MiRNA, sistema immunitario e infezioni

I miRNA svolgono un ruolo fondamentale nella maturazione delle cellule della linea B, nell’induzione, nel funzionamento e nella stabilizzazione dei linfociti T regolatori, nella differenziazione delle cellule dendritiche e nella via di segnalazione dei recettori Toll-like dei macrofagi, sopprimendone la funzione prima che sia avvenuta l’effettiva attivazione, e potenziandone gli effetti una volta stimolati [99].

Nel modello animale murino è stato dimostrato come il deficit di Ago2, porta ad un blocco nella progressione maturativa e differenziazione delle cellule pro-B, con implicazioni a livello dei processi apoptotici e di produzione anticorpale. Il miRNA implicato in questa attività di regolazione genica è miR17 ~92, la cui assenza porta ad aumentata produzione della proteina regolatrice l’apoptosi e il passaggio dallo stadio pro-B a quello pre-B. L’induzione di una produzione ectopica di miRNA17~92, di contro, induce un aumento della sopravvivenza cellulare [100]. Anche il miR-181 svolge un ruolo regolatorio (positivo) nella differenziazione delle cellule B, e una sua produzione ectopica esita in un aumento dei CD19+ e in una riduzione del numero delle cellule T [101]. miR-150, invece, oltre alla modulazione della differenziazione e maturazione cellulare B, è importante anche per la risposta delle cellule mature B. Le cellule progenitrici della linea B presentano bassi livelli intracellulari di miR-150 ed una sua produzione aumentata ectopica risulta in un blocco maturativo sempre tra lo stadio pro- e pre-B. La specifica funzione di questo miRNA risiede nella sua capacità di bloccare il fattore di trascrizione c-Myb, che promuove il naturale percorso bio-cellulare della linea-B. Studi in ambito oncoematologico hanno dimostrato come Van der Berg [102] e Metzler [103] il miR155 viene iperespresso nei tumori della linea B. La mancanza di miR-155, invece, altera la capacità differenziativa dei linfociti B del centro germinativo e la produzione immunoglobulinica, limitando sia la maturazione dell’affinità che il class switching. A seguito della delezione di Dicer i linfociti precursori della linea T presenti nel timo, pro-T, doppio negativi, subiscono una riduzione del loro numero di circa 10 volte, pur mantenendo un regolare e fisiologico iter maturativo [104]. La delezione del gene Dicer in linee cellulari più mature dal punto di vista fenotipico ha mostrato una minore riduzione del numero di cellule allo stadio singolo positivo [104]. Il ruolo di Dicer nella proliferazione cellulare della linea T sembra essere ancora una volta correlato a miR-17~92 poiché è stato visto che l’espressione ectopica di questo miRNA era in grado di aumentare il numero sia di CD4+ che di CD8+. Un altro miRNA centrale timico, che ricopre un ruolo chiave nella differenziazione cellulare T, è miR-181. Questo miRNA è in grado aumentare l’efficienza della selezione positiva e negativa, potenziando

riducendone l’espressione. Queste fosfatasi sono coinvolte nel meccanismo di segnalazione intracellulare a seguito del legame fra il recettore della cellula T ed il suo ligando attenuando la trasduzione del segnale e rendendo quindi la cellula T meno responsiva [99]. Per quanto riguarda i miRNA nelle cellule T periferiche è da notare che la mancanza di Dicer, anche in questo conteso, si associ ad un induzione della polarizzazione Th1 senza un’effettiva stimolazione esterna. Oltre a ciò, la delezione di Dicer provoca un’alterazione sia dell’induzione dei Th17 che delle cellule T regolatorie mediata dal TGF-β. Un effetto simile a quello appena descritto, inducente una risposta Th2 dipendente, in assenza di stimoli polarizzanti, è stato descritto per la delezione di miR-155 [99]. In ultimo è da sottolineare che miR-101 è implicato nell’induzione post-trascrizionale del prodotto proteico del gene Icos. Quando le cellule T perdono la funzione di miR-101, la conseguente iperespressione di Icos produce in loro dei cambiamenti fenotipici importanti, tali da indurre le cellule all’autoimmunità. In merito a ciò, anche miR-155 gioca un ruolo chiave, infatti cellule T regolatorie con ridotti livelli intracellulari di tale miRNA hanno una ridotta capacità di risposta allo stimolo dato dall’Interleukina-2, necessario per la sopravvivenza e la crescita cellulare.

