Preparazione del campione

La mioglobina usata è mioglobina estratta da cuore di cavallo, fornita da Sigma Aldrich. La proteina liolizzata è nella forma ferrica poiché l'atomo di Fe del gruppo eme è stabile in stato di ossidazione (III) se esposto all'aria. La soluzione su cui eettuare la misura è stata preparata sciogliendo la proteina liolizzata in una soluzione tampone a pH=7, ottenuta sciogliendo in acqua distillata le giuste quantità di NaH2P O4 e Na2HP O4. La soluzione tampone è stata op- portunamente degassata e saturata con un usso di N2 per evitare la presenza di O2 il quale tenderebbe a legarsi alla mioglobina, generando la forma mioglo-

bina "oxy" indesiderata. La proteina ferrica è stata trattata con un eccesso di ditionito di sodio (Na2S2O4), un agente riducente che garantisce il manteni- mento della proteina nella forma ferrosa "deoxy". Il trattamento con ditionito di sodio è stato eettuato in atmosfera di azoto per evitare la formazione del legame tra la mioglobina e l'ossigeno atmosferico, che tende a legarsi immedia- tamente al Fe(II). La concentrazione del campione è compresa tra i 100 µM e i 200 µM, misurata tramite uno spettrofotometro UV-VIS. Dopo la preparazione del campione alla concentrazione desiderata, il campione è stato posto in una cella di trasmissione connessa ad un circuito che garantisce un usso continuo del campione esposto al laser grazie a una pompa peristaltica. E' essenziale avere un usso costante per esporre campione fresco a ogni impulso laser, che ha repetition rate di 1 KHz. La cella di trasmissione è stata alloggiata in un traslatore che garantisce un movimento lento e costante della cella, per evitare che i due fasci laser, Raman e Stokes, agiscano sempre nello stesso punto della cella durante l'acquisizione, evitando così il danneggiamento delle nestre della cella stessa.

Capitolo 4

Risultati e discussione

4.1 Evidenze sperimentali

La spettroscopia SRS nella sua implementazione a banda larga (Broadband Sti- mulated Raman Spectroscopy, B-SRS), introdotta nella sezione 2.2, si basa su un processo non lineare che modica i campi Raman e Stokes producendo un trasferimento di fotoni tra di essi, che risulta nella generazione del segnale Ra- man sovrapposto a quello dello Stokes probe. Nel caso dell'SRS il segnale netto sul lato rosso rispetto alla frequenza del Raman pulse è dovuto all'interazio- ne radiazione-materia descritta dal diagramma RRS(Icc), mentre il segnale sul lato blu è dovuto a IRS(Ica). D'ora in poi nella discussione ci si riferirà ai due segnali rispettivamente con i termini lato rosso e lato blu; è preferibile usa- re questa terminologia per dierenziare la nomenclatura dal caso di Raman spontaneo, in cui i due lati dello spettro sono denominati Stokes e anti-Stokes. Nel caso del Raman spontaneo i processi Stokes e anti-Stokes sono descritti da diagrammi in cui la prima interazione ha origine, rispettivamente, dal livello vibrazionale fondamentale e dal un livello vibrazionalmente eccitato nello stato elettronico fondamentale. Al contrario, nel caso dell'SRS, i due lati dello spet- tro sono descritti entrambi da diagrammi in cui la prima interazione ha origine dal livello vibrazionale fondamentale dello stato elettronico fondamentale. So- no state condotte una serie di misure al ne di ottenere spettri Raman della mioglobina "deoxy" al variare della lunghezza d'onda del Raman pulse. In par- ticolare la lunghezza d'onda del campo Raman viene fatta variare in un intorno, compreso tra 428 nm e 487 nm, del massimo della banda Soret dello spettro di assorbimento della mioglobina. In condizioni di non risonanza il lato rosso dello spettro contiene la stessa informazione spettrale ed è analogo allo spettro Stokes del Raman spontaneo, ossia consiste in un picco di intensità positiva (Stimulated Raman Gain, SRG). Il lato blu presenta invece dei picchi negativi (Stimulated Raman Loss, SRL) e, a dierenza del Raman spontaneo, il rapporto tra le intensità del lato rosso e del lato blu non contiene alcuna informazione riguardo la temperatura locale del sistema [20].

