Rilievi eseguiti in laboratorio

2.5.1 Determinazione dei parametri pomologici

La percentuale di sovraccolore, è stata valutata per differenza tra l’area totale del frutto e quella interessata dalla presenza di sovraccolorazione. La presenza di danni da Carpocapsa è stata quantificata attraverso una valutazione visiva che ha preso in considerazione il numero di punture sulla singola mela.

Per determinare la misura dei frutti è stato utilizzato un calibro digitale ed è stato registrato il diametro su asse longitudinale. L’analisi del contenuto dei solidi solubili è stata effettuata mediante un rifrattometro portatile (modello 101ATC) e il contenuto di solidi solubili è stato espresso in gradi Brix. Il rifrattometro si basa sul principio per cui l’indice di rifrazione di un liquido contente zuccheri o altri solidi è proporzionale alla sua concentrazione. Per ottenere tale misura due gocce di succo, ottenute spremendo una frazione di polpa delle cultivar considerate, sono state poste sul prisma principale e puntando verso una fonte luminosa, si è annotato il valore dato dalla linea di confine tra il bianco e il blu all’interno dell’oculare.

La misurazione della durezza della polpa è stata determinata utilizzando un penetrometro. Il test penetrometrico riguarda la misura della forza necessaria per penetrare con una punta metallica la polpa del frutto. La misura è stata eseguita, previa asportazione della buccia, sulla faccia della zona equatoriale del frutto utilizzando un penetrometro Fruit pressure tester (modello FT327) dotato di un puntale di 11 mm.

Per determinare il peso fresco, i frutti campionati sono stati pesati, dopo separazione di polpa, buccia e columella, mediante una bilancia analitica da laboratorio. Allo stesso modo è stato registrato il peso secco, dopo che le diverse parti del frutto (polpa, buccia, columella) hanno subito una disidratazione in stufa a 65 °C fino a raggiungimento di peso costante (Figura 24).

In concomitanza con il campionamento dei frutti in laboratorio, si è provveduto a misurare l’acidità titolabile di polpa e columella mediante pHmetro Hanna instruments (modello HI8417). Per entrambe le sezioni del frutto è stato impiegato 1 g di campione fresco successivamente omogenato con 30 mL di acqua distillata e inserito in un becher dotato di ancoretta magnetica; questo è stato posto su agitatore e titolato mediante una soluzione di NaOH 0,1 N fino al raggiungimento del valore pH 8. Sono stati

Figura 24 – Preparazione campioni per analisi della sostanza secca.

2.5.2 Determinazione del contenuto in fenoli, antociani, carotenoidi e clorofille totali

Su campioni di frutta congelati sono state effettuate le analisi del contenuto totale di antociani, clorofille, carotenoidi, flavonoidi, fenoli e la capacità antiossidante totale. La valutazione di questi parametri è stata effettuata mediante un’analisi spettrofotometrica. Di seguito sono riportate le analisi effettuate in laboratorio con i relativi protocolli impiegati.

Estrazione e contenuto in fenoli

La determinazione della concentrazione in fenoli totali è stata eseguita seguendo il protocollo proposto da Dewanto et al. (2002). L’estrazione del materiale vegetale è stata eseguita prelevando circa 100 mg di polpa dai campioni poi omogenizzata con 1 mL di una soluzione acquosa costituita da metanolo all’ 80%. L’omogenato ottenuto è stato inserito in appositi tubi falcon e sottoposto ad ultrasuoni per 30 minuti ad una temperatura di 15 °C e successivamente centrifugato a 10.000 rpm per 15 minuti, alla temperatura di 4 °C. Infine, si è prelevato e sottoposto il surnatante (estratto fenolico) ad una filtratura con filtri per HPLC con pori di diametro 0,45μm. Per la lettura dei composti fenolici si sono impiegate cuvette monouso per l’UV visibile, in cui all’interno vengono inseriti 5 µL di estratto fenolico, poi additivati con 120 µL di H2O distillata, per ottenere un totale di 125 µL di soluzione ai quali aggiungere

ulteriori 125 µL di reagente di Folin-Ciocalteau. Il tutto viene agitato ed incubato per 6 minuti a temperatura ambiente. Al termine di questa fase si aggiungono 1,25 mL di NaHCO3 al 7%, per arrivare

ad ottenere un volume totale di 1,5 mL. Il campione è poi lasciato in incubazione, al buio, a temperatura ambiente per 90 minuti. La preparazione del bianco è la medesima, ma con l’unica differenza che i 125 µL iniziali sono costituiti esclusivamente da H2O distillata. Al termine dell’incubazione si procede

alla determinazione spettrofotometrica, effettuata mediante Ultrospec 2100 pro, della reazione colorimetrica sviluppata in seguito all’interazione tra l’estratto analizzato ed il reagente di Folin-

Ciocalteau, ad una lunghezza d’onda di 760 nm. Il calcolo del contenuto in fenoli totali è determinato

utilizzando una curva di taratura, ottenibile adoperando concentrazioni note di acido gallico (0-600 µg). L’equazione della curva è la seguente:

y = 0,0932 x + 0,0078

In questo caso y rappresenta l’assorbanza alla lunghezza d’onda considerata (760 nm) ed x i microgrammi di acido gallico. Alla base di questa metodologia c’è il principio secondo il quale il reagente di Folin-Ciocalteau è formato da due complessi acidi: fosfo-molibdeno e fosfo-tungsteno. I composti fenolici se immessi in ambiente basico subiscono ossidazione da parte dei metalli di molibdeno e tungsteno presenti nei complessi, arrivando ad assumere una colorazione bluastra dovuta alla riduzione dei sopracitati metalli. I valori finali della determinazione sono stati espressi in mg di acido gallico g-1 _PF.

