Durante l’analisi dei campioni di miele, è stata notata una bassa riproducibilità dei tempi di riten- zione degli analiti, che in alcuni casi subivano variazioni di 1 minuto o più tra due corse successive. Questo comportamento anomalo potrebbe essere attribuito alla natura della fase stazionaria, i cui meccanismi di azione non sono ancora del tutto noti (Paragrafo 2.3.4). Diversi parametri possono infatti influire sul comportamento delle catene legate alla silice, e sui loro moti rotazionali che si attivano in funzione della polarità della fase mobile. Per comprendere l’entità degli effetti che i vari parametri hanno sulla capacità di interazione della fase stazionaria con gli analiti, è stato deciso di impiegare il disegno sperimentale di Plackett e Burman [95]. Questo disegno sperimentale per- mette di minimizzare il numero di misure necessarie a comprendere l’effetto della variazione di un certo numero di parametri sulla risposta dell’esperimento. In particolare, con questo disegno si eseguono sempre 4n esperimenti, e con essi si riesce a valutare la dipendenza da 4n – 1 parametri. Esistono dunque disegni sperimentali progettati per la valutazione di 3, 7, 11, … parametri. Quando si deve valutare un numero di parametri compreso tra due di questi valori, si sceglie il numero più alto, ed i parametri mancanti vengono aggiunti come “fantocci”. Nel caso presente, i parametri principali che sono stati considerati sono la percentuale di acido formico nella fase mobile, il flusso della fase mobile stessa e la temperatura di termostatazione della colonna. Per ciascuno di questi parametri, il disegno sperimentale prevede di selezionare un valore alto ed un valore basso, che vengono chiamati più precisamente “livelli” [96]. Nella Tabella 3.7 sono riportati i valori selezionati.
Tabella 3.7 – Livelli dei parametri impiegati per il disegno sperimentale. Parametro Livello basso Livello alto
Acido formico (%) 0.14 0.3
Temperatura (T, °C) 40 50
Flusso (mL/min) 0.3 0.4
Dato che i parametri sono 3, sarebbe sufficiente impiegare il disegno sperimentale con n = 1, ovvero utilizzando 4 esperimenti. In realtà, è buona norma in questo metodo avere a disposizione un certo numero di parametri “fantoccio”, poiché questi risultano importanti nella determinazione della si- gnificatività dei risultati (si vedano i paragrafi seguenti). È stato pertanto deciso di impiegare il di- segno sperimentale con n = 2, ovvero con 8 esperimenti. Devono allora essere utilizzati 4 parametri aggiuntivi, che saranno costituiti dai tre parametri incrociati a coppie (Acidità e T, acidità e , T e
) e dal parametro incrociato triplo. Una volta stabiliti i parametri, si costruisce il modello, ovvero l’equazione che mette in relazione questi con la risposta strumentale. Il modello più utilizzato è quello lineare additivo, in cui i singoli parametri contribuiscono individualmente e sono moltiplicati per un certo coefficiente. Se si indica con x1 l’acidità, con x2 la temperatura e con x3 il flusso, il modello può essere descritto dall’equazione (3.1). Il termine y indica la risposta strumentale. È im- portante notare che non è necessario stabilire livelli per i parametri incrociati, poiché essi vengono rappresentati dai prodotti dei parametri singoli.
𝑦 = 𝑏0+ 𝑏1𝑥1+ 𝑏2𝑥2+ 𝑏3𝑥3+ 𝑏12𝑥1𝑥2+ 𝑏13𝑥1𝑥3+ 𝑏23𝑥2𝑥3+ 𝑏123𝑥1𝑥2𝑥3 (3.1)
L’obiettivo del disegno sperimentale è di determinare i coefficienti bi, i quali possono dare una mi- sura dell’influenza del corrispondente parametro su y. In particolare, il coefficiente b0, detto inter- cetta, fornisce una stima della risposta sperimentale indipendentemente dai parametri considerati.
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I coefficienti b1, b2 e b3 indicano l’influenza su y da parte dei tre singoli parametri principali, mentre b12, b13 e b23 forniscono indicazioni sugli effetti combinati di due parametri (e possono essere defi- niti come effetti al secondo ordine). Infine, b123 stima l’azione su y di tutti e tre i parametri combinati (effetto al terzo ordine). In generale, i coefficienti positivi indicano che il parametro corrispondente e la risposta aumentano nello stesso verso, mentre un coefficiente negativo implica che il parame- tro ed y aumentano in modo opposto. Inoltre, i coefficienti saranno tanto più grandi in valore asso- luto, quanto più grande è l’influenza su y del corrispondente parametro.