Come chiarito nella sezione 2.11.1, in condizioni di risonanza la risposta SRS ha un comportamento più complesso. Il prolo spettrale del lato rosso non cambia signicativamente anche se l'intensità aumenta per risonanza con una dipendenza molto simile al prolo di eccitazione del Raman spontaneo. Inve-

ce le forme di riga del lato blu sono completamente diverse: evolvono da gain negativi in condizioni di perfetta non risonanza a gain positivi in condizioni di perfetta risonanza, passando attraverso proli dispersivi in condizioni di riso- nanza intermedie per eetto della scansione della lunghezza d'onda del Raman pulse attraverso lo spettro della banda Soret.

In Fig. 4.1 sono riportati gli spettri per un campione di mioglobina "deoxy" eccitato da un Raman pulse la cui lunghezza d'onda varia all'interno della regio- ne spettrale della banda Soret della mioglobina. Mentre il lato rosso presenta una condizione di risonanza con piccole deviazioni rispetto al massimo della banda Soret (mostrato nei pannelli laterali in Fig. 4.1), il Raman gain massimo nel caso del lato blu dipende in maniera peculiare dallo specico modo vibra- zionale e in particolare si manifesta ad energie minori di un quanto vibrazionale rispetto al lato rosso dello spettro. In particolare, maggiore è la frequenza del livello vibrazionale, minore è l'energia del fotone del Raman pulse necessario a raggiungere la condizione di risonanza. Inoltre, la risposta nel lato blu cambia segno quando è raggiunta la condizione di perfetta risonanza. Infatti, il segnale sul lato blu è negativo in condizioni di perfetta non risonanza e diventa positivo quando la lunghezza d'onda del Raman pulse è in condizioni di perfetta riso- nanza, passando attraverso forme di riga dispersive nei casi intermedi.

La dipendenza delle forme di riga dalla lunghezza d'onda del Raman pulse è caratteristica del singolo modo, come mostrato in Fig. 4.2.

Prendendo come esempio il picco Raman ν4 (modo vibrazionale ad energia

1355 cm−1), si osserva una forma di riga lorenziana positiva quando la lun- ghezza d'onda del Raman pulse, λR, è pari a 467 nm; aumentando o riducendo la lunghezza d'onda del Raman pulse di circa 20 nm rispetto alla condizione di perfetta risonanza a 467 nm, il picco Raman si trasforma in una debole banda negativa. La forma dispersiva della forma di riga del modo ν4 si manifesta a valori di lunghezza d'onda intermedi e presenta una simmetria dispari: quando λR viene incrementata, il lobo positivo è a frequenze più alte mentre quando λR è diminuita si genera un lobo negativo sul lato delle alte frequenze. Un an- damento molto simile si manifesta per il modo ν7: in questo caso la condizione di perfetta risonanza è raggiunta per λR= 456 nm.

La polarizzazione al terzo ordine indotta nel campione, responsabile dei se- gnali SRG e SRL, può essere valutata tramite un'espansione perturbativa della matrice densità in potenza dei campi elettrici, come precedentemente descrit- to nel Capitolo 2. Data la presenza di un Raman pulse a banda stretta e di uno Stokes probe con durata del femtosecondo, si deve tenere conto di tutte le possibili permutazioni dei campi le quali sono responsabili dei diversi contributi alla polarizzazione totale P(3)_{. Tuttavia, come dimostrato nel Capitolo 2, gli} spettri possono essere riprodotti da due contributi four-wave-mixing dominanti, uno per ogni lato dello spettro: RRS(Icc)per il lato rosso e IRS(Ica)per il lato blu (Fig. 4.1 , pannelli laterali).

