La lignina è un polimero amorfo aromatico e altamente complesso, esso è costituito da unità di fenilpropano, può essere considerata una sostanza incrostante le diverse strutture cellulari e intercellulari .(Hon and Shirashi 2001). Al contrario delle emicellulose e della cellulosa la lignina non presenta il ripetersi di singole unità, ma consiste in una complessa organizzazione di unità fenoliche. Tridimensionalmente il polimero è costituito da legami C-O-C e C-C. Un‟importante caratteristica di questo naturale polimero è la presenza di differenti gruppi funzionali come i gruppi fenolici, metossilici, alcol alifatici, aldeidi, chetoni, ed eteri (Zakis, 1994). La lignina può essere classificata in molti modi ma generalmente essa è suddivisa in relazione alla struttura dei suoi costituenti(Sjöström 1981).
I precursori per la biosintesi della lignina sono l‟alcol p-cumarilico, l‟alcol coniferilico e l‟alcol sinapilico.
L‟alcol p-cumarilico è precursore minore per entrambe le tipologie di legno: conifere e latifoglie; l‟alcol coniferilico è il principale costituente della lignina delle conifere.
L‟alcol sinapilico e l‟alcol coniferilico invece sono i costituenti principali della lignina delle angiosperme.(Alder 1977).-
Fig 1: Struttura chimica dei precursori della lignina: (1) alcol p-coumarilico (2) alcol coniferilico e (3) Alcol sinapilico (da Rowell R. M. 2005).
Il legno di conifere ha un contenuto di metossili del 15-16%, quello di latifoglie raggiunge il 21%. (RCowell R. M. 2005). La lignina delle conifere è un prodotto della polimerizzazione dell‟alcol coniferilico e la lignina appartenente a questo gruppo è chiamata lignina guaiacilica. La lignina delle latifoglie è costituita principalmente da siringolo-guaiacolo, perché, come è stato detto in precedenza, essa è un copolimero dell‟alcol sinapilico e coniferilico (Rowell et al., 1980). Il rapporto tra questi due precursori varia da specie a specie, e assume valori che vanno da 4:1 a 1:2 (Sarkanen and Ludwig 1971).
Dunque la struttura, il contenuto percentuale, la localizzazione della lignina cambiano da specie a specie.
Il contenuto di lignina delle latifoglie si aggira intorno al 15-25%, mentre quello delle conifere è più alto, 25-35%. (Timell, 1967; Pettersen, R.C 1984, le tabella 7.1 e 7.2 mostrano il contenuto di lignina di conifere e latifoglie di diverse specie europee e americane (Rowell R.M., 2005, e Pettersen, R.C 1984).
Tabella 6.1 : contenuto percentuale di lignina nelle latifoglie: *= Pettersen 1984, **= Vidrich et al., 1991
Specie Contenuto di Lignina Specie Contenuto di LigninaContenuto di Lignina
Acer macrophyllum 25.0*, Liquidambar styraciflua 21.0*, 24.0*, 22.4*21.0*, 24.0*, 22.4*
Acer negundo 30.0* Lyriodendron tulipifera 20.0*, 30.0*20.0*, 30.0*
Acer rubrum 21.0*,24.0*, 23.0* Ostrya carpinifolia 20.57**20.57**
Acer saccharinum 21.0* Platanus occidentalis 23.0*, 25.3*23.0*, 25.3*
Acer saccharum 23.0* Populus alba 16.0*16.0*
Aesculus octandra 30.0* Populus deltoides 23.0*, 24.0*, 25.9*23.0*, 24.0*, 25.9*
Alnus glutinosa 22.38* Populus tremoides 19.0*19.0*
Alnus rubra 24.0* Populus trichocarpa 21.0*21.0*
Arbutus menziesii 21* Prunus serotina 21.0*21.0*