Estrazione e contenuto in antociani

La determinazione della concentrazione in antociani totali è stata eseguita seguendo il metodo del pH differenziale proposto da Giusti e Wrolstad (2001). La prova ha riguardato i campioni di Red Chief sotto e fuori copertura, a tre diversi tempi di conservazione. Vengono prelevati 100 mg di buccia dai campioni di mele e omogenizzati in eppendorf a bagno in azoto liquido. Successivamente vengono addizionati 1 ml di metanolo acidificato 1% con HCL (MeOH:HCL v/v). L’omogenato così ottenuto viene centrifugato a 10.000 rpm per 10 minuti. Vengono preparate due soluzioni buffer 0.025 M di cloruro di potassio (pH 1.0) e 0.4 M buffer sodio acetato (pH 4.5). La soluzione buffer 0.025 M di cloruro di potassio si prepara unendo in un becher 1.86 g di KCL e 980 ml di acqua distillata. Dopo aver misurato il pH e regolato a 1.0 con HCl concentrato, la soluzione viene trasferita in un matraccio tarato da 1 litro e riempito fino a 1 litro con acqua distillata. Invece, per la soluzione buffer 0.4 sodio acetato in un becher vengono uniti 54.43 g di CH3CO2Na⋅3 H2O e 960 ml di acqua distillata. Si esegue

la misura del pH che viene regolato a 4,5 con HCl concentrato e si procede come nella soluzione buffer precedente. In due cuvette vengono preparati 100 μL di campione da diluire con 900 μL di ciascun

A= (A530 – A700)pH 1.0 – (A530 – A700)pH 4.5

Quantità di antociani (mg/g) =((A x MW x DF)/ ꜫ x 1)/(gcampione x mlutilizzati come estraente)

con:

ꜫ Cyd-3-glu = 34300 L mol-1 cm-1

MW Cyd-3-glu = 484.83 g/mol

DF = fattore di diluizione

Lo standard di riferimento (o bianco) è realizzato contro acqua sia alla lunghezza 530 che 700 nm.

Figura 25– Procedura di estrazione di antociani.

Estrazione e contenuto in clorofille e carotenoidi

La determinazione della concentrazione in clorofille e carotenoidi è stata eseguita seguendo il protocollo proposto da Porra et al. (1989). La prova ha riguardato solo i campioni di Golden Delicious sotto e fuori copertura, a tre diversi tempi di conservazione. Anche in questo caso, il procedimento è stato ripetuto 3 volte per ogni T considerata. Vengono prelevati e inseriti in eppendorf 100 mg di buccia dai campioni di mele e addizionati 500 µL per volta di acetone 80% (circa 3 volte per un volume totale di 1.5 mL). L’omogenato viene centrifugato con centrifuga da tavolo a 7.000 rpm per 3 minuti e successivamente viene recuperato il surnatante con capillare e immesso in un cilindro graduato da 10 mL. Successivamente il pellet viene risospeso in acetone 80% (da 0.5 a 1 mL) e centrifugato come descritto sopra fino a quando il pellet non sarà completamente scolorito e privo di pigmenti. Al termine di tutti i lavaggi viene annotato il volume finale di ogni campione che è presente nel cilindro graduato da 10 mL. Questo servirà alla fine per calcolare la concentrazione delle clorofille e dei carotenoidi nel

materiale vegetale di partenza. La lettura allo spettrofotometro viene eseguita con cuvette al quarzo per l’aggressività dell’acetone. Si otterrà un assorbimento preferenziale di clorofilla a, clorofilla b e carotenoidi rispettivamente alla lunghezza d’onda di 663 nm, 648 nm e 470 nm.

2.5.3 Determinazione della capacità ossidante

Per determinare il potere antiossidante di un estratto vegetale si utilizzano metodi che prevedono l’impiego di radicali liberi stabili. Il metodo qui utilizzato per calcolare la capacità antiossidante consiste nella determinazione del potere antiossidante mediante saggio DPPH (2,2-difenil-1- picrilidrazile). Gli estratti utilizzati per determinare la capacità antiossidante sono gli stessi utilizzati per la determinazione dei fenoli. Il protocollo seguito trova le sue basi nel metodo impiegato e descritto da Brand-Williams et al. (1995). Inizialmente si aggiungono a ciascun campione 10 μL di estratto vegetale (ottenuto con il metodo descritto per i fenoli totali) e 990 μL di una soluzione di DPPH 3,12 x 10-5 _{M (2,4 mg in 200 mL di MeOH 80%), portando il volume totale ad 1 mL inserito all’interno di}

cuvette del visibile; a questo punto il campione viene agitato e posto in incubazione al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. La preparazione del bianco avviene sostituendo ai 10 μl dell’estratto la stessa quantità di soluzione di DPPH. Al termine dell’incubazione si procede con la lettura di assorbanza (ABS) allo spettrofotometro (Ultrospec 2100 pro) alla lunghezza d’onda di 515 nm, con l’obbiettivo di determinare la concentrazione del radicale DPPH rimasto allo stato ossidato (ancora potenzialmente nocivo per la cellula). Il calcolo della percentuale di inibizione è determinato con i dati ottenuti mediante la seguente formula:

%Inibizione = [(ABS Bianco - ABS Campione) / ABS Bianco] x 100

Il valore ottenuto è poi sostituito alla curva di taratura del Trolox, un analogo della vitamina E, utilizzato come standard di riferimento:

y = 6,0423 x + 0,7836

Il risultato della precedente equazione rileva la concentrazione di equivalenti di Trolox (TE) espressa in µM; tenendo conto del peso fresco (PF) del campione e del fattore di diluizione; la capacità antiossidante è stata espressa in mg TE/g PF.