I diagrammi in Fig. 4.1 descrivono l'evoluzione della matrice densità che descri- ve il materiale durante l'interazione con i campi elettromagnetici. Per quanto riguarda il lato rosso, il Raman pulse interagisce per primo con il mezzo portan- do il bra della matrice densità in uno stato elettronico eccitato; successivamente una diseccitazione del bra indotta dallo Stokes probe porta il bra in uno stato vibrazionalmente eccitato (n=1) nel ground state elettronico, inducendo una coerenza vibrazionale che è quindi rivelata tramite una ulteriore interazione con

Figura 4.1: spettro SRS della mioglobina. Pannello centrale: colormap degli spettri B-SRS in cui si evince la dipendenza dalla lunghezza d'onda del Raman pulse. I segnali sono sempre positivi nel lato rosso dello spettro, mentre nel lato blu presentano dierenti proli a seconda della condizione di risonanza. Le frecce evidenziano le energie caratteristiche dei due modi normali ν7e ν4relative al ground state elettronico. Pannelli laterali: diagrammi FWMEL per i segnali RRS(Icc)e IRS(Ica)[24].

il Raman pulse sul ket della matrice densità e un free induction decay nale. Nel lato blu i campi interagiscono solo con il ket della matrice densità. La pri- ma interazione è con lo Stokes probe, che promuove il ket dal ground state allo stato elettronico eccitato |bi; successivamente il Raman pulse induce la coeren- za vibrazionale |ci ha|, che può essere rivelata dopo una terza interazione con il Raman pulse e un free induction decay nale. Si coglie l'occasione per ribadire che il contributo del lato blu non coinvolge una transizione iniziale che parte da un livello vibrazionale eccitato (come è visibile dal diagramma), pertanto non corrisponde a un fenomeno anti-Stokes come nel caso del Raman spontaneo. [23] La Fig. 4.3 mostra una porzione del lato blu dello spettro, dove compaiono i modi ν4 e ν7 della mioglobina per dierenti valori di lunghezza d'onda del Raman pulse λR. Si riporta di seguito l'analisi per questi due modi che, oltre ad essere i più biologicamente rilevanti, sono stretching altamente simmetrici (quindi caratterizzati da elevate sezioni d'urto) dell'anello pirrolico dell'eme; tuttavia l'analisi è estendibile a tutti gli altri modi dello spettro SRS. Per com- prendere il particolare comportamento del lato blu dello spettro SRS per quanto riguarda questi due modi, i dati sono stati analizzati valutando nel dominio delle frequenze la funzione risposta non lineare associata ai due diagrammi in Fig. 4.1.

In Fig. 4.2 sono riportate le bande SRS ν7e ν4per il lato blu dello spettro in funzione di λR. La funzione che modellizza lo spettro SRS disperso in frequenza è I(ω, λR) = A(λR) Im  P(3)_{(ω, λ} R) E_P(0)(ω)  (4.1) dove E(0)

R a m a n G a i n Raman Shift (cm -1 )

Figura 4.2: Dipendenza da λR del lato blu dello spettro SRS per i modi Raman ν7 (670 cm−1) e ν4 (1354 cm−1). Le forme di riga sperimentali sono rappre- sentate da punti; le linee continue rappresentano il modello per i proli di riga descritto dall'equazione 4.1. In condizioni di perfetta non risonanza (428 nm e 472 nm per il modo ν7 o 487 nm per il modo ν4) il segnale è un debole picco negativo, mentre in condizioni di perfetta risonanza (ossia 456 nm e 467 nm rispettivamente per i modi ν7 e ν4) il segnale diventa positivo e più intenso. La transizione tra loss e gain procede tramite una condizione semirisonante, generando una forma di riga dispersiva [24].

positivo ottimizzabile che tiene conto del Raman Excitation Prole.

Le polarizzazioni per ogni lato dello spettro possono essere ottenute diretta- mente dai diagrammi in Fig 4.1, come precedentemente mostrato nel Capitolo 2. Scrivendo i campi Raman e Stokes come

ER,S(t) = εR,S(t)e−iωR,St+ c.c. (4.2) si ottiene P_RED(3) (ω, λR) = |µab|2|µbc|2 1 ωbc− ω − iΓbc Z +∞ −∞ dω1 ε∗(ω1) ωR+ ω1− ωba− iΓab × Z +∞ −∞ dω3 εR(ω3)εP(ω − ωP+ ω1− ω3) ω − ω3− ωR+ ωca+ iΓac (4.3) e per il lato blu,

P_{BLU E}(3) (ω, λR) = |µab|2|µbc|2 1 ω − ωba+ 1Γba Z +∞ −∞ dω1 ε∗(ω1) ω − ωR− ω1− ωca+ iΓca ×

Figura 4.3: dipendenza del lato blu dello spettro SRS dalla lunghezza d'onda del Raman pulse per i modi ν7(a) e ν4(b) della mioglobina. Il segnale è negativo in condizioni di non risonanza e diventa positivo quando λRè in perfetta risonanza. (c, d): ricostruzione del segnale ottenuto dall'equazione 4.1 [24].

