Procedura estrattiva

Tutti i campioni filtrati, sia quelli da sottoporre ad analisi biologica che quelli destinati all’analisi chimica, sono stati sottoposti alla procedura estrattiva, la quale porterà a concentrare il volume iniziale di ciascun campione di circa 2000 volte, passando da 1 L a 500 μL.

La SPE rappresenta attualmente la tecnica di preparazione del campione più nota e utilizzata nei laboratori analitici in diversi settori, da quello clinico a quello ambientale. Il processo di estrazione è basato sull'interazione degli analiti da estrarre, in questo caso residui di farmaci ambientali e altri IE, disciolti in una fase liquida, con una fase adsorbente solida. Dopo un preliminare condizionamento dell'adsorbente, il processo di estrazione prevede una fase di caricamento del campione liquido e ritenzione degli analiti, seguita da una fase di eluizione con un opportuno solvente.

La SPE è stata inizialmente introdotta come alternativa all'estrazione liquido- liquido (LLE, Liquid-Liquid Extraction), per isolare e concentrare tracce di contaminanti organici apolari da campioni acquosi. Mentre la LLE richiede l'impiego di una presa del campione adeguata e quindi elevati volumi di solventi organici che devono poi essere riconcentrati, la SPE sfrutta le interazioni polari tra un adsorbente polare e gli analiti polari, caricando elevati volumi di campione acquoso su piccole quantità di adsorbente ed eluendo gli analiti con pochi mL di solvente organico, ottenendo così elevati fattori di arricchimento dell'analita e

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riducendo nel contempo i tempi di analisi e le possibili contaminazioni da impurezze presenti nei solventi. Come principio di funzionamento, la SPE risulta estremamente simile alla cromatografia liquida, essendone legata dalle medesime leggi e considerazioni. Dal momento in cui la fase solida, contenuta nella cartuccia, entra in diretto contatto con la fase liquida ed i soluti in essa contenuti, questa deve essere in grado di separare l'analita dalla fase liquida. Per far ciò è necessario che l'analita presenti una maggiore affinità per il mezzo solido responsabile della separazione e, nel dettaglio, occorre che la forza di legame tra analita e sito attivo dell'assorbente sia più elevata rispetto a quella esistente tra analita e fase liquida, nella quale si trova inizialmente inserito.

In detto lavoro di tesi, sono state utilizzate delle cartucce di estrazione del modello OASIS-HLB 6 cc, 200 mg (Waters Spa, Milano), realizzate in speciale materiale composito nel quale, su una matrice di divinilbenzene, sono inseriti sia gruppi polari idrofilici che gruppi polari lipofilici. La SPE risulta un passaggio di fondamentale importanza soprattutto in vista della cromatografia liquida accoppiata a spettrometria di massa tandem in quanto una diminuzione della complessità della matrice di partenza porta necessariamente ad un abbattimento dell'effetto matrice, la quale può essere diretta responsabile di una quantificazione sotto- o sovra-stimata della reale quantità di analita presente. Di seguito sono riportate le 5 fasi successive eseguite durante il procedimento multi-step dell'estrazione in fase solida SPE.

1. Condizionamento. Questo passaggio preliminare ha come scopo quello di attivare i siti attivi della cartuccia SPE, così che l'analita venga correttamente trattenuto nella fase solida. Questo si ottiene facendo passare per caduta 6 mL di metanolo, solvente scelto per la successiva fase di eluizione.

2. Equilibrazione. Successivamente, si procede facendo fluire attraverso la cartuccia, sempre per caduta, 6 mL di acqua ultrapura MilliQ. Questo passaggio viene fatto sia per asportare il solvente di condizionamento, sia per permettere all'analita del campione di interagire con i siti attivi della cartuccia.

3. Caricamento del campione. La fase più lunga e delicata dell'intero processo consiste nel passaggio del campione d’acqua da 1 L attraverso la cartuccia. In questo caso, l'acqua del campione non viene fatta passare per caduta all'interno della cartuccia come nelle fasi precedenti, ma ad una velocità che non deve comunque superare i 10 mL/min. Questo per far sì che le molecole abbiano modo di legarsi ai siti attivi della fase solida. La velocità di flusso viene regolata

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con una pompa che genera il vuoto in un apparecchio vacuum manifold (Figura 3.9), scartando il percolato.

4. Risciacquo. Una volta che tutto il campione è stato fatto passare attraverso la cartuccia, viene caricata un'aliquota pari a 6 mL di acqua ultrapura Milli-Q allo scopo di far passare attraverso la cartuccia tutta l’acqua del campione sperimentale. Anche in questo caso il flusso non deve risultare superiore a 10 mL/min. Successivamente a questo lavaggio, la pompa di aspirazione è stata mantenuta in azione per 15 min circa, al fine di ridurre al minimo la fase acquosa nell'eluato. Anche in questo caso il percolato viene infine scartato.