Per quanto riguarda l'interazione fra miRNA, risposta immunitaria innata e regolazione dell’infiammazione, i dati attualmente disponibili suggeriscono che 4 miRNA ( miR-223, miR-155, miR146 e miR-125) siano principalmente coinvolti. Il primo è un potente agente stimolatore della granulopoiesi in vitro [105] e una sua delezione specifica nei topi ha dimostrato un’iperfunzionalità neutrofilica con lesioni infiammatorie polmonari in risposta al contatto con endotossine. miR-125 ha come bersaglio il trascritto RNA del TNF-α, inducendone una repressione della sintesi a livello macrofagico. I livelli intracellulari di miRNA 125, la cui trascrizione è modulata dall'interazione dell'LPS batterico con il macrofago, modulano la risposta infiammatoria della cellula. miR- 155svolge un ruolo essenziale nella presentazione dell’antigene, infatti, una sua delezione porta ad una mancata attivazione delle cellule T per inadeguata presentazione dell’antigene. I TLR una volta attivati inducono un’aumentata trascrizione e produzione di miR-155 tramite la via dell’NFK-β e della kinasi Jun N-terminale [106]. Per quanto riguarda il miR-146a, la sua trascrizione e formazione viene indotta a partire dal contatto dell’LPS batterico con i recettori Toll-Like macrofagici, ma la sua funzione, paradossalmente risiede nel blocco dell’infiammazione, tramite la repressione della trascrizione dell’espressione di IRAK 1e TRAF 6, molecole utili nella via segnalazione intracellulare dei TLR. Tutto questo preverrebbe l’eccessiva infiammazione attenuando l’attivazione TLR-indotta.

1.12.1 Infezioni

Lo studio dell'espressione dei miRNA in corso di infezione è di estremo interesse non solo da un punto diagnostico, in quanto la variazione del loro profilo potrebbe essere utile per definire l'andamento dell'infezione, ma anche perchè l'agente infettivo può indurre la produzione di miRNA specifici da parte dell'ospite oppure può utilizzare miRNA dell'organismo per garantire il proprio ciclo biologico.

1.12.2 MiRNA e Mycobatteri

I dati disponibili dimostrano come i batteri modulando direttamente l'espressione dei miRNA umani riducano la capacità da parte dell'ospite di attivare i processi pro-apoptotici e pro- infiammatori, che potrebbero minare la sopravvivenza del germe nell'organismo.

Uno studio recente ha dimostrato come nei pazienti affetti da tubercolosi polmonare attiva i livelli sierici e nell’espettorato di miR-29a siano più alti che i controlli sani [107]. E' stato dimostrato come, dopo l'infezione da parte del Mycobacterium Avium, l'incremento dei livelli sierici di questo miRNA, e di let-7e si associno al blocco dell’apoptosi macrofagica. Nello specifico l’inibizione dell’apoptosi consegue all'inibizione della sintesi delle caspasi 3 e 7 [108]. Alcuni dati suggeriscono come vi sarebbe una differente espressione dei miRNA in funzione della loro virulenza del Mycobacterio. In vitro è stato dimostrato come in colture di macrofagi l'espressione di miR-155 e miR-125b vari a seconda del tipo di Mycobacterium (Tuberculosis vs M. smegmatis) con cui vengono co-incubati. Altri studi hanno dimostrato come in corso di infezione da Mycobacterium Leprae si abbia nei monociti un aumento dei livelli di miR-21 nei monociti. MiR- 21 sarebbe in grado di inibire l'espressione dei geni implicati nella difesa antimicrobica (in particolare le vie molecolari vitamina D dipendenti); infatti monociti non in grado di esprimere miR-21 si sono dimostrati in grado di controllare l’infezione. I dati ad oggi disponibili fanno ritenere che miR-29a, miR-155, miR-125b, miR-3179a and miR-147 potrebbero rappresentare dei potenziali biomarcatori per la diagnosi di tubercolosi, per le specifiche variazioni dei loro livelli osservati sia nel siero che nell’espettorato di soggetti malati [108].