Z +∞ −∞ dω3 ε∗(ω3)εP(ω + ωP− ω1+ ω3) ω − ωba+ ω3− ω1+ iΓba) (4.4) dove µij è il momento di dipolo di transizione tra gli stati i e j , ωij = ωi− ωj è la dierenza di frequenza tra i livelli i e j e Γij è il rate di dephasing della coerenza indotta |ii hj|. Le lettere a, b e c indicano rispettivamente lo stato elettronico fondamentale, uno stato elettronico eccitato e un generico stato vibrazionalmente eccitato nello stato elettronico fondamentale.

Le ampiezze temporali del Raman pulse e dello Stokes Probe, εR(t) e εS(t), sono modellizzate come proli gaussiani:

εR(t) = ε (0) R e − t2 2σ2_{R → E} R(t) = ε (0) R e − t2 2σ2_ReiωRt_{+ c.c.} (4.5) εP(t) = ε (0) P e −(t−tP )2 2σ2_{P → E} P(t) = ε (0) P e −(t−tP )2 2σ2_{P e}iωPt_{+ c.c.} (4.6)

dove tP è il ritardo temporale tra il Raman pulse e lo Stokes probe; εR, ωRe σR sono calibrati usando lo spettro SRS del cicloesano (Capitolo 3, sezione 3.4). Per semplicare le equazioni (4.2) e (4.3) e interpretare il lato rosso e il lato blu dello spettro, si considera il caso semplicato in cui il Raman pulse è monocro- matico (εR(t) = 1) e lo Stokes probe istantaneo (εP(t) = δ(t)), già illustrato dettagliatamente nel Capitolo 2. Si riportano di seguito le equazioni (2.99) e (2.103) precedentemente calcolate nella sottosezione 2.8.1:

P_RRS(I(3) cc)(ω) =  1 ¯ h 3 |µab|2|µcb|2 1 (ωbc− ω − iΓbc)(−ωR+ ωca+ iΓac + ω) ×

1 (ωR− ˜ωba− iΓab) (2.99) P_IRS(I(3) ca)(ω) =  1 ¯ h 3 |µab|2|µcb|2 1 (ω − ωba+ iΓba)2 × 1 (ω − ωR− ωca+ iΓca) (2.103)

Le equazioni (2.99) e (2.103) permettono di chiarire l'eetto della condizione di risonanza sul lato rosso e blu dello spettro SRS. Nel primo caso, la condizione di risonanza si manifesta per ωR= ωba, in analogia con il Raman spontaneo. Nel secondo caso, invece, la condizione di risonanza dipende dall'energia del modo vibrazionale ωca coinvolto nel processo, poiché ωR = ωba− ωca. L'aumento o il decremento del numero di fotoni nell'impulso di probe, che corrisponde rispettivamente a picchi Raman positivi o negativi, è governato dal segno della parte immaginaria della P(3)_{(ω), come mostrato nell'equazione (4.1). Nel lato} rosso, il segno della parte immaginaria calcolato attraverso il diagramma sulla sinistra della Fig. 4.1, non dipende da λR ed è sempre positivo. Pertanto la forma di riga SRG è un picco positivo per ogni lunghezza d'onda del Raman pulse.

Il caso più interessante è tuttavia rappresentato dal lato blu. Nel caso SRL, infatti, la risonanza elettronica restituisce un segno negativo e positivo della parte immaginaria descritta nell'equazione (4.1), rispettivamente in condizioni di non risonanza e di perfetta risonanza.

