L’analisi del campione di miele di sulla SA rivela un segnale molto intenso nel cromatogramma ad un tempo di ritenzione di circa 14 minuti, evidenziato in Figura 6.8. Lo spettro MS in corrispondenza di questo picco mostra un possibile ione molecolare a 165.053 m/z, mentre lo spettro MS2, riportato in Figura 6.9, mostra che le frammentazioni più importanti sono a 103, 119 e 147 m/z. Questo se- gnale, inoltre, permane nel cromatogramma anche dopo lo step di idrolisi. Sulla base della massa esatta, del tempo di ritenzione e delle frammentazioni, tramite una ricerca in letteratura è stato
(a)
(b)
144 [M-H-CO2]-
max = 315 nm
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individuato un possibile candidato nell’acido 3-fenillattico. Questo composto è stato già individuato in varie tipologie di miele, tra cui quello di sulla, a concentrazioni dell’ordine delle decine di ppm [108]. Le frammentazioni del composto possono essere spiegate con le reazioni illustrate nella Fi- gura 6.10. Il segnale a 147 m/z è attribuibile alla disidratazione del composto originale, con forma- zione di acido trans-cinnamico, il quale può poi decarbossilare e fornire lo stirene, responsabile del segnale a 103 m/z. Il segnale a 119 m/z può invece essere attribuito alla perdita di CO ed H2O dell’acido fenillattico, con formazione di un enolo che si riequilibrerà con il corrispondente carbo- nile. Non è stato possibile ottenere dalla letteratura uno spettro di assorbimento UV-Visibile per l’acido fenillattico, ma basandosi sul tempo di ritenzione e sulla struttura della molecola, che è ana- loga a quella degli altri acidi cinnamici che sono stati considerati, si può concludere che l’acido fe- nillattico corrisponda al composto X, che è stato individuato in campioni di castagno, girasole, sulla e trifoglio (paragrafi 5.2, 5.4, 5.6, 5.7).
Figura 6.8 – BPC del campione di miele di sulla SA.
Figura 6.9 – Spettro MS2 del composto incognito con t
R di circa 14 minuti nel campione SA.
O- O OH OH OH O - H2O - CO2 - CO - H2O m/z 165 m/z 147 m/z 103 m/z 119 - H - H - H
Figura 6.10 – Schema delle frammentazioni ipotizzate per l’acido fenillattico.
165 [M-H]- 147 [M-H-H2O]- 103 [M-H-H2O-CO2]- 119 [M-H-H2O-CO]-
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Capitolo 7 – Conclusioni
Il presente lavoro di tesi è stato dedicato alla determinazione quali/quantitativa di composti fenolici in campioni di miele uniflorale, con l’obiettivo di individuare dei parametri legati alla composizione chimica che permettessero la distinzione di ciascuna varietà di miele dalle altre.
La procedura analitica impiegata si è basata sulla separazione cromatografica degli analiti mediante HPLC-DAD ed HPLC-MS/MS utilizzando una colonna Ascentis RP-Amide. È anche stata studiata la dipendenza della risposta della colonna – in termini di tempo di ritenzione e di larghezza dei picchi – da tre diversi parametri operativi: acidità, temperatura e flusso della fase mobile. Per condurre tale studio è stato sviluppato un disegno sperimentale sul modello di Plackett-Burman. Lo studio ha mostrato che la risposta della colonna dipende significativamente da tutti e tre i parametri, ed in particolar modo dal flusso e dalla temperatura. Ciò ha permesso di ottimizzare il metodo di separa- zione cromatografica impostando i parametri ai valori che hanno restituito le risposte migliori (tempi di ritenzione minori e picchi più stretti).
Il metodo cromatografico ha permesso di separare ed identificare 26 diversi composti fenolici, tra cui 14 acidi fenolici, 3 acidi non fenolici, e 9 flavonoidi. La risposta del metodo è lineare per tutti gli analiti, in un range di concentrazioni che per la maggior parte di essi va da 10-1g/g a 101g/g (tre ordini di grandezza). Fa eccezione l’acido ellagico, per cui si trova linearità nel range 10-1–100g/g (due ordini di grandezza). I limiti di rivelabilità e quantificazione strumentali del metodo si trovano rispettivamente nel range 0.001–0.5 g/g e 0.03–1 g/g per la maggior parte degli analiti, con l’ec- cezione dell’acido benzoico e della genisteina, per cui i LOD e LOQ sono entrambi dell’ordine delle unità di g/g. I LOD ottenuti sono coerenti con quelli trovati in letteratura (Tabella 2.5, pagina 24). La procedura di estrazione in fase solida con fase stazionaria Amberlite-XAD 2 ha permesso di iso- lare dalla matrice miele i 26 analiti considerati. Per la maggior parte di essi la resa di estrazione è compresa tra il 40 ed il 98%, mentre per acido gallico, acido ellagico, miricetina e quercetina le rese sono inferiori. Il CV% medio sulla resa di estrazione è inferiore al 20%. I valori delle rese di estrazione ottenuti sono stati impiegati per la quantificazione degli analiti nei campioni di miele.
