofilla). Matematicamente:

= ( , ) = ; = (Eq. C.1)

Il metodo pensato comporta onerosità in termini di tempo ed è molto simile al protocollo utilizzato per la taratura.

Avendo a disposizione la Tabella 7 con i valori di concentrazione iniziale inoculati per diversi irraggiamenti è possibile scegliere 7 punti di quei punti per ciascun irraggiamento.

Si inocula ciascun pozzetto del chip con un unico valore di concentrazione e lo si chiude con il layer e la gabbia in lamiera. Successivamente si deve attendere la sedimentazione delle microalghe (21 ore indicativamente) e si effettua un’analisi al FluorCam per rilevare il valore di fluorescenza massima con la gabbia (prima) e senza la gabbia (poi). Dopo ciò si esegue una conta complessiva media su tutti i pozzetti nel caso la concentrazione microalgale fosse variata.

In tal modo si hanno a disposizione 45 valori di fluorescenza massima (con e senza gabbia) validi per quel valore di concentrazione.

Si ripete lo stesso procedimento per le altre concentrazioni scelte ad un fissato irraggiamento. Si ripete poi la medesima procedura per microalghe acclimatate a differenti flussi luminosi.

Ciò che in definitiva si va ad effettuare con questo metodo è un’indagine locale pozzetto per pozzetto in cui scegliendo inizialmente l’acclimatazione delle microalghe e mantenendo costante la concentrazione si quantifica la “perdita” del segnale di fluorescenza per effetto della schermatura; il confronto viene fatto con i valori del segnale di fluorescenza senza gabbia.

L’idea finale è quella di disporre di un set di dati (concentrazione ; “fattore correttivo”) per ciascun pozzetto validi ad un preciso irraggiamento. Questi dati saranno poi soggetti ad interpolazione.

C.1.1 Risultati

Sono state effettuate solo due prove valutate ad irraggiamento di 60 μE m^-2 s^-1 con concentrazione iniziale di 3.125∙10³ cells/μL e 2.549∙10⁴ cells/μL.

Nelle seguenti tabelle si sono voluti esporre i valori percentuali di fluorescenza massima che viene schermata espressi come rapporto tra la differenza di fluorescenza massima con la gabbia e fluorescenza massima senza gabbia rispetto alla fluorescenza massima senza gabbia:

% ℎ = = , per ogni pozzetto (Eq.

C.2)

3.125∙10

cells/μL

60

μE m^-2 s^-1 Sezione 1 Sezione 2 Sezione 3

1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 37,41% 29,45% 30,12% 49,31% 45,75% 45,26% 44,39% 37,52% 54,99% 2 33,20% 34,65% 47,22% 38,00% 40,93% 45,72% 39,10% 41,42% 42,71% 3 38,03% 36,01% 36,89% 43,54% 38,39% 47,42% 46,33% 37,23% 36,75% 4 39,78% 32,50% 38,73% 39,21% 39,42% 47,43% 47,74% 38,91% 41,73% 5 36,51% 37,79% 43,57% 48,01% 48,48% 48,46% 49,89% 41,29% 46,90%

2.549∙10

cells/μL

μE m^-2 s^-1 Sezione 1 Sezione 2 Sezione 3

1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 53,59% 66,20% 72,52% 76,52% 71,13% 62,53% 65,92% 56,79% 64,76% 2 50,33% 50,85% 53,23% 52,25% 48,00% 50,48% 58,91% 55,74% 51,59% 3 51,05% 47,99% 58,40% 64,84% 51,98% 53,73% 56,00% 47,69% 44,58% 4 53,67% 48,76% 50,66% 58,03% 50,71% 54,62% 62,82% 54,02% 49,24% 5 67,93% 70,23% 70,32% 72,57% 67,59% 72,36% 75,07% 58,45% 58,92%

Tabella C.1 Raccolta dei valori percentuali di fluorescenza massima schermata dalla

gabbia in lamiera per microalghe acclimatate a 60 μE m^-2 s^-1 a due valori di concentrazione iniziale: 3.125∙10³ e 2.549∙10⁴ cells/μL.

