3.1 Popolazione oggetto dello studio
Sono stati studiati i campioni sierici (142) di 61 portatori cronici di infezione da HBV (maschi/femmine 40/21, età mediana 50 anni, 21-79), 57 dei quali infettati dal genotipo D di HBV e 4 dal genotipo A. Ai fini di garantire una precisa classificazione [124] i portatori che presentavano al momento della prima osservazione bassi livelli di HBV-DNA (<2000 IU/mL) e valori di transaminasi nei limiti di norma sono stati seguiti per almeno un anno con controlli ematici mensili, dopodiché ogni 3/6 mesi come tutti gli altri portatori di HBV. I soggetti seguiti sono stati sottoposti a follow-up (mediano di 34 mesi, 18-144 mesi) presso l'Unità di Epatologia dell'Azienda Ospedaliero-Universitaria Pisana. Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale Universitario di Pisa. Tutti i pazienti hanno firmato un consenso informato.
I portatori di HBsAg sono stati classificati in accordo con i loro profili biochimici [124] e virali: a) 5 pazienti HBeAg positivi [(1 immuno tollerante, IT (HBV-DNA >8.3 Log10 IU/mL,
HBsAg >4.39 Log10 IU/mL, ALT nella norma) e 4 con epatite cronica B]; b) 16 portatori inattivi di
HBsAg, IC (HBV-DNA persistentemente <2000 IU/mL e ALT normali); c) 36 pazienti HBeAg negativi/anti-HBe postivi con epatite cronica B (CHB) [HBV-DNA >2000 IU/mL con evidenza di malattia di fegato HBV indotta (all’istologia e/o all’elastometria e agli ultrasuoni); d) 4 pazienti HBeAg negativi/anti-HBe positivi/anti-HDV positivi, portatori cronici con epatite cronica D (IgM anti-HD e HDV-RNA positivi).
Trentadue pazienti HBeAg negativi con epatite cronica B (CHB) sono stati sottoposti a trattamento antivirale: 21 sono stati trattati con Peg-IFN 180 ug/settimana +/- analoghi nucleos(t)idici (NUCs) per 12-36 mesi e 11 con analoghi nucleos(t)idici NUCs per un periodo mediano di 60 mesi (intervallo 36-114 mesi); in 2 pazienti, che hanno eliminato l'HBsAg, i NUCS sono stati sospesi a 36 e 112 mesi rispettivamente. Nei pazienti trattati con Peg-IFN, la riduzione dei livelli di HBV-DNA al di sotto di 2000 IU/mLal termine della terapia (EOT) corrispondeva al raggiungimento della risposta di fine trattamento (18 casi); la persistenza di livelli di HBV-DNA <2000 IU/mL, in controlli ogni 3 mesi, per almeno 12 mesi dopo la fine della terapia, definivano la risposta virologica sostenuta (SVR, 13 casi); la ricorrenza di una florida replicazione virale dopo una prima risposta di fine del trattamento identificava i pazienti relapser (REL, 5 casi); la non
trattamento (EOT). I sieri sono stati valutati prima della terapia antivirale (baseline, BL), dopo 12 e 24 settimane di trattamento, alla fine del trattamento (EOT) e a 24 settimane di follow-up dopo la terapia (post-T-FU) in 14 pazienti trattati con Peg-IFN; al baseline BL e a 24 settimane dopo la sospensione degli analoghi nucleos(t)idici NUCs in 2 pazienti che hanno sospeso il trattamento.
I profili dei miRNA sono stati ottenuti dal siero intero in tutti i campioni; inoltre, per identificare miRNA epato-specifici, l'analisi è stata effettuata anche negli immunoprecipitati (IP) di particelle HBsAg in 32 sieri [6 da pazienti portatori inattivi IC e 26 da 13 pazienti con epatite cronica HBeAg negativa (CHB), 5 da pazienti con risposta virologica sostenuta (SVR), 5 da pazienti relapser (REL) e 3 da pazienti non responder (NR) al Peg-IFN] utilizzando la metodica
ready-to-use microRNA PCR panels I and II v2, contenente 742 saggi di miRNA [135].
3.2 Test sierologici
La determinazione di HBsAg, anti-HBs, anti-HBc, IgM anti-HBc, HBeAg e anti-HBe, anti- HCV, anti-HDV e anti-HIV è stata effettuata mediante gli immunoassay disponibili a livello commerciale (Abbott Laboratories, N. Chicago, IL, USA). I livelli sierici di HBV-DNA sono stati quantificati con il sistema COBAS TaqMan, con sensibilità di 6 IU/mL (range dinamico 6-1.70x 108 IU/mL), Roche Diagnostic Systems Inc, Mannheim, Germany. La definizione del genotipo di HBV è stata realizzata tramite il sequenziamento diretto della regione HBs codificante per l’antigene small. I livelli sierici delle ALT sono stati testati con le metodiche biochimiche di routine (valori normali: <45U/L e <33U/L per maschi e femmine rispettivamente). Le particelle circolanti HBsAg sono state ottenute grazie all’immunoprecipitazione come precedentemente riportato [85].