1.12.3 MiRNA e Virus

le stesse tappe dei miRNA dell'ospite. Nel caso Herpes Virus di tipo 1 (HSV-1) è stato dimostrato come [109] durante la fase di latenza il virus esprima due differenti pri-miRNA, uno noto come LAT, e l’altro ancora non identificato, ma distinto dal primo. Da LAT vengono processati quattro differenti miRNA, ma di questi uno, il miR-H2-3p, induce una riduzione nell'espressione della proteina ICP0, fattore di attivazione della trascrizione implicato nella promozione della replicazione e nella riattivazione dalla fase di latenza. L’altro miRNA, codificato a partire dal secondo pri- miRNA non noto, è miR-H6, scoperto nei gangli trigeminali. Esso è capace di ridurre e controllare l’espressione della proteina ICP4 che è necessaria per l’espressione di molti geni virali durante l’infezione produttiva.

I miRNA sembrano coinvolti anche nella riattivazione del Citomegalovirus (CMV) che, durante la fase di latenza, esprime ben otto miRNA diversi, tra cui: miR-US25-1, miR-US25-2-5p e miR-UL112. Questi piccoli miRNA virali sono in grado di modulare l’espressione di 49 miRNA umani, coinvolti nella melanogenesi, nell’endocitosi, nelle vie molecolari della cancerogenesi e nella segnalazione molecolare di wnt [110].

Sono oggetto di studio anche le correlazioni fra miRNA (cellulari e virali) ed evoluzione di infezioni da parte di gamma-herpesvirus con potenziale oncogeno, quali il virus Epstein-Barr e l’Herpes virus umano 8 ( virus associato al Sarcoma di Kaposi). E' stato dimostrato come durante la fase di latenza la produzione di specifici miRNA virali riduce l’espressione di proteine dell’ospite e del virus stesse, con verosimile modulazione negativa del il sistema immunitario dell'ospite [111]. Virus difettivi per questo sistema molecolare hanno dimostrato di non essere capaci di poter effettuare lo switch tra ciclo litico e ciclo latente [111]. I miRNA codificati da EBV svolgono un ruolo importante nell’evasione al controllo della risposta immunitaria, attraverso una modulazione del gene CXCL-11, che codifica per la chemochina indotta dall’IFN-γ (attiva sui Linfociti T). I miRNA virali sono implicati anche nel controllo dell’apoptosi : KSHV codifica per miR-K12-5, -9, -3 e -10b, i quali sono in grado di reprimere l’espressione di BCLAF-1 (fattore associato a Bcl-2) una proteina pro-apoptotica. I miRNA codificati dai cluster BART di EBV sono in grado di reprimere la trascrizione di PUMA e Bim, due proteine antiapoptotiche appartenenti alla famiglia Bcl-2 [111]. KSHV inoltre è in grado di bloccare la sintesi di SMAD5, l’effettore a valle della via di segnalazione del TGF-β, potente fattore antiproliferativo. Un'altra sfera di influenza molecolare miRNA-mediata riguarda la riattivazione del ciclo litico, mediata da BART-6, cluster di miRNA trascritto dal DNA di EBV, e da miR-K12-5 per KSHV. Un ultimo aspetto degno di nota riguarda la regolazione dell’angiogenesi da parte di KSHV, momento patogenetico fondamentale nello sviluppo del Sarcoma di Kaposi. Ebbene, anche in questa fase dell’espressione molecolare della patologia KSHV-indotta sono implicati i miRNA virali, in particolare miR-K12-1, -K3-5, -K6-3 e –

K11 i quali bloccano la traduzione di THBS1, un potente inibitore dell’angiogenesi e della proliferazione cellulare [111].

