Nella Tabella 4.1 sono riportati i quattro vettori dei risultati ottenuti osservando i tempi di riten- zione per i quattro analiti. Nella Tabella 4.2 sono invece riportati i coefficienti bi calcolati, ed il coef- ficiente critico rispetto al quale questi devono essere confrontati. I coefficienti che risultano signi- ficativi, ovvero che superano in valore assoluto bcritico, sono evidenziati in corsivo grassetto.
Tabella 4.1 – Vettori dei tempi di ritenzione ottenuti dagli esperimenti. Esperimento
Tempi di ritenzione (min)
A. 3,4-diHB A. Siringico Esperidina Naringenina
1 4.95 9.60 28.99 40.98 2 7.19 13.67 31.63 45.74 3 5.54 10.65 31.34 44.16 4 5.78 11.04 29.93 43.07 5 6.19 11.65 29.08 42.04 6 4.72 9.08 29.71 41.90 7 5.73 11.11 30.86 43.45 8 6.83 13.11 32.20 46.28
Tabella 4.2 – Vettori dei coefficienti calcolati per i tempi di ritenzione. b A. 3,4-diHB A. Siringico Esperidina Naringenina
b0 5.87 11.24 30.47 43.45 b1 -0.15 -0.27 0.33 0.40 b2 -0.63 -1.13 -0.24 -0.83 b3 -0.46 -0.90 -1.04 -1.46 b12 0.04 0.02 -0.03 0.01 b13 -0.01 -0.01 0.06 0.09 b23 0.06 0.13 0.16 0.27 b123 0.00 0.00 0.00 -0.04 bcritico 0.08 0.14 0.19 0.31
Come si può notare, gli analiti che mostrano una maggiore variabilità dei tR sono l’acido siringico e l’esperidina, per i quali la variazione di tR tra il minimo ed il massimo ottenuti è superiore a 4 ed a 5 minuti, rispettivamente. Per quanto riguarda i coefficienti, è possibile notare che nessuno degli ef- fetti di secondo e terzo ordine risulta significativo. Pertanto, i modelli per i quattro analiti possono
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essere scritti come riportato nelle equazioni (4.1) – (4.4). I modelli ottenuti permettono di fare al- cune considerazioni. Per prima cosa, l’aumento di temperatura causa la diminuzione dei tempi di ritenzione di tutti e quattro gli analiti. Tale comportamento è dovuto alla dipendenza della costante di ripartizione k degli analiti dalla temperatura, che è espressa, come per tutte le costanti di equili- brio, dall’equazione di Van’t Hoff (4.5). È anche importante notare che la temperatura è il parame- tro di maggiore influenza per i due acidi fenolici, e dunque nelle analisi dei campioni di miele è fondamentale che la colonna venga sempre termostatata.
Acido 3,4–diidrossibenzoico 𝑦 = 5.87 − 0.15𝑥1− 0.63𝑥2− 0.46𝑥3 (4.1) Acido siringico 𝑦 = 11.24 − 0.27𝑥1− 1.13𝑥2− 0.90𝑥3 (4.2) Esperidina 𝑦 = 30.47 + 0.33𝑥1− 0.24𝑥2− 1.04𝑥3 (4.3) Naringenina 𝑦 = 43.45 + 0.40𝑥1− 0.83𝑥2− 1.46𝑥3 (4.4) 𝑑𝑙𝑛𝑘 𝑑𝑇 = ∆𝐻 𝑅𝑇2 (4.5)
L’aumento del flusso risulta influire negativamente sul tempo di ritenzione in tutti i casi, e questo è intuitivamente dovuto al fatto che il tempo di ritenzione è dipendente dal volume che passa attra- verso la colonna. Un flusso maggiore implica un maggiore volume eluito nell’unità di tempo, e que- sto si traduce in un tempo di ritenzione più corto per tutti gli analiti. Un tale effetto si ripercuote infatti in maniera crescente andando dagli analiti a tR minori a quelli a tR maggiori, poiché la diffe- renza nel volume di fase mobile che passa diviene sempre più evidente al passare del tempo. Infine, è interessante osservare l’effetto dell’acidità sul tempo di ritenzione. Infatti, mentre per i flavonoidi il contributo dell’acidità risulta positivo, per gli acidi fenolici è invece negativo. Questo effetto è apparentemente contraddittorio, poiché un aumento dell’acidità dovrebbe sfavorire la dissociazione degli acidi e comportare uno spostamento dell’equilibrio di ripartizione verso la fase stazionaria, aumentando i tempi di ritenzione e non riducendoli. In realtà, a questo effetto che au- menta il tR se ne affianca un altro, dovuto alla coesistenza nella fase mobile della forma dissociata ed indissociata degli acidi. La presenza dell’analita in due forme diverse genera un allargamento del picco cromatografico corrispondente, e questo è probabilmente responsabile di uno spostamento del punto di massimo (sul quale viene stimato il tR) a valori più alti al diminuire dell’acidità. Appare chiaro dai risultati che l’effetto di allargamento del picco prevale su quello di spostamento dell’equi- librio, e l’effetto totale dell’acidità risulta negativo. Questo può essere confermato anche osser- vando i risultati del paragrafo seguente, in cui si considerano gli effetti dei parametri sulla larghezza di picco. L’influenza dell’acidità sulla ritenzione dei due flavonoidi, che è l’unico contributo positivo che si trova nelle equazioni, è invece più difficile da spiegare. Come già osservato nel paragrafo 4.1, infatti, queste molecole sono dotate di un elevato numero di gruppi con idrogeni mobili (in parti- colare, gruppi idrossilici). A seconda della struttura della molecola, i vari gruppi possono formare legami a idrogeno intramolecolari, che influenzano la mobilità degli idrogeni e rendono la specie non solo più o meno polare, ma anche più o meno influenzata dall’acidità.