Betula nigra 22.0* Quercus alba 27.0*, 24.6*27.0*, 24.6*
Betula papiryfera 18.0*,19.0* Quercus cerris 19.93**19.93**
Castenea sativa 19.84** Quercus coccinea aa
Carya glabra 24.0*,23.0* Quercus douglasii 27.0*27.0*
Carya ovata 21.0* Quercus falcata 25.0*,24.0*, 23.6*25.0*,24.0*, 23.6*
Carya pallida 23.0* Quercus kellogii 26.0*26.0*
Carya tomentosa 21.0*,23.6* Quercus lobata 19.0*19.0*
Carya laevigata 21.0* Quercus lyrata 28.0*28.0*
Eucalyptus gigantea 22.0* Quercus marylandica 26.0*, 30.1*26.0*, 30.1*
Fagus Grandifolia 22.0*, 30.9* Quercus rubra 24.0*, 20.2*24.0*, 20.2*
Fraxinus americana 26.0*, 24.8* Quercus velutina 24.0*, 25.3*24.0*, 25.3*
Fraxinus ornus 19.13** Salix nigra 21.0*21.0*
Fraxinus pennsylvanica 26.0* Tilia heterophylla 20.0*20.0*
Gleditzia triachantos 21.0* Ulmus americana 22.0*,24.0*, 27.8*22.0*,24.0*, 27.8*
Laguncularia racemosa 23.0* Ulmus crassifolia 27.0*27.0*
Tabella 6.2 : contenuto percentuale di lignina nelle Conifere: *= Pettersen (1984)
Specie Klason Lignin Specie Klason Lignin
Abies amabilis 29.0 Pinus contorta 26.0
Abies balsamea 29.0, 29.0, Pinus echinata 28.0
Abies concolor 28.0 Pinus elliottii 27.0
Abies lasiocarpa 29.0 Pinus monticola 25.0
Abies procera 29.0 Pinus palustris 30.0
Chamaecyparis thyoides 33.0 Pinus ponderosa 26.0
Ginkgo biloba 33.0 Pinus radiata 27.0
Juniperus communis 31.0 Pinus resinosa 26.0, 29.0
Juniperus deppeana 34.0 Pinus sabiniana 27.0
Larix decidua 26.0 Pinus strobus 27.0, 29.0
Larix larcina 26.0, 29.0 Pinus sylvestris 28.0, 27.0
Larix occidentalis 27.0 Pinus taeda 27.0, 27.0
Libocedrus decurrens 34.0 Pseudotsuga menziesii 27.0, 32.0
Picea engelmanni 28.0 Sequoia sempervirens 33.0
Picea abies 29.0 Taxodium disticum 33.0
Picea glauca 29.0,27.0 Thuja occidentalis 30.0, 31.0
Picea mariana 27.0, 30.0 Thuja plicata 32.0
Picea sitchensis 27.0 Tsuga Canadensis 33.0, 33
Pinus attenuata 27.0 Tsuga Heterophylla 29.0
Pinus banksiana 27.0, 29.0 Tsuga mertensiana 27.0
LOCALIZZAZIONE
Numerosi sono i metodi per studiare la distribuzione della lignina (3- Mule, 1900; Hoffmann and Parameswaran 1976; Kishi, Harada, Saiki, 1982; Crocker, 1921; Hepler, Fosket, Newcomb, 1970; Parham, 1974; Davis and Shiraishi 2000,Thomas, Gratzl, 1979; Meier, 1955; Parham and Coté 1971).
La lignina è distribuita nella parete secondaria delle cellule, con la più alta concentrazione nella lamella mediana.
Tuttavia considerando la differenza di volume tra lamella mediana e parete secondaria si può dire che il 70 % della lignina è localizzata nella parete cellulare (Rowell R.M., 2005).
Sebbene la maggior parte dei metodi sono utili per identificare la localizzazione della lignina nelle diverse tipologie di cellule xilematiche e nelle diverse parti di esse, tuttavia tali metodi danno poche informazioni quantitative. Il microscopio a raggi ultravioletti (UV) con sezioni sottili di legno ha dato buoni risultati (Lange, 1954) per una valutazione quantitativa della lignina nei tessuti; tale metodo stima che la concentrazione in peso della lignina è del 16 e 73% rispettivamente per la parete secondaria e i componenti della lamella mediana per le tracheidi di abete rosso (Norway spruce).