Nella Tabella 3.8 sono riportati i valori dei parametri per tutti gli 8 esperimenti previsti. È consue- tudine rappresentare tali valori in forma codificata, ovvero sostituendo il numero “1” ad un qual- siasi livello alto ed il numero “–1” ad un qualsiasi livello basso. In questo modo, anche i parametri incrociati vengono indicati da 1 o –1, a seconda dei livelli dei parametri principali. È quindi possibile rappresentare in maniera comoda il disegno sperimentale tramite una matrice D, in cui le righe sono gli esperimenti, e le colonne i parametri. Tale matrice è riportata nell’equazione (3.2).
Tabella 3.8 – Livelli dei parametri principali negli esperimenti previsti dal disegno. Esperimento Acido formico (%) Temperatura (°C) Flusso (mL/min)
1 0.14 50 0.4 2 0.14 40 0.3 3 0.3 50 0.3 4 0.3 40 0.4 5 0.14 40 0.4 6 0.3 50 0.4 7 0.14 50 0.3 8 0.3 40 0.3 𝐷 = [ −1 +1 +1 −1 −1 +1 −1 −1 −1 −1 +1 +1 +1 −1 +1 +1 −1 +1 −1 −1 −1 +1 −1 +1 −1 +1 −1 −1 −1 −1 +1 +1 −1 −1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 −1 +1 −1 −1 +1 −1 +1 +1 −1 −1 −1 −1 +1 +1] (3.2)
Da un punto di vista pratico, i coefficienti vengono calcolati dai risultati che si ottengono dagli otto esperimenti. Il calcolo risulta particolarmente comodo in notazione matriciale: si può costruire un vettore y dei risultati sperimentali, un vettore b dei coefficienti, ed una matrice X dei parametri. In particolare, tale matrice potrà essere ottenuta aggiungendo a D una prima colonna composta da soli “1”, che moltiplicherà il coefficiente b0 (il quale non è legato a nessun parametro). L’equazione (3.3) mostra i vettori e la matrice coinvolti nel calcolo. La determinazione del vettore dei coefficienti è eseguita per semplice inversione della matrice X.
𝑦⃗ = 𝑋 ∙ 𝑏⃗⃗ (3.3) [ 𝑦1 𝑦2 𝑦3 𝑦4 𝑦5 𝑦6 𝑦7 𝑦8] = [ 1 −1 +1 +1 −1 −1 +1 −1 1 −1 −1 −1 +1 +1 +1 −1 1 +1 +1 −1 +1 −1 −1 −1 1 +1 −1 +1 −1 +1 −1 −1 1 −1 −1 +1 +1 −1 −1 +1 1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 1 −1 +1 −1 −1 +1 −1 +1 1 +1 −1 −1 −1 −1 +1 +1] ∙ [ 𝑏0 𝑏1 𝑏2 𝑏3 𝑏12 𝑏13 𝑏23 𝑏123]
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3.4.2 – Procedura sperimentale
È stata preparata una soluzione standard contenente quattro analiti scelti in base al tempo di riten- zione (all’inizio, nel centro ed alla fine della corsa), in modo da osservare la variazione della risposta strumentale in diversi punti della corsa cromatografica: acido 3,4-diidrossibenzoico (3,4-diHB), acido siringico, esperidina e naringenina. La soluzione è stata preparata a partire dalle quattro so- luzioni madre in metanolo da 100 ppm. Una volta prelevata l’aliquota di interesse, la miscela è stata portata a secco sotto flusso di azoto, e ripresa con una quantità di acqua 10 volte maggiore, in modo da ottenere una concentrazione di circa 10 ppm di ciascun analita.
Sono stati scelti due diversi parametri da utilizzare come risposta sperimentale: il tempo di riten- zione degli analiti, e la larghezza dei loro picchi nei profili cromatografici. Il tempo di ritenzione è misurato in minuti, mentre la larghezza del picco è adimensionale, poiché come noto, se si assume che il picco riproduca una campana gaussiana, essa corrisponde a quattro volte la deviazione stan- dard sul numero di piatti teorici. Ciascuno degli 8 esperimenti previsti dal disegno di Plackett-Bur- man è stato eseguito in triplicato, ed è stato calcolato un valore medio per entrambi i parametri. In questo modo, sono stati ottenuti due vettori dei risultati sperimentali per ciascun analita. Per cia- scun esperimento è stato impiegato il programma di gradiente descritto nella Tabella 3.4.