Questo risultato razionalizza il comportamento del lato blu dello spettro. Come mostrato in Fig. 4.2 gli spettri SRS sono ben riprodotti dal model- lo rappresentato dall'equazione (4.1) per ogni λR, usando ωca = 1354 cm−1

e Γca = 10 cm−1 per il modo ν4 e ωca = 671 cm−1 e Γca = 10.5 cm−1

per il modo ν7. I parametri ωba, Γba e A(λR) sono stati ottimizzati per ot- tenere il best t dei dati sperimentali, che permettono di valutare il REP (Stimulated Raman Excitation Profile) per il lato blu dello spettro per tutti i modi Raman attivi (Fig. 4.4), come:

REP (λR) =

A(λR)

|ωR+ ωca− ωba+ iΓba|2

(4.9) dove ωba e Γba modellizzano un semplice assorbimento lorenziano ed eventuali deviazioni da questo prolo sono contenute nel fattore di correzione A(λR).

Inoltre questi risultati permettono di capire perché, sotto condizioni di ri- sonanza, il lato blu dello spettro mostra picchi Raman più intensi, fornendo un miglior rapporto segnale rumore. Nel lato rosso l'intensità massima del Raman gain si ottiene per λR in corrispondenza del massimo di assorbimento elettronico (banda Soret centrata a 435 nm). Di conseguenza, mentre viaggia attraverso il campione, il Raman pulse sperimenta un eetto di attenuazione a causa dell'assorbimento e l'intensità eettiva che contribuisce alla generazione del segnale SRS è di conseguenza ridotta. Al contrario, nel lato blu, la condizio- ne di risonanza si manifesta per frequenze del Raman pulse ridotte rispetto alla frequenza del picco di assorbimento Soret di una quantità ωca. Di conseguenza, maggiore è l'energia del modo vibrazionale, minore è l'attenuazione indotta dal- l'assorbimento del Raman pulse da parte del campione. E' chiaro che maggiore è

l'intensità eettiva del Raman pulse, maggiore è l'intensità del segnale SRS. [24] Resonance A( R ) REP Resonance A( R ) REP 430 440 450 460 470 0 1 2 3 4 440 450 460 470 480 I n t e n s i t y ( A U ) R (nm) R (nm)

Figura 4.4: Raman Excitation Prole per i modi ν7e ν4. Gli eetti di risonanza sono considerati in questo modello da due contributi: un eetto di assorbimento lorenziano (linee nere) e il fattore A(λR) dell'equazione (4.1) (linee ciano). I REP sono ottenuti dal prodotto di questi eetti e sono rappresentati dalle linee blu per i modi Raman ν7 e ν4[24].

In Fig. 4.5 sono riportate le intensità SRS sperimentalmente determinate per diversi modi della mioglobina. Per ogni modo l'intensità è valutata come l'integrale del valore assoluto del segnale SRS: variando λR, si osserva un au- mento generale del prolo di risonanza del lato blu rispetto al lato rosso. Inoltre, la dipendenza dalla lunghezza d'onda delle intensità del lato blu dello spettro presenta, come già detto, una condizione di risonanza spostata in termini di λR che dipende peculiarmente dalla frequenza vibrazionale specica ωca. Al con- trario, la condizione di risonanza nel lato rosso è completamente indipendente dal modo Raman della mioglobina. Tuttavia, un'attenta analisi di quest'ultimo prolo, rivela un piccolo blueshift, in accordo con quanto descritto in letteratura [5].

0.00 0.06 0.12 0.0 0.4 0.8 0.00 0.15 0.30 420 430 440 450 460 470 480 0.00 0.03 0.06 365 cm -1 670 cm -1 1355 cm -1 1610 cm -1 I n t e n si t y ( A U ) R (nm)

Figura 4.5: dipendenza dello spettro SRS dalla lunghezza d'onda del Raman pulse per i modi a 365 cm−1_(δ(C

βCcCd)), 670 cm−1 (ν7), 1354 cm−1 (ν4) e 1610 cm−1 (ν10)della mioglobina, valutati come l'integrale del valore assoluto del segnale SRS per ogni modo [24].

4.2 Procedura di interpolazione, sottrazione del-

la linea di base e calibrazione

Per isolare il contributo Raman negli spettri SRS della mioglobina occorre ri- muovere il segnale di fondo. Nel caso della mioglobina l'assorbimento transiente del Raman pulse ed un contributo addizionale non lineare dovuto sia alla mio- globina che al solvente generano una linea di base allargata. Questa può essere rimossa aggiungendo un polinomio di basso grado (secondo o terzo) alla proce- dura di tting presentata precedentemente in Eq. (4.1). In Fig. 4.6 è riportato il segnale di fondo polinomiale ottenuto nella procedura di tting nella regione di alta frequenza intorno al modo ν4. L'area colorata rappresenta i contributi SRS isolati.