Tali risultati sono in eccellente accordo con quelli di Bailey (1936) che ha trovato pari al 71% il contenuto in peso della lignina nella lamella mediana delle tracheidi di abete di Douglass. Precedentemente a questo autore Ritter (1925) ha concluso che approssimativamente il 75% della lignina nel legno è localizzata nella lamella mediana e che il 25 % è invece distribuito nella S2. Successivamente Goring ed altri studiosi (B.J. Fergus,A.R. Procter, J.A.N. Scott and D.A.I. Goring, 1969; J.A.N. Scott, A.R. Procter, B.J. Fergus and D.A.I. Goring, 1969; J.A.N. Scott, and D.A.I. Goring, 1970; .A.N. Scott, and D.A.I. Goring, 1974; J.R. Wood and D.A.I. Goring, 1974; B.J. Fergus and D.A.I. Goring, 1970; B.J. Fergus and D.A.I. Goring, 1970; J.R. Wood and D.A.I. Goring, 1971; Y. Musha D.A.I. Goring, 1975) hanno perfezionato il metodo UV utilizzando sezioni estremamente sottili (0,5 μm), ed hanno concluso che i risultati di Bailey e Lange erano corretti. Essi hanno concluso in accordo con altri autori (G.P. Berlin e R.E.Mark 1965) che la zona della lamella mediana può contenere circa il 40% della lignina totale nel legno a causa del ridotto volume.
Inoltre tali autori hanno osservato come la lignina si distribuisce nelle diverse cellule xilematiche. Goring e Yang (1978-1980) hanno riscontrato che la parete secondaria delle cellule delle conifere contiene il doppio di molti gruppi funzionali rispetto alla lamella mediana.
CONIFERE
Nelle conifere è emerso che la concentrazione della lignina della Parete S2 è considerevolmente più bassa rispetto a quella della lamella mediana, sebbene quest‟ultima presenti un contenuto percentuale maggiore.
Tab, 6.3: Distribuzione della lignina nelle tracheidi di Picea mariana determinata mediante microscopia a UV (da Fergus B. J. et al., 1969).
La tabella 6.3 mostra tali risultati relativamente alla Picea mariana Mill., ( B B.J. Fergus, A.R. Procter, J.A.N. Scott and D.A.I. Goring, 1969); analoghi risultati sono stati ottenuti per la
Pseudotzuga menziesii Mirb. (Wood and D.A.I. Goring, 1971), (tab 6.4).
Tab 6.4: la distribuzione della lignina nel legno di abete di Douglass determinata attraverso il microscopio a UV(da Wood and Goring 1971)
Studi un po‟ più recenti hanno messo in evidenza le differenze all‟interno della parete cellulare (S.Saka and R.J. Thomas, 1982): la concentrazione della lignina nello strato S2 (di Pinus taeda L.) è più basso rispetto a ciascuno dei due rimanenti livelli S1 ed S3, sebbene in quantità ridotte. (Tab.6.5). Analoghi risultati sono emersi in altri studi (K. Fukazawa and H. Imagawa, 1981).
Tab.6.5: Distribuzione della lignina nelle tracheidi di Pinus taeda determinata mediante brominazione con SEM-EDXA (da Saka S. and Thomas R. J. 1982)..
LATIFOGLIE
La lignina delle latifoglie è costituita principalmente di unità di guaiacolo e siringolol, e il loro rapporto sembra essere diverso nelle varie strutture anatomiche del legno.(J. Fergus and D.A.I. Goring, 1970; B.J. Fergus and D.A.I. Goring, 1970). Negli anni „80 Saka et al., (1988 a; 1988 b) hanno sviluppato un nuovo metodo per la determinazione della proporzione tra guaiacolo e siringolo combinando il metodo del microscopio a UV con la brominazione –EDXA(UV-EDXA). Dallo studio è emerso che la parete secondaria delle fibre contiene principalmente residui di
siringolo, mentre la parete secondaria dei vasi contiene maggiormente unità di guaiacolo. I raggi parenchimatici contengono in egual misura unità di guaiacolo e siringolo: dunque il maggior apporto di unità di siringolo è contenuto nella S2 delle fibre.
Molti autori confermano che le unità di base della lignina variano nelle differenti parti del legno (K.E. Wolter, J.M. Harkin, T. K. Kirk, 1974; T. K. Kirk, H.-m. Chang, and L.F.Lorenz , 1975). Terashima et al., (1986) hanno osservato che la lignificazione della parete cellulare dei vasi, degli angoli delle cellule e dei componenti della lamella mediana avviene ad opera della deposizione di unità di guaiacolo, mentre per le fibre ad opera di unità di siringolo e guaiacolo.