3.3 Isolamento dell'RNA, sintesi del cDNA e RT-q-PCR
3.3.1 Purificazione delle particelle HBsAg circolanti nel siero
Le particelle HBsAg sono state purificate dal siero mediante immunoprecipitazione utilizzando biglie magnetiche attivate con anticorpi IgG antiHBs (Diapro). In particolare 67 µL di biglie magnetiche attivate sono state incubate per 60 min a 37 °C con 200 µL di siero. Dopo l’incubazione sono stati effettuati due lavaggi con tampone contenente 10mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,1% BSA, 0,15 M NaCl, 1mM EDTA e 0,1 % NaN3. Al termine dei lavaggi il pellet è stato risospeso in 200 µL di tampone (PBS)
3.3.2 Estrazione dell'RNA, retrotrascrizione e real-time PCR
L’RNA totale è stato estratto da 200 µL di siero o dalle particelle HBsAg utilizzando il kit miRNeasyTM (Qiagen) come descritto [135]. L’RNA (16 µL) è stato retro-trascritto e analizzato su pannelli di PCR quantitativa in un volume finale di 80 µL utilizzando il kit miRCURY-LNA™ Universal-RT-cDNA-Synthesis e il kit RT-miRNA-PCR (Exiqon-A/S). Il cDNA è stato diluito 1:50 e amplificato mediante PCR quantitativa in un volume finale di 10 µL. Per ogni campione sono stati quantizzati 739-miRNA mediante il pannello Ready-to-use microRNA-PCR panels I/II. L’amplificazione è stata effettuata utilizzando il LightCycler®480-System (Roche-Applied- Science) in piastre da 384 pozzetti.
3.4 Elaborazione dei dati ed analisi statistica
Le curve di amplificazione dei miRNA sono state analizzate utilizzando il software Roche LC sia per la quantificazione dei cicli (Cq), attraverso il metodo del massimo della seconda derivata, secondo le raccomandazioni delle linee guida MIQE (“Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments”) [135], sia per l’analisi delle curve di melting. L’efficienza dell’amplificazione è stata calcolata utilizzando l’algoritmo LinREg con criteri tra 0.8- 1.1 [137] [138]. Tutti i test sono stati controllati per curve di melting distinte, ed è stato inoltre verificato che il Tm fosse all’interno dei range specifici di ogni test. Inoltre per poter essere incluso nelle successive analisi, il valore ottenuto per ogni miRNA doveva avere un Cq <37, con una differenza di amplificazione rispetto al controllo negativo >5 Cq per i campioni di siero e >3 Cq per i campioni di IP HBsAg, in considerazione del più basso livello di segnale in questi ultimi. Pertanto i dati che non hanno superato i suddetti criteri sono stati omessi da qualunque ulteriore analisi. Il software Normfinder è stato utilizzato per identificare i migliori candidati per la normalizzazione dei valori; in questo studio il miglior “normalizzatore” è risultato il valore medio complessivo (Global Mean) di tutti i test relativi ai miRNA espressi in tutti i campioni testati [139] [140]. Con tale approccio abbiamo normalizzato tutti i valori Cq dei miRNA, ottenendo per ciascun miRNA il valore ΔCq. Nelle analisi di confronto fra gruppi sono stati presi in considerazione i miRNA che risultavano essere espressi in tutti i campioni dei gruppi a più bassa numerosità. Dal momento che abbiamo sottratto il valore del singolo miRNA dal valore medio di tutti i miRNA considerati nel campione (Global Mean), più alto è il valore, maggiore è l’espressione dei microRNA nei risultati riportati. Nel confronto di due gruppi, se sottraiamo il valore medio di un miRNA nel gruppo di controllo (Ctrl) dal valore medio osservato nel gruppo in esame (affected), e otteniamo un valore positivo, ad esempio Cq=1, l’espressione di quel miRNA sarà maggiore nel gruppo in esame ed
in particolare, in base alla formula 2(ΔCq(affected)-ΔCq(Ctrl)), l’espressione sarà in media 2(1)= 2 volte maggiore. Nelle analisi di confronto fra gruppi sono stati presi in considerazione i miRNA che risultavano essere espressi in tutti i campioni dei gruppi a più bassa numerosità.
Le correlazioni tra il profilo dei miRNA, il MiR-B-Index e le loro variazioni nel tempo nei differenti gruppi di portatori di HBsAg sono stati analizzati con il test di Spearman, il Mann- Whitney U-Test, il Kruskal-Wallis test, il test t di Student, l’analisi della varianza (ANOVA) e l’ANOVA per misure ripetute, ove appropriati. Quando i valori per gruppo non raggiungevano un numero sufficiente per l’ANOVA o per gli altri test statistici abbiamo utilizzato il fold-change-
method per valutare una maggiore o minore espressione usando come soglia una differenza pari a 2
indipendentemente associate con il MiR-B-Index e con la sua Δ-variazione. La performance diagnostica del MiR-B-Index nell’identificazione dei portatori inattivi (IC) rispetto ai pazienti affetti da epatite cronica B (CHB) è stata valutata attraverso l’analisi della curva ROC; la selezione del valore soglia è stata effettuata con l’obbiettivo di massimizzare la sensibilità (identificazione del 100% dei portatori inattivi).
L’elaborazione dei dati e l’analisi statistica sono state effettuate utilizzando i seguenti software: Microsoft Excel, GraphPad Prism 6.03, TIGR’s Multiple experiment Viewer (MEV) versione 4.8 [141] [142] e SPSS versione 20.0 (IBM Corp., Armonk, NY). La significatività statistica è stata definita come p<0.05, dopo correzione di Bonferroni ove richiesta.