Lo spettro SRS del cicloesano è stato acquisito ed usato per la calibrazio- ne del Raman pulse e dei parametri dello Stokes probe che compaiono nelle equazioni (4.5) e (4.6). La frequenza del Raman pulse (ωR) e la sua ampiezza (ε(0)

R ) sono state misurate tramite il curve tting della posizione e dell'intensità dei modi Raman del cicloesano. La durata temporale del Raman pulse (σR) e il ritardo temporale tP sono ottenuti dalla stessa procedura di interpolazione sul modo più risolto a 800 cm−1 _{del cicloesano, usando l'equazione (4.3) come} mostrato in Fig. 4.7.

Figura 4.6: esempio di rimozione della baseline. Il segnale di fondo polinomiale ottenuto nella procedura di tting per la regione di alta frequenza intorno al modo ν4, dove l'area colorata rappresenta i segnali SRS isolati.

Figura 4.7: calibrazione con cicloesano. Lo spettro del cicloesano è stato inter- polato per calibrare la durata del Raman pulse (σR)e il suo ritardo temporale rispetto allo Stokes probe (tP). Nella gura sono riportati questi parametri in- sieme ad altri risultati del t, come la posizione del picco ωcae la sua larghezza di banda γca= Γcaper lo specico modo del cicloesano a 800 cm−1. Le piccole oscillazioni negative laterali indicano che lo Stokes probe precede temporalmen- te il Raman pulse, assicurando la migliore condizione di misura in termini di risoluzione spettrale e RG [19].

4.3 Conclusioni

In questo lavoro sono stati riportati gli spettri SRS della mioglobina "deoxy" con lo scopo di esplorare gli eetti della risonanza elettronica al variare della lunghezza d'onda del Raman pulse in un intorno del massimo della banda So- ret di assorbimento. La tecnica SRS permette di ottenere spettri vibrazionali ad alta risoluzione nella regione compresa tra 200 cm−1 _{e 2000 cm}−1_{, liberi} dal background dovuto alla uorescenza. Per il lato rosso dello spettro è sta- ta vericata una sostanziale equivalenza tra il segnale SRS e il segnale Stokes del Raman spontaneo. [4] Nel lato blu dello spettro sono state invece osserva- te forme di riga negative e dispersive rispettivamente in condizioni di perfetta

non risonanza e in condizioni di semirisonanza. I picchi Raman del lato blu dello spettro diventano positivi solo nella condizione di perfetta risonanza, che dipende strettamente dalla frequenza caratteristica del modo. Una trattazione quantistica del campione ha permesso, ricorrendo al formalismo della matrice densità, di identicare e valutare i contributi della polarizzazione al terzo ordi- ne responsabili del segnale SRS, riproducendo i dati sperimentali. L'approccio proposto, applicato in questa tesi per interpretare lo spettro della mioglobina, è da inquadrare in un contesto più ampio e costituisce una procedura generale per estrarre i proli di eccitazione (Raman Excitation Profiles) a partire da forme di riga spettrali complesse.

La capacità di amplicare selettivamente l'intensità dei picchi Raman, insieme alla sua selettività strutturale, rende l'SRS una tecnica estremamente adatta per lo studio degli eetti di risonanza Franck-Condon e per l'estrazione di informa- zioni quantitative sulle ampiezze di vibrazione e sugli accoppiamenti vibronici. Inoltre, poiché la cross section del lato blu dello spettro SRS aumenta note- volmente in condizioni di risonanza, questo lato dello spettro può rivelarsi un migliore candidato per l'acquisizione del segnale Raman.

Si anticipa che lo studio delle forme di riga dello spettro SRS e soprattutto il cambiamento da esse subito per eetto della risonanza potrà rivelarsi in futu- ro molto importante negli esperimenti di dinamica ultraveloce. Aggiungendo all'esperimento un ulteriore fascio laser di pompa e usando l'SRS come pro-