Recenti studi (Saka and D.A.I. Goring, 1988, K. Takabe, S. Mijauchi, R. Tsunoda, and K.Fukazawa 1992; J.Wu, K. Fukazawa, and J. Ohotani, 1992; Y. Watanabe and K. Fukazawa,1993) hanno dimostrato che all‟interno della parete cellulare delle fibre di pioppo bianco la lignina non presenta sostanziali differenze nella sua distribuzione tra le diverse pareti, S1,S2,S3.
Anche all‟interno dei vasi si osserva la medesima distribuzione, tuttavia la concentrazione nei vasi è circa 1,9 volte maggiore rispetto a quella delle fibre, che a loro volta mostrano un concentrazione maggiore rispetto a quella delle cellule parenchimatiche.
Dallo studio è anche emerso che gli angoli della lamella mediana e con le fibre e i vasi hanno la maggiore concentrazione di lignina tab. (Tab. 6.6).
È interessante notare che la concentrazione di lignina nella lamella mediana delle latifoglie è più bassa rispetto a quella delle conifere (Saka and D.A.I. Goring, 1988, B B.J. Fergus,A.R. Procter, J.A.N. Scott and D.A.I. Goring, 1969).
Tabella 6.6 distribuzione della lignina in Fagus grandifolia (da Saka S. and Thomas R. J. 1982).
Le cellule dei raggi parenchimatici contengono più lignina delle tracheidi (Hoffmann and Timell, 1972; Harada and Wardrop, 1960; Perilia 1961; Perilia and Heitto, 1959), Cfr Tab 6.7.
Tabella 6.7: Composizione chimica dei raggi parenchimatici e delle tracheidi nel legno di Pinus resinosa (da Hoffmann G. C. and Timell T.E., 1972)
NELLA CORTECCIA
I componenti elementari e i gruppi funzionali contenuti nella lignina della corteccia non differiscono in maniera sostanziale dalla quelli della lignina del legno della stessa specie (1- Sarkanen and Hergewrt1971, Hemingway 1981), gli studi hanno dimostrato che vi è meno lignina nella corteccia interna rispetto a quella esterna.
Il rapporto di gruppi OCH3 nella corteccia di pioppo è più basso nella corteccia rispetto a quello
riscontrato nel legno della stessa specie, mentre si osserva un più alto rapporto di gruppi fenolici OH in OCH3 (Clermont 1970). Ci sono più unità di guaiacolo nella corteccia delle piante decidue
e più unità di p-hidroxilfenile nelle conifere rispetto alla lignina del legno delle stesse specie (Andersson et al 1973). Non vi sono tuttavia differenze strutturali tra la lignina della corteccia e quella del legno della medesima specie.
LEGNO GIOVANILE -. LEGNO TARDIVO
Il legno giovanile ha meno cellulosa e maggior quantità di lignina e emicellulose rispetto al legno maturo (Rowell R. M. 2005). La lignina diminuisce molto rapidamente al maturare delle cellule. Il legno tardivo presenta maggiori quantità di lignina in generale rispetto al legno primaverile nelle conifere (Tab 7.4) (J.R. Wood and D.A.I. Goring, 1971).
LEGNO DI REAZIONE
Il contenuto di lignina varia in relazione alla presenza del legno di reazione. Il legno di compressione presenta un quantitativo di lignina superiore a quello del legno sano (Rowell R. M. 2005, Panshin and de Zeeuw 1980, Timell 1982). La cellulosa nel legno di compressione presenta un minore grado di cristallizzazione nello strato s2 e pertanto in esso aumenta la concentrazione di lignina paragonato al legno sano, come si evince in tab 6.8 (Timell, 1982)
Tabella 6.8: Composizione chimica media della lignina nel legno di reazione e nel legno normale (Timell, 1982; Schwerin, 1958).
Conifere Legno normale Legno di compressione
lignina 30.0 39.0
Latifoglie Legno normale Legno di tensione
lignina 29.5 13.8
Nella parete cellulare il 40% di lignina è localizzato nella zona esterna del S2 e il restante 40% è distribuito uniformemente nella restante parte dello strato S2. (Panshin and de Zeeuw 1980).