Sezione 1 Sezione 2 Sezione 3 RIG A 1 2 3 4 5 1 2 3 1 2 3 1 2 3 FILA

Figura C.2 Rappresentazione grafica mediante istogramma a barre dei valori percentuali

di fluorescenza massima schermata contenuti in tabella C.1.

Come da risultati esposti in tabella C.1 e relativi grafici in figura C.2 si nota come il valore di fluorescenza massima schermata dalla lamiera è differente a seconda della concentrazione iniziale

e, anche se non verificato in questo lavoro, ci si attende che sia differente anche in base all’acclimatazione come esposto nella formulazione C.1.

Questo metodo permetterebbe la correzione degli effetti derivanti dalla schermatura della gabbia. La procedura è:

- si ottiene il valore di fluorescenza massima per ogni pozzetto; questo deriva dall’analisi di crescita effettuata al PAM con la gabbia in lamiera nel modo classico.

- A ciascun pozzetto è attribuita una perdita il cui valore dipende dal flusso luminoso di crescita (noto), dalla concentrazione (nota solo la concentrazione iniziale) e dalla posizione del pozzetto (nota). Effettuando un’analisi al PAM con la gabbia e poi senza, è possibile conoscere per ogni pozzetto:

 fluorescenza massima con gabbia;  fluorescenza massima senza gabbia.

Conoscendo il valore di concentrazione iniziale si ottiene un set discreto di dati:  (C; F_m ^{CON GABBIA})

 (C; F_m ^{SENZA GABBIA})

e sfruttando i valori delle due fluorescenze, mediante Eq. C.2:  (C; % F_m ^SCHERMATA).

La loro interpolazione permetterà di ottenere una serie di curve parametriche al flusso luminoso per ogni pozzetto del chip in grado di correlare la perdita di fluorescenza con la concentrazione; in pratica è come effettuare una prova di “taratura” su ciascun pozzetto. In definitiva si avranno 45 curve per ciascun valore di flusso luminoso di crescita.

- Ottenuto il valore di fluorescenza massima dal monitoraggio della crescita è possibile ricavare la percentuale perduta; dividendo il primo per la percentuale è possibile ricavare il valore di fluorescenza massima che si avrebbe senza la gabbia ed utilizzarlo poi per il calcolo della concentrazione mediante la correlazione .

- Ripetendo questo per tutti i pozzetti si otterranno i valori di concentrazione risultati dai valori di F_m corretta. Si eseguirà poi il calcolo delle rispettive medie e deviazioni standard. - Tale procedura va effettuata ogni volta che si effettua un’analisi di crescita al PAM ed i

valori medi di concentrazione ottenuti alla fine sono quelli che verranno poi diagrammati in funzione del tempo per la creazione delle curve discrete di crescita.

Figura C.3 Schematizzazione della procedura di correzione relativa ad un pozzetto e ad un

flusso luminoso specifico. Eseguita per ciascun pozzetto, con flusso luminoso fissato, si eseguono medie e deviazioni standard sui valori di concentrazione ottenuti.

Appendice D

Raccolta grafici

Al fine di non rendere troppo voluminoso il capitolo 5 riguardante i risultati ottenuti, si sono raccolte le rappresentazioni grafiche delle curve di crescita in questa appendice.

Questa parte è così strutturata: Parte 1: curve di crescita

- Appendice D.1: grafici fittati della prova di crescita di riferimento con Nannochloropsis gaditana (§ 5.3.1); confronto tra modello logistico e modello lineare.

- Appendice D.2: grafici fittati della prova di crescita di Nannochloropsis gaditana monitorata nel tempo a partire da microalghe già acclimatate ai flussi luminosi di crescita (§ 5.4.1.1). - Appendice D.3: grafici fittati della prova di crescita di Nannochloropsis gaditana partendo

da microalghe acclimatate a media luce e monitorate nel tempo a flussi luminosi a LL, ML ed HL (§ 5.4.1.2).

PARTE 1: CURVE DI CRESCITA