Procedure dello studio

I partecipanti si sono presentati presso gli ambulatori dell’UO Medicina Interna 1 dell’AOUP Pisa. Prima di iniziare lo studio, ad ogni partecipante sono state accuratamente descritte le procedure di svolgimento dello studio ed è stato consegnata la lettera informativa per il paziente e per il medico curante, i moduli per l’espressione del consenso allo studio e al trattamento dei dati personali. I pazienti sono stati invitati a mantenere il loro trattamento farmacologico usuale. I test di funzionalità vascolari sono stati eseguiti in una stanza con aria condizionata (22-24°C).

Durante la sessione sperimentale è stato chiesto ai soggetti di sottoporsi alle valutazioni elencate in questo paragrafo.

3.2.1. Questionari

I soggetti arruolati nello studio sono stati sottoposti alla compilazione dei seguenti questionari al fine di valutare differenti condizioni:

 Valutazione della qualità del sonno:

(i) Epworth Sleepiness Scale (ESS), per misurare il livello generale di sonnolenza diurna; è stata introdotta dal Dr. Johns nel 1991 e rappresenta uno strumento rapido ed economico di screening per identificare coloro che hanno problemi diurni di sonnolenza.È una scala di autovalutazione di 8 item che prendono in considerazione varie situazioni della vita quotidiana che sono note avere un diverso effetto soporifero, per ognuna delle quali il soggetto deve stabilire in che misura tendano a farlo appisolare o addormentare.Ogni item è valutato su di una scala a 4 punti, da 0 a 3. Le proprietà psicometriche dello strumento sono risultate assai buone, compresa una discreta sensibilità al cambiamento per effetto del

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trattamento. Dalla somma dei punteggi assegnati ad ogni singolo item si ottiene un punteggio totale: fino a 6 è una situazione di sonnolenza ottimale, 7-8 è un risultato accettabile, da 9 in su si ha una situazione potenzialmente pericolosa. La ESS versione italiana è stata validata dal Dr. Vignatelli e colleghi.165,166

(ii) Insomnia Severity Index (ISI), per valutare la natura, la gravità e l’impatto diurno dell’insonnia.167 _{L'ISI è un questionario di sette domande per}

l'autovalutazione dell’insonnia nelle due settimane precedenti. È uno strumento affidabile e valido per rilevare i casi di insonnia e per valutarne la gravità. Facendo la somma dei singoli punteggi assegnati a ciascuna domanda si ottiene un punteggio globale che va da 0 a 28. Secondo le raccomandazioni degli autori del questionario ISI, l’insonnia è stato definita da un punteggio ISI uguale o superiore a 8; al contrario, l’assenza di insonnia è stata definita da un punteggio compreso tra 0-7.168 _{L'ISI è}

stato convalidato in campioni italiani.169

 Valutazione della sfera affettiva:

(i) Self-Rating Anxiety State (SAS), per la valutazione dell'ansia di stato; il SAS è una scala di valutazione a 20 item basata sul punteggio ottenuto in quattro gruppi di manifestazioni: cognitive, autonomiche, motorie, e sintomatologia del sistema nervoso centrale. Ogni domanda viene segnato su una scala di valutazione da 1 a 4 punti di tipo Likert. Il punteggio totale varia da 0 a 80. La presenza di sintomi di ansia clinicamente rilevanti è definita da un punteggio SAS superiore a 44.170,171

 Valutazione dello stress e della qualità della vita:

(i) Perceived Stress Scale (PSS), per misurare la percezione di stress. Il PSS è stato sviluppato per misurare il grado in cui certe situazioni nella propria vita vengono valutate come stressanti. Lo stress psicologico è stata definito come la condizione in cui le persone percepiscono che le loro richieste superano la loro capacità di far fronte ad esse. Il PSS è stato

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pubblicato nel 1983 ed è stato sviluppato da Sheldon Cohen ei suoi colleghi, ed è diventato uno dei più utilizzati strumenti psicologici per la misurazione dello stress percepito non specifico. Il PSS predice sia i marcatori biologici oggettivi di stress che l’aumento del rischio di malattia tra le persone con livelli di stress percepito più alti.172,173 I 10 item che compongono il questionario sono stati costruiti per identificare il livello in cui le persone che rispondono al test trovano le loro vite imprevedibili, incontrollabili o sovraccariche. La scala contiene anche una serie di domande dirette sui livelli attuali di stress percepito. Le domande della PSS riguardano i sentimenti e i pensieri relativi all’ultimo mese. Per ciascun item, alle persone viene chiesto di indicare con che frequenza si sono sentite in un certo modo.174 Più alto è lo score totale ottenuto nel questionario e più alti sono i livelli di stress percepito.