La tabella 7.8 mostra la variabilità della lignina nel legno di tensione, essa è normalmente più bassa rispetto al legno sano(Schwerin 1958).
La maggiore quantità di cellulosa cristallizzata nello stato gelatinoso G e con angolo delle microfibrille di soli 5% riduce fortemente il quantitativo di lignina ed emicellulose presenti.
Tabella 6.8 (Schwerin 1958).
Sebbene sia stato dimostrato che all‟aumentare del rapporto di crescita dovrebbe corrispondere un aumento del quantitativo totale di lignina nel legno (Helander 1933; Dinwoodie 1961; Hermann et al., 1998; Mäkinen et al., 2002a, 2002b, Lundgreen 2004; Jaakkola eta al., 2005), recenti studi hanno dimostrato che le fertilizzazioni e i diradamenti non influiscono in maniera significativa sui livelli di lignina delle tracheidi di abete rosso di Norvegia.(Jaakkola et al., 2007).
ESTRAZIONE
Vi sono differenti modi per estrarre la lignina si citano di seguito alcuni esempi.
Klason Lignina
Ottenuta dall‟idrolizzazione dei polisaccaridi con acido solforico al 72%.
Lignina enzimatica: ottenuta attraverso la rimozione dei polisacaridi per via enzimatica.
Milled Lignina (MWL)
Björkman Lignina: ottenuta attraverso solventi organici (Björkman 1956-1957).
Il presente studio è finalizzato ad analizzare e caratterizzare la lignina di castagno (Castanea sativa Mill.) di provenienza laziale.
Lo studio ha come obbiettivo principale quello di misurare il quantitativo totale di lignina ed analizzare la sua ultrastruttura: sono stati studiati i diversi composti gauaiaciici e siringilici che costituiscono il polimero. Come obbiettivo specifico lo studio si propone di analizzare come varia la struttura della lignina nei diversi siti di indagine e tra piante cipollate e piante sane; infine è stata analizzata la variabilità tra 2 classi cronologiche: 6-10 anni e 11-15 anni per mettere in evidenza eventuali variazioni qualitative del polimero col procedere dell‟età.
MATERIALI E METODI
Lo studio del quantitativo di lignina è stato effettuato su 4 campioni di castagno provenienti da 3 siti differenti del territorio laziale: 2 dai Monti Cimini, 1 dai Monti Sabatini ed 1 dai Monti Lepini.
Sono stati selezionati i campioni legnosi provenienti dai provini usati per la prova a flessione statica: ovvero i provini aventi sezione 2X2 cm e lunghi 24-30 cm.
Successivamente con l‟ausilio di una pialla manuale i primi cm di ogni singolo provino sono stati ridotti in trucioli dello spessore di qualche decimo di mm. Successivamente tale materiale è stato ulteriormente sminuzzato mediante un molino elettrico (Fig.2 A) per ottenere una polvere finissima (con diametro di qualche decina di μm). Per ciascuno dei 4 campioni dunque è stato ottenuto un quantitativo di circa 60 g di polvere di legno.
Prima di procedere all‟estrazione della lignina il legno è stato epurato degli estrattivi: inizialmente sono state estratte tutte le sostanze solubili in acetone, mediante l‟utilizzo del Soxlet per solidi, la procedura prevede una serie di 24-25 cicli.
Successivamente sono stati estratti i tannini solubili in acqua. Un campione legnoso è stato immerso in un volume di acqua 150 volte superiore e riscaldato a 100°C per 1 h, con l‟accorgimento di tenere tappato il contenitore per evitare l‟evaporazione dell‟acqua.
Il materiale ottenuto epurato di gran parte degli estrattivi con peso molecolare maggiore è stato sottoposto ad una serie di analisi per l‟estrazione della lignina.
Il quantitativo totale di lignina è stato ottenuto attraverso il metodo TAPPI (Technical Association of Pulp and Paper Industry) n 222 (per la lignina acido-solubile) e Metodo TAPPI n.250 (per la lignina acido- insolubile: Lignina Klason) e che fornisce i valori di lignina solubile ed insolubile all‟interno del legno.
