Raccolta frazioni salivari e precipitazione delle proteine con TCA al 20%

Sono state raccolte le frazioni HPLC di saliva marcata con FITC (procedura B) in eppendorf da 2 mL ogni 2 minuti. Ogni frazione raccolta era di un volume pari a 1 mL. Per precipitare le proteine contenute nelle frazioni raccolte è stata preparata una soluzione contenente TCA al 20% e DTT allo 0,1%. Ad ogni campione è stata aggiunta una quantità di TCA/DTT in rapporto 1:1, poi il campione è stato incubato in ghiaccio per 30 minuti e centrifugato a 13500 rpm per 10 minuti a 4°C. Infine è stato aspirato il surnatante evitando di aspirare e muovere il pellet. Ogni campione è stato poi lavato per almeno due volte con acetone a -20°C per eliminare l'eccesso di TCA. Dopo ogni aggiunta di acetone il campione è stato centrifugato e il surnatante aspirato. Alla fine della procedura il campione è stato portato a secco per eliminare l'acetone.

2.2.7 Elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di sodio-dodecil-solfato (SDS-PAGE)

Le proteine a più alto peso molecolare sono state separate tramite elettroforesi su un gel polimerizzato di acrilammide al 12%, in grado di separare proteine da 200-9 kDa, in

56 presenza di un agente denaturante, il sodiododecil-solfato. Grazie all’SDS, si impedivano le interazioni chimiche intracatena responsabili della struttura tridimensionale e dell’associazione di più subunità polipeptidiche in proteine multimeriche; il detergente inoltre conferiva carica negativa a tutte le proteine della miscela. I gel di acrilammide sono stati preparati facendo copolimerizzare l’acrilammide in presenza di piccole quantità di N,N’metilenbisacrilammide (due molecole di acrilammide unite da un gruppo metilenico) in modo da ottenere un gel a struttura ben definita grazie alla formazione di legami crociati tra la bisacrilammide e l’acrilammide; alla soluzione di acrilammide e bisacrilammide è stato aggiunto il catalizzatore della reazione, la N,N,N’,N’-tetrametiletilendiammina (TEMED), e un iniziatore della reazione, il persolfato di ammonio (APS). La reazione è una polimerizzazione radicalica: il TEMED decompone l'APS dando origine ad un radicale libero che si lega ad una molecola di acrilammide innescando la polimerizzazione. I gel da 0,75 mm erano composti da due porzioni: running gel e stacking gel. Sono stati preparati, in un primo momento, 15 mL di running gel al 12% (Tabella 6).

Running gel 12% Sostanza Volume (mL) H2O MilliQ 4,9 Acrilammide mix 30% 3,8 Tris 1,5 M pH 8,8 6 SDS 10% 0,15 APS 10% 0,15 TEMED 0,006

Tabella 6: Preparazione del running gel al 12% per SDS-PAGE.

Il running gel è stato colato tra i due vetri con un'altezza di circa 10 cm, ed è stato poi ricoperto con uno strato di butanolo.

57 Stacking gel 5% Sostanza Volume (mL) H2O MilliQ 2,7 Acrilammide mix 30% 0,67 Tris 0,5 M pH 6,8 0,5 SDS 10% 0,04 APS 10% 0,04 TEMED 0,004

Tabella 7: Preparazione dello stacking gel al 5% per SDS-PAGE.

Una volta polimerizzato il running gel, è stato lavato via il butanolo, colato lo stacking gel, alto circa 1 cm, e inserito un pettinino da 0,75 mm tra i due vetri, per la creazione dei pozzetti.

La corsa elettroforetica è stata eseguita utilizzando come tampone di corsa il running buffer 1X, ottenuto dalla diluizione del running buffer 10X (Tris 25 mM, glicina 192 mM e SDS 0,1%, H2O a volume).

Gli standard sono stati solubilizzati per 30 minuti nel Laemmli buffer 1X (β- mercaptoetanolo 0,7 M, Tris-HCl 0,5 M pH 6.8, SDS 20%, glicerolo 10%, blu di bromofenolo come tracciante della corsa elettroforetica e H2O a volume).

Gli standard sono stati preparati come segue:

 BSA + inibitore della tripsina + FITC (1,5 µlstd bsa + 1,5 µlstd inib trips + 18,5

µllaemmli 1x);

 adenosina deaminasi + FITC (3 µlstd + 17 µllaemmli 1x).

Il campione è stato solubilizzato con 20 µl di Laemmli buffer 1X per 30 minuti.

La corsa elettroforetica è stata effettuata mantenendo un voltaggio costante durante tutta la durata della corsa e variando l'amperaggio: i primi quindici minuti è stato impostato un amperaggio di 8 mA per gel e poi è stato aumentato a 20 mA per gel.

La corsa è stata interrotta quando la linea colorata blu dei campioni raggiungeva il fronte del gel. La corsa è durata 56 minuti.