3.2.2. Anamnesi ed esame obiettivo

Dopo aver raccolto i dati relativi all’età, i soggetti sono stati sottoposti ad un’anamnesi volta ad analizzare i loro possibili fattori di rischio cardio-vascolare. Sono stati indagati la familiarità di eventi cardio-vascolari, precedente diagnosi di ipertensione, dislipidemie, diabete mellito, insufficienza renale, abitudine al fumo di sigaretta e al consumo di alcolici e attività fisica svolta. È stato inoltre indagato se i soggetti avessero già sofferto in precedenza di malattie del sistema cardio-vascolare o se avesse sofferto di qualsiasi altra condizione patologica. Infine i soggetti sono stati interrogati circa l’aventuale terapia in atto al momento dello studio.

Sono stati successivamente raccolti i dati antropometrici dei soggetti, quali peso, altezza, Body Mass Index (BMI), circonferenza vita e circonferenza fianchi. È stato effettuato sui pazienti un esame obiettivo generale.

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3.2.3. Misurazione della pressione arteriosa clinica

Per misurare la pressione arteriosa clinica sono state eseguite tre valutazioni a distanza di 1 minuto una dall’altra, dopo che il soggetto abbia osservato un periodo di riposo di almeno 5 minuti in un ambiente tranquillo. I valori della pressione arteriosa sistolica e diastolica saranno ottenuti dalla media delle ultime due misurazioni. In ognuna delle tre valutazioni è stata anche misurata la frequenza cardiaca ed i valori assegnati sono stati ottenuti tramite la media delle ultime due misurazioni. L’apparecchio automatico utilizzato è Omron 907.175

3.2.4. Monitoraggio della pressione arteriosa delle 24 ore

Il monitoraggio della pressione arteriosa delle 24 ore è stato effettuato mediante misurazione automatica della pressione tramite apparecchio ABPM (Ambulatory Blood Pressure Monitoring) (TM-2430, A&D INSTRUMENTS LTD., Abingdon, UK). Il bracciale è stato posizionato sul braccio non dominante. Il misuratore è stato predisposto per eseguire una lettura ogni 15 minuti nell’arco delle intere 24 ore. L’intervallo notturno di 15 minuti è stato espressamente richiesto in quanto rappresenta un presupposto fondamentale per la misura della variabilità pressoria a breve termine, mentre allo stesso tempo non costituisce ostacolo ad un riposo adeguato, né influisce negativamente sui valori di PA notturna e sulla correlazione con il danno d’organo.176 Al soggetto è stato consigliato di eseguire le normali attività quotidiane, mentre è stato richiesto di mantenere l’arto fermo durante la misurazione. Il periodo diurno e il periodo notturno sono stati definiti in base al diario clinico di ogni singolo soggetto. Sono stati applicati i seguenti criteri di qualità: >75% delle letture valide rispetto a quelle attese, distanza tra due misurazioni non superiore a 2h e 30 minuti.

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3.2.5. Misurazione dello spessore medio-intimale carotideo

La misurazione dello spessore medio-intimale carotideo (Carotid Intima-Media Thickness) è stata eseguita mediante ecocolordoppler dei tronchi sovraortici.177 Per le scansioni ecografiche è stato utilizzato un apparecchio standard dotato di sonda lineare compresa nel range 7.5-12.5 MHz (MyLab25Gold; ESAOTE, Firenze, Italia). L’apparecchio è stato configurato in modo da ottenere immagini B-Mode ottimali della parete lontana della carotide comune in proiezione longitudinale. In particolare, la profondità dell’immagine è stata impostata su 40 mm, il guadagno complessivo 60 dB e i regolatori del TGC sono stati posti in posizione centrale in modo da non privilegiare diversamente in termini di guadagno l’immagine a diverse profondità. E’ stato visualizzato un tratto di carotide comune di lunghezza 10 mm a partire da 10 mm dal bulbo, in modo da ottenere un’immagine di qualità tale da poter riconoscere la presenza delle varie interfacce vascolari della parete lontana (intima-media e media-avventizia) e l’interfaccia vaso-lume nella parete vicina. L’esame è stato completato con la ricerca di eventuali placche a livello di bulbo e carotide interna. E’ necessario che la stabilità temporale di tali immagini sia tale da poter garantire l’acquisizione di clip della durata di 10 secondi. In particolare sono state acquisite 2 clip a destra (1 in proiezione anteriore e 1 in proiezione laterale) e 2 a sinistra. Tali sequenze sono state acquisite con l’ecografo, salvate su supporto esterno e inviate mediante server al Centro di Pisa per la lettura centralizzata. La lettura dei risultati è avvenuta mediante il dispositivo Carotid Studio (CardiovascularSuite, Quipu srl; Pisa, Italia).178 Al termine dell’analisi, per ogni sequenza sono stati disponibili i seguenti parametri anatomico/funzionali: spessore medio intimale (IMT), diametro medio, diametro diastolico, distension carotidea, Cross- sectional distensibility coefficient (DC): DC = ΔA/(A * ΔP), Cross-sectional compliance coefficient (CC): CC= ΔA/ ΔP [per ΔA si intende la variazione sisto-diastolica del lume carotideo e per ΔP la pressione di pulsazione carotidea, ottenuta a partire dalla forma d’onda carotidea acquisita mediante tonometria ad applanazione (Sphygmocor, Atcor; Sydney, Australia), e calibrata con la pressione diastolica e media centrale].179