Si è operato come segue:
a) Idrolisi con H2SO4
200mg di materiale lignocellulosico finemente tritato e seccato in stufa (a 105°C per una notte) (P1), vengono messi in provettoni di vetro con tappo a vite con l‟aggiunta di 2 ml di H2SO4 al
72% (mescolando con una bacchetta di vetro) e lasciati in un termostato a 30°C per 1h.
Successivamente si aggiungono 56 ml di H2O distillata, si agita, si pulisce la bacchetta di vetro,
e si mette in stufa a 105°C per 4 ore.
Il materiale viene quindi filtrato su imbuti Buchner con filtri in lana di vetro (Watman GF/F), lavato con H2O distillata ed il volume del liquido filtrato portato a 200ml, sempre con H2O
distillata. Il residuo solido rimasto sul filtro viene messo ad essiccare in stufa a 105°C per una notte.
b) Determinazione del contenuto di lignina:
Lignina Acido Insolubile: si pesa il residuo solido essiccato e si ottiene (P2)
Calcolo: Lignina Insolubile (in %)= P2/P1X100
Lignina Acido Solubile: si diluisce una parte dei 200ml di filtrato con H2O distillata
(1ml di filtrato + 5 ml H2O) e si legge l’assorbanza a 205 nm.
Calcolo: Lignina Solubile (in %)= A 205/110 x (6 X100/ 1000)x 200/P1
Dove 110= Coeff. Di estinzione % medio 6=rappresenta la diluizione effettuata (1+5) 200= volume totale (espresso in millilitri) P1= peso iniziale (espresso in grammi)
Nel nostro caso, con P1= 0.2g si ha=
A 205/110 x (6 X100/ 1000) x 200/0.2 = A 205/110 x (0.6) X 1000 =
A 205/110 x (600) = A 205 x5.45
LIGNINA TOTALE %=
LIGNINA INSOLUBILE % + LIGNINA SOLUBILE % ANALISI STRUTTURALE DELLA LIGNINA
Indagini successive hanno invece riguardato la struttura specifica della lignina all‟interno dei campioni analizzati attraverso la tecnica della pirolisi accoppiata ad un sistema gas cromatografo- spettrometro di massa (Py-GC/MS). Con questa tecnica è possibile analizzare macromolecole organiche e di riconoscerle mediante il loro caratteristico pirogramma.
Per questa indagine sono stati analizzati 28 campioni legnosi.
Fig 2 Fasi di lavorazione per l‟estrazione della lignina: A, riduzione in polvere dei campioni legnosi mediante molino; B, peso del quantitativo di polvere da utilizzare mediante bilancia di precisione, C, soluzione di acido solforico per l‟estrazione della lignina a temperatura controllata, E, filtrazione per separare la parte solubile della lignina da quella insolubile,F lignina solubile e lignina insolubile (nei crogioli), pronta per la misurazione.
Lo studio è stato impostato in modo da mettere in evidenza la variabilità strutturale della lignina (contenuto di unità guaiaciliche e siringiliche – G:S) nelle piante di castagno del territorio della Regione Lazio.
Le indagini hanno riguardato:
1. Analisi delle differenze tra i diversi siti della regione Lazio; Monti Cimini, Monti Sabatini, Castelli Romani, Monti Lepini.
2. Analisi delle differenze tra campioni cipollati e campioni sani
3. Analisi delle differenze tra campioni di età compresa tra 6 e 10 anni e campioni di età compresa tra 11 e 15 anni.
Per l‟analisi cronologica, sono stati scelti quei provini che presentavano un range di età pari a quello di indagine, pertanto sono stati selezionati tutti i provini contenenti approssimativamente gli anelli che andavano dal 6° al 10° anno, e dal 11° al 15° anello. Laddove i provini presentavano qualche traccia di anelli non appartenenti alle suddette classi di età, tramite bisturi si è provveduto ad eliminare la porzione di provino non ricadente nel range cronologico desiderato.
L‟analisi dei campioni cipollati e sani, ha previsto esclusivamente il reclutamento di una serie di provini appartenenti a piante che presentavano la cipollatura e, di contro, appartenenti a piante sane.
Il campionamento per questo tipo di analisi è stato effettuato come segue.