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4.2.2 – Larghezze di picco
Nella Tabella 4.3 sono riportati i risultati ottenuti utilizzando come risposta strumentale la larghezza dei picchi cromatografici invece dei tempi di ritenzione. Per facilitare il calcolo e migliorare la visua- lizzazione dei dati, le larghezze di picco sono state tutte moltiplicate per 103 prima di calcolare i vettori dei coefficienti. Anche in questo caso, i coefficienti significativi sono evidenziati in corsivo grassetto nella Tabella 4.4. Come si può notare, anche in questo caso tutti gli effetti di secondo e terzo ordine risultano trascurabili. A differenza del modello in cui si impiegava il tempo di ritenzione, tuttavia, in questo caso anche alcuni dei fattori principali risultano non significativi. Le equazioni (4.6) – (4.9) mostrano i modelli ottenuti per i quattro analiti.
Tabella 4.3 – Vettori delle larghezze di picco ottenuti dagli esperimenti. Esperimento
Larghezza di picco (·103 u.a.)
A. 3,4-diHB A. Siringico Esperidina Naringenina
1 180 269 158 209 2 245 258 175 204 3 217 303 175 213 4 190 226 162 188 5 201 216 157 190 6 174 256 166 210 7 221 318 172 213 8 235 273 174 202
Tabella 4.4 – Vettori dei coefficienti calcolati per le larghezze di picco. b A. 3,4-diHB A. Siringico Esperidina Naringenina
b0 208 265 167 204 b1 -4 0 2 0 b2 -10 22 0 8 b3 -22 -23 -7 -4 b12 1 -7 1 1 b13 0 0 1 0 b23 1 -1 1 3 b123 0 1 0 0 bcritico 2 7 2 3 Acido 3,4–diidrossibenzoico 𝑦 = 208 − 4𝑥1− 10𝑥2− 22𝑥3 (4.6) Acido siringico 𝑦 = 265 + 22𝑥2− 23𝑥3 (4.7) Esperidina 𝑦 = 167 + 2𝑥1− 7𝑥3 (4.8) Naringenina 𝑦 = 204 + 8𝑥2− 4𝑥3 (4.9)
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Anche da questi risultati è possibile trarre alcune conclusioni. Si può osservare ad esempio che l’au- mento di acidità genera una riduzione della larghezza del picco nel caso dell’acido 3,4-diidrossiben- zoico. Questo è coerente con la coesistenza delle due forme dell’acido, che è già stata discussa nel paragrafo precedente. La più importante osservazione che si può fare è comunque che il flusso ha un effetto negativo sulla larghezza dei picchi di tutti gli analiti. Questo può essere spiegato intuiti- vamente considerando che un flusso maggiore ostacola l’allargamento del picco dovuto alla diffu- sione trasversale degli analiti. Da un punto di vista più rigoroso, si può osservare che la velocità della fase mobile influisce sulla larghezza di picco con due contributi opposti, secondo l’equazione di Van Deemter (4.10), in cui L è la lunghezza della colonna, u la velocità della fase mobile, ed A, B, C sono i tre termini che descrivono l’allargamento dei picchi. Un incremento del flusso genera una diminuzione di w grazie alla diminuzione del termine B/u, ma anche un aumento dovuto al termine Cu; tuttavia, la colonna cromatografica impiegata in queste misure appartiene alla famiglia delle colonne Poroshell, le quali sono caratterizzate da un termine C molto piccolo; dunque, l’aumento del terzo termine risulta trascurabile rispetto alla diminuzione del secondo, e l’effetto totale è una diminuzione di w. Il risultato ottenuto permette di concludere che l’utilizzo di un flusso di 0.4 mL/min nell’eluizione cromatografica al posto di 0.3 mL/min si riflette in modo positivo sulla riso- luzione dei picchi cromatografici di tutti gli analiti. Questo è di fondamentale importanza nell’analisi di campioni provenienti da matrici complesse come quelle alimentari, che molto spesso presentano specie incognite che vengono eluite assieme agli analiti e possono avere tempi di ritenzione simili.
𝐻 = 𝐿𝑤
2
16𝑡𝑅2 = 𝐴 +
𝐵
𝑢+ 𝐶𝑢 (4.10)