Risultati ottenuti dalla metodica di correlazione

Come annunciato nel Capitolo 3, si sono adottate due tipologie di gabbie: in rete metallica ed in lamiera. Si è inizialmente utilizzata la gabbia in rete metallica effettuando delle prove di taratura con microalghe a differente acclimatazione: 6, 60, 360 e 1000 μE m^-2 s^-1.

I risultati dei 15 punti di taratura scelti si sono rappresentati nel seguente grafico (figura 4.16).

Figura 4.16 Rappresentazione grafica dei 15 punti scelti per alle varie acclimatazioni: 6 μE,

65 μE, 360 μE e 1000 μE.

Come si può notare più chiaramente nelle rappresentazioni a 360 μE e 1000 μE, l’andamento della fluorescenza massima rispetto alla concentrazione presenta una linearità nel tratto iniziale dopodiché il valore di Fm dell’ultimo punto sperimentale inizia a raggiungere un plateau. Questo comportamento è legato al limite massimo strumentale di cui si accennava nel paragrafo § 4.2.1 e sta ad indicare la saturazione del segnale: per concentrazioni maggiori il valore di Fm tende ad oscillare attorno ad una valore medio che dipende dal tipo di microalga in esame e dall’acclimatazione.

Per questo motivo, il range operativo considerato si riferisce esclusivamente alla fase dove si riscontra linearità ed in esso si è effettuata una regressione lineare. I risultati delle tarature si sono riassunti nel grafico in figura 4.17.

Figura 4.17 Rappresentazione grafica dei punti sperimentali nei quali si conservava

linearità tra il valore di Fm ottenuto al FluorCam ed i valori di concentrazione inoculati al tempo t = 0 ore ed interpolazione lineare. Dispositivo di chiusura utilizzato: gabbia in rete metallica.

Le diverse pendenze delle rette sono in accordo col fatto che cellule acclimatate ad irraggiamenti minori presentano un maggior contenuto di clorofilla al fine di catturare il maggior numero di fotoni per svolgere efficientemente la loro attività fotosintetica mentre, aumentando l’intensità di irraggiamento, il contenuto di clorofilla si abbassa in quanto il numero di fotoni incidenti sarebbe troppo elevato e, se assorbiti completamente, andrebbero ad aumentare il quenching-non-fotochimico e innescare reazioni i cui prodotti risulterebbero essere nocivi per le stesse microalghe. Questo diverso contenuto di clorofilla è indicato dai differenti valori di Fm rilevati ed in particolare maggiore è l’irraggiamento e maggiore sarà il limite massimo del range di operabilità di concentrazione verso cui ci si potrà spingere.

Nel caso fin qui presentato le microalghe si trovano sospese nel volume di crescita.

Come descritto nel paragrafo § 3.4, il chip in questione non è dotato di sistemi di agitazione della massa contenuta in ciascun pozzetto e quindi le microalghe tenderanno a sedimentare negli istanti di

tempo successivi. Questo significa che la crescita verrebbe monitorata con le rette di taratura precedenti (ottenute con cellule in sospensione) in condizioni di cellule sedimentate.

Per questo motivo necessita trovare un modo per eseguire la taratura quando le cellule sono sedimentate. Si è pensato allora di inoculare il chip nella stessa modalità presentata in Figura 4.15 ma di effettuare l’analisi al FluorCam per la rilevazione di F_m una volta avvenuto l’evento di sedimentazione. A quest’analisi è seguita una conta cellulare al Nexcelom dato che il numero di cellule potrebbe essere variato nel tempo.

Il seguente grafico esprime il confronto tra i risultati delle tarature effettuate con gabbia in rete metallica nel caso omogeneo e quello sedimentato.

Figura 4.18 Confronto grafico tra tarature nel caso omogeneo (dove i valori di fluorescenza

massima sono stati ricavati da microalghe in sospensione) e nel caso sedimentato. Dispositivo di chiusura utlizzato: gabbia in rete metallica.

Da tener presente che i valori di Fm che lo strumento restituisce risentono della schermatura che la gabbia metallica genera. Per questo motivo si sono volute effettuare le tarature con microalghe allo stato sedimentato con entrambe le gabbie e nei seguenti grafici è possibile vederne le differenze.

Figura 4.19 Correlazione tra fluorescenza e concentrazione cellulare allo stato

SEDIMENTATO con le due tipologie di gabbie: effetto della schermatura della gabbia. Nel grafico di sinistra, relativo alle tarature valutate con la gabbia a rete (GR), i valori di Fm

sono maggiori rispetto a quelli ricavati utilizzando la gabbia in lamiera (GL); confronto a parità di concentrazione.

La taratura ha anche permesso un’analisi senza la parte superiore della gabbia e quindi il rilevamento del valore di F_m senza alcuna interferenza da parte della struttura. In Appendice C si vuole dimostrare l’intensità della schermatura ed esporre un possibile metodo sperimentale di correzione locale di tali valori di fluorescenza.

La schermatura riduce l’intensità della radiazione incidente. Tuttavia l’effetto di questi fenomeni è insito nell’equazione empirica della retta e ai fini del monitoraggio della crescita l’aspetto più importante è che si utilizzi la retta di taratura corretta a seconda del dispositivo di chiusura utilizzato e che la crescita rimanga all’interno del range di concentrazione coperto dalla taratura. Infatti per valori troppo elevati di concentrazione entrano in gioco le dimensioni del sistema ed effetti legati alla sedimentazione: le microalghe non essendo agitate si depositano sul fondo del pozzetto e, man mano che la crescita prosegue, potrebbero stratificare. Di conseguenza si creerebbero effetti di ombreggiamento, apporto differente di energia luminosa nelle zone più interne, variazione (aumento) del contenuto di clorofilla. Inoltre il valore di concentrazione risulterebbe essere poco consistente visto che il valore di fluorescenza viene rilevato da un’immagine superficiale (dall’alto) e quindi risulterebbe essere tanto più affidabile quanto le microalghe riescono a crescere in uno strato monodimensionale; eventuale fluorescenza da parte di microalghe site nelle zone più sottostanti non verrebbe rilevata anche per effetto di fenomeni di assorbimento della stessa da parte delle microalghe adiacenti.

Nella seguente figura si sono riassunte le varie casistiche a flusso luminoso differente senza il dispositivo di chiusura e con le due diverse gabbie.

Figura 4.20 Confronto tra gli andamenti di F_m contro concentrazione cellulare al variare dell’intensità tra le due gabbie.

È possibile vedere il diverso comportamento anche nelle immagini di fluorescenza e più precisamente confrontando i valori numerici delle scale colorimetriche. In figura 4.21 si è considerata solo la taratura a 60 μE m^-2 s^-1 ma le osservazioni sono estendibili anche agli altri casi. Questa indagine ha permesso non solo di confermare il diverso andamento della fluorescenza al variare dei flussi luminosi scelti ma anche di quantificare come essa varia al variare della concentrazione cellulare. In questo modo è possibile, senza alterare le condizioni ed il contenuto del volume di coltura nei pozzetti, monitorare la concentrazione cellulare nel tempo. I risultati che sono stati ottenuti mediante questa procedura sono stati esposti nel capitolo 5.

Figura 4.21 Immagini di fluorescenza relative alla prova di taratura effettuata con microalghe acclimatate a 60 μE m^-2 s^-1 utilizzando la gabbia in lamiera (GL) e gabbia in rete (GR).