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3.2.6. Misurazione della rigidità arteriosa

La misurazione della rigidità arteriosa, espressa come velocità dell’onda di pulsazione (pulse wave velocity, PWV). La rigidità arteriosa è stata valutata come PWV carotido-femorale, mediante tonometria ad applanazione (Sphygmocor, Atcor; Sidney, Australia). In breve, una piccola sonda tonomterica è stata appoggiata delicatamente sulla cute a livello dell’arteria carotide e dell’arteria femorale consecutivamente, per la registrazione dell’onda di pulsazione. In contemporanea, è stato registrato anche il tempo di transito dell’onda di polso. La velocità dell’onda pressoria (PWV) è stata calcolata secondo le attuali linee guida come il rapporto tra la distanza diretta trai due siti di registrazione, moltiplicata per 0,8 (fattore di correzione) e il tempo di transito dell’onda pressoria.180-182 _{L’esame dura pochi minuti e non}

presenta effetti collaterali o controindicazioni particolari. Durante l’esame è stata registrata anche una derivazione ECG. Inoltre sono state registrate le forme d'onda dell’arteria radiale, sempre mediante tonometria ad applanazione dal polso del braccio dominante (Pulse Wave Analysis, PWA). La PWA è stata poi utilizzata per generare una forma d'onda centrale corrispondente utilizzando una funzione di trasferimento convalidata.182-184

3.2.7. Valutazione della funzione endoteliale

La valutazione della funzione endoteliale è stata effettuata mediante flow-mediated dilation (FMD). Le misurazioni sono state eseguite almeno 4 ore dopo l’ultimo pasto, in una stanza silenziosa con temperatura tra i 22 e i 24°C. Per la durata dello studio i soggetti proseguiranno la terapia usuale, se in atto.

La FMD è un test non invasivo che valuta la funzione endoteliale a livello dell’arteria brachiale. L’arteria brachiale è stata visualizzata mediante ecografia ad alta risoluzione utilizzando una sonda lineare con frequenza 10-15 MHz (MyLab25, ESAOTE: Firenze, Italia). La vasodilatazione endotelio-dipendente è stata valutata come aumento percentuale di diametro in risposta all’aumento di flusso (FMD).185

E’ stata ottenuta una scansione longitudinale B-mode dell’arteria brachiale al di sopra del gomito, fissando la sonda ecografica mediante un reggisonda con vite micrometrica, che

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assicura un’immagine stabile per tutta la durata dell’esame. Un bracciale pediatrico è stato posizionato intorno all’avambraccio appena al di sotto della piega del gomito, gonfiato per 5 minuti a 300 mm Hg (±30 mmHg), e quindi sgonfiato, al fine di indurre un’iperemia reattiva. Il diametro dell’arteria brachiale è stato misurato mediante un sistema automatico di individuazione dei bordi real-time (Quipu s.r.l., Pisa, Italia)186, e monitorato ininterrottamente per tutta la durata dell’esame (1 minuto di registrazione basale, 5 minuti di ischemia e 4 minuti dopo lo sgonfiaggio del bracciale).187 La velocità di flusso arterioso è stata determinata simultaneamente alle immagini B-mode mediante Doppler pulsato, con un angolo di insonazione di 70°, e il volume campione al centro dell’arteria. L’esame non presenta effetti collaterali o controindicazioni particolari.

3.2.8. Valutazione del ritmo sonno-veglia

La valutazione del ritmo sonno-veglia è avvenuta mediante actigrafia. Gli actigrafi sono apparecchi da indossare al polso, di forma simile ad orologi in grado di misurare dati accelerometrici, ovvero variazioni di accelerazioni lungo i tre assi nello spazio. Con questa approccio oggettivo è possibile monitorare un soggetto nel suo ambiente naturale (casa, luogo di lavoro, scuola, etc.) per periodi di tempo relativamente lunghi (settimane), in maniera non invasiva e senza modificare le abitudini e la routine quotidiana. È stato utilizzato il dispositivo Fitbit Flex per la durata di una settimana circa. Questo dispositivo è stato sottoposto ad uno studio di concordanza rispetto alla valutazione degli stati comportamentali determinati dalla polisonnografia (PSG).188,189 _{L’adozione di un algoritmo}

basato sul training di una rete neurale percettronica in soggetti normali e gli elevati livelli di sensibilità, specificità e concordanza (>93%) rispetto al classico scoring basato sulla PSG, rendono l’utilizzo di questi accelerometri a basso costo un approccio promettente e validato per la determinazione del ciclo sonno-veglia.190

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