Tab.6.9: Campionamento per le analisi col metodo Pirolisi gasmassa (Py-GC/MS).
Classi d'età
Piante sane - piante
cipollate
AREA 6-10 11-15 alberi cipollati alberi sani
Monti Cimini 3 3 4 6 Monti Sbatini 3 3 2 4 Castelli Romani 3 3 2 4 Monti Lepini 3 3 1 5 Totale 12 12 9 19
In totale dunque sono state analizzate 28 piante per le 4 aree di studio: 10 per i Monti Cimini, e 6 rispettivamente per i Monti Sabatini, per i Castelli Romani e per i Monti Lepini.
La pirolisi consiste in una degradazione termica controllata in assenza di ossigeno con produzione di molecole neutre relativamente volatili o comunque analizzabili mediante gas cromatografia. Utilizzando un gas cromatografo in serie ad un pirolizzatore si ottiene un cromatogramma o pirogramma caratteristico di ogni matrice. L‟accoppiamento con uno spettrometro di massa permette il riconoscimento qualitativo dei singoli frammenti da mettere in relazione con la struttura di partenza. I campioni analizzati sono costituiti da polveri o da microframmenti di peso variabile tra 0,01 e 0,15 milligrammi. La strumentazione impiegata è costituita da un pirolizzatore a fornace SGE, Pyrojector II, che è stato fatto operare a una temperatura di pirolisi di 600°C. Il pirolizzatore è accoppiato a un gascromatografo HP 5890, munito di colonna SGE BPX 5, 30 m, Ø 0.25 mm (fase stazionaria 0.25mm, 95% difenil-, 5% dimetil-silicone). Per il gascromatografo è stato utilizzato il seguente programma termico: isoterma iniziale a 50°C per 10 minuti, gradiente termico di 5°C al minuto fino a 290°C, isoterma finale a 290°C per 10 minuti. L‟analisi spettrometrica di massa è stata condotta con uno spettrometro di massa VG AutoSpec (intervallo di massa da 40 a 450 m/z, ionizzazione ad impatto elettronico a 70 eV, acquisizione 2 scansioni al secondo).
Il metodo della pirolisi accoppiata alla GC/MS ha fornito informazioni utili per individuare e caratterizzare la molecola della lignina. Per il presente studio questa tecnica si è rivelata particolarmente adatta perché ha permesso di preparare i campioni senza effettuare particolari trattamenti, e di sottoporli direttamente alla Py-GC/MS.
Il risultato visivo della pirolisi è un pirogramma: esso è costituito da una gran quantità di picchi, la maggior parte dei quali è stata identificata mediante lo studio degli spettri di massa ad essi corrispondenti. In genere in esso si possono distinguere diverse zone principali nelle quali sono presenti i picchi derivanti rispettivamente dalla pirolisi della lignina e della cellulosa, delle emicellulose ecc.; nella zona iniziale del pirogramma sono presenti i picchi derivanti da cellulosa ed emicellulosa (carboidrati) che però non sono diagnostici ai fini del nostro studio (Terrone et al., 1995, Del Rio et al., 2001; Yokoi et al., 1999). I prodotti di pirolisi della lignina possono essere distinti in derivati del siringolo (S) e derivati del guaiacolo (G). Questa distinzione è risultata molto utile per caratterizzare lignine provenienti da diverse specie perché il contenuto relativo in
G e S risulta abbastanza caratteristico di ogni specie. In particolare, il rapporto quantitativo tra la
caratterizzare la struttura della lignina stessa (Choi et al., 2001; Yokoi et al., 1999; Rodrigues et
al., 1998 e 2000; Reale et al., 2004).
E‟ stata effettuata, quindi, un‟indagine quantitativa calcolando le aree dei picchi dei derivati fenolici di tipo S e G in ciascun pirogramma e normalizzando questi valori in modo da ottenere per ognuno dei picchi la corrispondente “area relativa”. Con le aree relative ricavate si è realizzata una tabella dove sono riportati i rapporti S/G di tutti i campioni.
Fig. 3
pirogramma di un campione di Castanea sativa.
Figura 4. Formule di struttura dei principali prodotti aromatici di pirolisi suddivisi in composti di tipo G e S.