MiRNA e HCV Il virus dell'epatite C è un RNA virus epatotropico appartenente alla famiglia dei Flaviviridae: il ciclo replicativo del virus comporta una stretta interazione tra complessi replicativi virali e strutture subcellulari dell'epatocita. In particolare, è stato dimostrato come sia critico per un'efficiente replicazione e propagazione virale l'interazione con il miR-122 [112]. Questo miRNA è epato-specifico, sovraepresso nel fegato e in grado di modulare il metabolismo lipidico e con un ruolo onco-soppressore. Nel corso dell'infezione da HCV l'interazione di miRNA- 122 con alcune porzioni altamente conservate della regione 5’ non codificante è essenziale per la stabilità e la propagazione dell’infezione. Sulla base di tali premesse è stato prodotto un oligonucleotide antisenso complementare al miR-122 (Miravirsen), che complessandosi con quest'ultimo ne blocca il legame con le regione 5NC di HCV. Il trattamento con questa molecola si è dimostrato in grado di indurre inibizione della replicazione virale dose dipendente senza l'induzione di effetti collaterali significativi. Appare quindi evidente come la capacità di modulare i livelli intracellulari dei miRNA potrebbe in futuro diventare un importante strategia terapeutica anche in altre condizioni patologiche [112].

Figura 7. Meccanismo d’azione del Miravirsen (immagine tratta da Harry L.A. et al., "Treatment of

MiRNA e HBV Le interazioni fra miRNA e HBV sono state studiate sia in modelli in

vitro, che in vivo: in colture di epatoma (HepG2 and Huh7) è stato dimostrato come la

trasfezione con miRNA-1 o la sovraespressione di miR372/373 siano in grado di indurre un incremento della replicazione ed trascrizione di geni virali, probabilmente non per un'azione diretta sul virus, ma su geni cellulari, probabilmente mediato dal Nuclear Factor I/B. In accordo con tali dati, in vivo è stata descritta una correlazione positiva fra livelli intraepatici di miR372/373 e viremia [113]. Sempre studi in vitro hanno dimostrato come il miR-141 inibitore del recettore nucleare PPAR-A svolgerebbe un effetto di blocco a livello trascrizionale inducendo un'inibizione della sintesi proteica virale [114]. Le interazioni fra miR-122 e HBV sono ancora oggetto di studio, ma alcuni dati preliminari suggeriscono che, a differenza di quanto avviene nell'infezione da HCV, miRNA-122 abbia un effetto inibitorio sulla replicazione di HBV. L'espressione di miR-122 nei pazienti con infezione da HBV è significativamente ridotta rispetto ai controlli sani e i livelli intraepatici di miR-122 dimostrerebbero una correlazione negativa con i livelli intraepatici di replicazione virale e necroinfiammazione. Ancora dati in vitro indicherebbero che l'overespressione di miR-122 avrebbe un effetto inibitorio sulla replicazione virale e l'effetto potrebbe essere mediato dalla ciclina G(1), che a sua volta si lega a P53. Sono stati ipotizzati anche altri meccanismi coinvolgenti HBx o un diretto legame del miR-122 con il pregenoma in grado di impedire il riconoscimento della polimerasi virale [115] [116] [117].

Di particolare interesse, ma ancora in fase preliminare, è lo studio delle alterazione di espressione del profilo dei miRNA epatocitari in corso di epatocarcinoma (una frequente complicanza della cirrosi da HBV): i dati preliminari suggeriscono come numerosi miRNA (miR-152, 155 e la sequenza policistronica miR 17-92) dimostrino un'espressione abnorme nelle cellule neoplastiche rispetto alle normali. Rimane tuttavia da comprendere in quale misura tali alterazioni siano la conseguenza o piuttosto un momento patogenetico del processo oncogenetico.

Lo studio dell'espressione cellulare dei miRNA si sta dimostrando uno strumento utile per una migliore comprensione dell'interazioni fra HBV ed epatocita e potrà favorire una migliore comprensione della dinamica dei processi intracellulari responsabili dell'instaurarsi e persistere dell'infezione. Tuttavia, la recente dimostrazione che le particelle di HBsAg veicolano miRNA epatospecifici [118] [119] ha aperto una nuova via di studio, rendendo possibile, nei portatori di infezione da HBV, caratterizzare dinamicamente le variazione dei miRNA epatospecifici in modo non invasivo. La caratterizzazione dei miRNA circolanti (nelle particelle HBsAg o

dell'infezione e malattia da HBV, ma sopratutto potrebbe costituire un nuovo approccio diagnostico utile a migliorare la gestione del portatore di infezione cronica da HBV.