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2.2.8 Elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di tricina e sodio-dodecil- solfato (Tricina-SDS-PAGE)

Le proteine a più basso peso molecolare sono state separate tramite tricina-SDS-PAGE. Sono stati preparati gel da 0,75 mm formati da tre fasi: running gel (16.5%) (Tabella 8), spacer gel (10%) (Tabella 9) e stacking gel (4%) (Tabella 10).

Running gel 16.5% Sostanza Volume (mL) H2O milliQ 0,2 Acrilammide mix (32:1) 5,5 Tris 1 M pH 8,45 3,3 glicerolo 1 (1,25 g) APS 10% 0,0333 TEMED 0,0033

Tabella 8: Preparazione del running gel al 16.5% per Tricina-SDS-PAGE.

Spacer gel 10% Sostanza Volume (mL) H2O milliQ 3,4 Acrilammide mix (32:1) 3,3 Tris 1 M pH 8,45 3,3 APS 10% 0,05 TEMED 0,005

Tabella 9: Preparazione dello spacer gel al 10% per Tricina-SDS-PAGE.

Stacking gel 4% Sostanza Volume (mL) H2O milliQ 3,2 Acrilammide mix (32:1) 0,8 Tris 1 M pH 8,45 2 APS 10% 0,045 TEMED 0,0045

Tabella 10: Preparazione dello stacking gel al 4% per Tricina-SDS-PAGE.

Per prima cosa sono stati colati il running gel e lo spacer gel, dopo la polimerizzazione è stato colato lo stacking gel.

59 I campioni sono stati solubilizzati per 30 minuti circa in 20 µl di una soluzione contenente 490 µl di Sample Buffer Tricine 1X, (Tris-HCl 0.5 M pH 6.8, glicerolo 40%, SDS 10% Coomassie Blue G-250 0.04%) 10 µl di β-mercaptoetanolo e 500 µl di acqua milliQ.

Lo standard utilizzato era una miscela di sei proteine a peso molecolare noto:

 26.6 kDa;  16.9 kDa;  14.4 kDa;  6.5 kDa;  3.5 kDa;  1.4 kDa.

E' stata preparata la soluzione standard buffer con 44 µl TRIS-TRICINA standard buffer (Tris-HCl 0.5 M pH 6.8, glicerolo 24%, SDS 10%, Coomassie Blue G-250 quanto basta per colorare la soluzione di blu) e 1 µl di β-mercaptoetanolo. Lo standard è stato preparato solubilizzando 0.5 µl di standard in 19.5 µl di standard buffer. Lo standard è stato bollito per 5 minuti.

La corsa cromatografica è stata effettuata utilizzando un tampone di corsa a pH 8.3 (Tris 0.1 M, Tricina 0.1 M, SDS 0.1%).

La corsa cromatografica è stata effettuata in ghiaccio ed è durata 3 ore. Parametri della corsa elettroforetica:

Step 1: 30 V per 20 minuti; Step 2: 100 V per 1 ora; Step 3: 300 V per 3 ore.

Il gel è stato acquisito in fluorescenza. Inoltre per riuscire a vedere anche lo standard non marcato con la fluoresceina, il gel è stato colorato con il Blue Coomassie.

Per prima cosa è stata aggiunta la soluzione di fixing per 30 minuti (metanolo 40% e acido acetico 10%); poi il gel è stato lasciato nella soluzione di colorazione Coomassie

60 Blue G-250 (acido acetico 10% e Coomassie Blue G-250 0,025% (p/v)) per un'ora. Infine il gel è stato decolorato con la soluzione di decolorazione (acido acetico 10%) effettuando tre lavaggi da 15 minuti ciascuno.

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Capitolo 3

Risultati e discussioni

3.1 Marcatura delle proteine salivari con FITC

In letteratura sono presenti numerosi lavori sulla marcatura di singole molecole con fluoresceina isotiocianato, in particolare Ying Xie e colleghi [69] hanno sviluppato un metodo di marcatura del fibrinogeno porcino che prevedeva la marcatura a temperatura ambiente per un tempo pari a quattro ore.

In questo lavoro di tesi, sono state confrontate le procedure A e B, con lo scopo di individuare il miglior protocollo per avere la maggiore quantità di proteine marcate nel nostro campione. Entrambe le procedure, prevedono di lavorare a temperatura ambiente, variando il tempo di esposizione del campione proteico con la FITC, per 4 ore (protocollo A) e 24 ore (protocollo B).

La Figura 23, mostra i cromatogrammi sovrapposti di un campione di saliva marcato con FITC per 4 ore (blu) per 24 ore (rosso). Il picco a 25.19 min, è il picco caratteristico della FITC che non ha reagito. Come si può vedere dai cromatogrammi, aumentando il tempo di esposizione del campione proteico con la FITC, aumenta l’intensità del segnale e quindi la quantità di proteine marcate. Inoltre, l’intensità del picco della FITC per la saliva marcata per 24 ore è meno intenso del picco della saliva marcata per 4 ore, confermando che all’aumentare del tempo di marcatura, diminuisce la quantità di FITC non reagita.

62 Figura 23: Cromatogrammi della saliva marcata con FITC per 4 ore (blu) e per 24 ore (rosso).

1: picco FITC.