La procedura analitica ottimizzata è stata applicata a 36 diversi mieli uniflorali toscani, appartenenti alle varietà acacia, castagno, erica, girasole, marruca, sulla e trifoglio. I cromatogrammi mostrano profili molto complessi, che rispecchiano la ricchezza della matrice originale, e la loro interpreta- zione è risultata non immediata. Tramite controllo incrociato dei tempi di ritenzione e degli spettri di assorbimento, e con l’impiego di campioni di miele a cui sono stati aggiunti gli analiti standard, è stato possibile determinare la presenza dei composti considerati nei vari campioni. Tenendo conto del processo di pretrattamento, è stato anche possibile quantificare tali composti. Il contenuto to- tale di polifenoli nei campioni di miele si è rivelato essere nell’ordine delle decine di g/g. La varietà di miele più ricca di composti fenolici è l’erica, seguita in ordine da trifoglio, sulla, acacia, castagno, marruca e girasole. Osservando invece solamente il contenuto di acidi fenolici, i tre mieli con le maggiori concentrazioni sono castagno, erica e trifoglio; questo è in accordo, in particolare per quanto riguarda castagno ed erica, con i risultati trovati in letteratura, secondo i quali i mieli più scuri avrebbero un contenuto di acidi fenolici mediamente superiore [19].
Dallo studio dei campioni di miele mediante HPLC-DAD è emersa la presenza di composti incogniti che forniscono segnali cromatografici molto intensi, e sono contenuti esclusivamente in alcune va- rietà di miele. In particolare, tutti i mieli di castagno, ed alcuni mieli appartenenti ad altre varetà, sono caratterizzati dalla presenza di due composti, inizialmente denominati X ed Y, mentre tutti i mieli di marruca presentavano un terzo composto incognito denominato Z. Il composto incognito X, inoltre, è stato individuato in alcuni campioni di miele di girasole, sulla e trifoglio. Per ottenere informazioni sulla natura di questi composti, che potrebbero costituire dei marker per le varietà di
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miele in cui essi sono presenti, i campioni sono stati studiati mediante HPLC-MS/MS, osservando anche la variazione della risposta a seguito di uno step di idrolisi acida. L’analisi HPLC-MS/MS, unita ad una ricerca bibliografica, ha permesso di chiarire la natura di tutti e tre i composti incogniti. In particolare, il composto X è l’acido 3-fenillattico, il composto Y è il 4-(1-idrossi-1-metiletil)cicloesa- 1,3-dien-1-carbossilato di 6-O-(-D-glucopiranosil)--D-glucopiranosile o GG-CEC, ed il composto Z è l’acido 4-oxo-1,4-diidrochinolin-2-carbossilico o acido diidrochinurenico.
I risultati dello studio dei campioni di miele mediante HPLC-DAD sono stati trattati mediante l’analisi delle componenti principali (PCA), utilizzando come base di dati le aree dei segnali cromatografici riportate come percentuali in ciascun campione. La PCA ha permesso di individuare tratti caratteri- stici per i mieli di acacia, castagno, erica, girasole, marruca e trifoglio, mentre i mieli di sulla hanno mostrato una variabilità molto elevata che non ha permesso di delineare caratteristiche specifiche. È interessante notare che l’acido fenillattico ed il GG-CEC, inizialmente non inclusi nell’elenco degli analiti considerati, si sono rivelati discriminanti per i mieli di castagno, marruca e trifoglio. Dal con- fronto incrociato dei risultati ottenuti mediante l’analisi cromatografica e l’analisi delle componenti principali, è stato possibile costruire un diagramma di flusso che permette di identificare la tipologia di un miele a seconda del suo contenuto di alcuni particolari analiti.
Il diagramma fornisce una risposta corretta per tutti i campioni analizzati ad eccezione di due mieli di girasole, GA e GB (che presentano il segnale dell’acido fenillattico), e del miele di trifoglio TB (che non presenta né il segnale dell’acido fenillattico né quello del GG-CEC).
Figura 7.1 – Diagramma di flusso per l’identificazione della varietà florale di un campione di miele.
Alcuni dei composti che permettono la discriminazione delle diverse tipologie di miele sono stati riportati anche in letteratura come possibili marker. Acido fenillattico e GG-CEC sono già stati pro- posti come caratteristici dei mieli di castagno [104], mentre l’acido abscissico è stato individuato come possibile marker per i mieli di erica [27, 56, 106].
Insieme agli studi condotti nello stesso laboratorio [11, 90], il presente lavoro di tesi introduce lo studio dei mieli di marruca e trifoglio, per i quali non sono reperibili studi in letteratura. Un ulteriore elemento di novità è l’estensione dell’applicazione dell’estrazione in fase solida mediante Amber- lite-XAD 2 ad un numero maggiore di composti fenolici, e studia la separazione sia di acidi fenolici che di flavonoidi con un’unica corsa cromatografica. Infine, il numero di composti che vengono se- parati nella corsa cromatografica è maggiore di quelli reperiti in letteratura. Facendo ad esempio il
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confronto con quanto riportato nella Tabella 2.4 (pagina 21), si nota che il maggior numero di analiti considerati in un singolo studio è 15 [76], tutti appartenenti alla classe dei flavonoidi, mentre nel presente lavoro di tesi sono stati studiati 26 analiti diversi, di cui non tutti sono flavonoidi.