5. Eluizione. L'ultima fase del processo SPE consente, attraverso l'ausilio di un opportuno solvente, di portare in soluzione gli analiti di interesse trattenuti nella fase solida della colonnina. Questo passaggio, estremamente delicato, consiste nell'eluizione lenta, per caduta, con 6 mL di metanolo, allo scopo di eluire tutte le molecole trattenute dalla fase solida di estrazione. Quanto eluito viene raccolto in opportune provette di vetro. L'esecuzione della procedura SPE è stata possibile attraverso l'utilizzo di un apparecchio vacuum manifold che ha permesso di effettuare l'estrazione di quattro campioni per volta (Figura 3.10).

Al termine della procedura di estrazione, i campioni eluiti in metanolo sono sottoposti alla successiva fase di evaporazione sotto flusso di azoto (Figura 3.11). Questo per permettere la considerevole riduzione del volume del campione di interesse grazie alla volatilizzazione del metanolo, impiegato come solvente di eluizione nell'ultimo passaggio di estrazione SPE. Mentre il solvente verrà rimosso per evaporazione, le molecole di nostro interesse, avendo invece una tensione di vapore minore rispetto al solvente stesso, sono teoricamente le sole a rimanere adese alla parete della provetta di vetro contenente l'eluato. Al fine di

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evitare perdite e fuoriuscite delle specie chimiche di interesse, il flusso gassoso deve essere accuratamente controllato.

Successivamente all'evaporazione, l'analita deve essere ricostituito mediante una miscela di acqua:metanolo, a seconda del tipo di analisi a cui il campione andrà sottoposto in seguito.

 Campioni da sottoporre ad analisi biologica. Il volume dell'eluato viene ridotto a 50 μL in modo da mantenere in soluzione le molecole presenti. A questi 50 μL di metanolo sono quindi aggiunti 200 μL di acqua. Il campione così ricostituito è mantenuto ad una temperatura di 4 °C nelle medesime provette di vetro fino al momento dell'esposizione alle cellule. In sede di esperimento sulle colture cellulari, il campione di acqua:metanolo è ulteriormente diluito in mezzo di coltura cellulare, portandolo ad una soluzione di lavoro di 50 mL. Tenendo conto che si è partiti da un volume di acqua iniziale di 1L, la concentrazione finale di campione acqua:metanolo è pari a 20x, con metanolo residuo allo 0,1%. Studi preliminari effettuati nel nostro laboratorio mostravano infatti che una concentrazione di 200x risultava tossica per le cellule con cui veniva a contatto. Prima di procedere con l'esperimento, inoltre, i campioni di acqua:metanolo sono sottoposti ad un processo di filtrazione/sterilizzazione, mediante l'impiego di filtri a siringa con porosità estremamente ridotta (ϕ<0,2 μM), al fine di ridurre il rischio di inquinamento biologico.

 Campioni da sottoporre ad analisi chimica. Il volume dell'eluato, anche in questo caso, non viene portato a secco, ma ridotto ad un volume di 50 μL di metanolo. Tale residuo sarà successivamente suddiviso in due aliquote uguali, ognuna da risospendere in opportune miscele di acqua:metanolo, coerentemente con le condizioni di analisi in LC/MS/MS. Per le analisi di estrogeni, BPA, nonilfenolo e ottilfenolo il campione è stato risospeso in

Figura 3.11 Evaporazione

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metanolo:acqua in rapporto 50:50 (125 μL metanolo: 125 μL acqua), mentre per l'analisi di Diclofenac, Ibuprofene, PFOS e PFOA in rapporto 10:90, (25 μL metanolo: 125 μL acqua). La miscela di solventi corrisponde a quella impiegata all'inizio della separazione cromatografica, in modo da non falsare le dinamiche di separazione in colonna. In entrambi i casi, la soluzione ottenuta risulterà concentrata 2000 volte rispetto a quella di partenza. Prima dell'analisi in LC/MS/MS, è stato necessario procedere ad una centrifugazione dei campioni per circa 5 minuti a 17000 × g, di modo di rimuovere il particolato eventualmente rimasto in sospensione. Da questo momento risulta infatti essenziale e doveroso garantire la purezza di quel che viene iniettato in colonna cromatografica, di modo da evitare intasamenti e conseguenti problemi di sovra-pressione del sistema. I campioni vengono allora travasati in appositi boccini da autocampionatore e mantenuti ad una temperatura di - 20°C fino al momento dell'analisi.

3.3 Analisi chimiche: cromatografia liquida accoppiata alla