L’olio di oliva è uno dei componenti principali della dieta mediterranea. Da tempo sono noti gli effetti benefici dati dal consumo nella dieta dell’olio d’oliva in gran parte imputabili all’alto contenuto di fenoli e polifenoli. Tali effetti riguardano la protezione verso l’insorgenza di malattie cardiovascolari, infiammatorie croniche e neurodegenerative.
Questo lavoro di tesi nasce dalla collaborazione con il gruppo di biochimica-nutraceutica della Prof.ssa S. Hrelia dell’ Università di Bologna ed il gruppo di ricerca di Chimica Farmaceutica del Prof. M. Macchia dell’Università di Pisa. Utilizzando una linea cellulare neuronale le SH-SY5Y, il gruppo di ricerca bolognese ha testato gli effetti sulla vitalità, sui livelli di ROS e GSH intracellulari degli estratti di quattro oli di oliva, opportunamente preparati dal gruppo di ricerca del Prof.
Macchia, provenienti dall’Alta Versilia (cultivar Quercetana e Corniolo) e da Saturnia (risultante da tre cultivar Olivastra, Moraiola e Raggia). Nel caso della cultivar quercetana sono stati testati due oli di oliva che differivano per la preparazione (tipologia frantoio) e per la localizzazione delle piante (collina, pianura). Più precisamente è stato utilizzato un frantoio a due fasi (località Massarosa) per la spremitura delle olive quercetana pianura e un frantoio a tre fasi (località Caniparola) per le olive quercetana collina.
Come riportato in tabella 2 i quattro oli di oliva sono stati caratterizzati per quanto riguarda il contenuto in fenoli/polifenoli e più precisamente per la composizione in tirosolo, idrossitirosolo, oleuropeina ed oleocantale. Sempre in tabella sono riportate le quantità totali di fenoli per grammo di estratto. Con la procedura di estrazione utilizzata, la quantità di estratto che si ottiene partendo dall’olio di oliva espresso come percentuale è di circa l’1% (p.e. da 3 g di olio si ottengono circa 30 mg di estratto).
Tabella 2: Caratterizzazione della composizione chimica degli estratti degli oli di oliva utilizzati
nel trattamento delle cellule.
Estratti µg tirosolo/ mg estratto µg idrossitirosolo/ mg estratto µg oleaceina/ mg estratto µg oleocantale/ mg estratto µg fenoli/ g olio Corniolo 0,54 0,05 1,11 1,34 0,026 Quercetana_Collina 0,15 0,06 5,31 7,55 0,143 Quercetana_Pianura 0,26 0,31 15,30 8,68 0,417 Spes 1,12 0,6 40,76 48,74 0,860
Dai saggi di vitalità su cellule neuronali differenziate SH-SY5Y, condotti dal gruppo della Prof.ssa Hrelia, è stato possibile notare un effetto positivo con incrementi significativi sulla vitalità, che si aggiravano intorno ad un 30-40% nei diversi oli di oliva, fino alla concentrazione di 100 µg/ml (Figura 28). A più alte concentrazioni si evidenzia uno spiccato effetto inibitorio.
Figura 28: Test di vitalità cellulare sulla linea SH-SY5Y trattata con concentrazioni crescenti di
olio per 24 ore. Come mostrano gli istogrammi il trattamento con elevate concentrazioni di estratto riduce notevolmente la vitalità
Alla luce di questi risultati preliminari, lo scopo del mio lavoro di tesi è stato quello di valutare se questi estratti di oli di oliva saggiati ad un concentrazione biodisponibile (10 µg/ml) alterassero i profili di espressione proteica delle cellule neuronali al fine di evidenziare eventuali bersagli proteici specifici o vie di segnalazione coinvolte nella loro azione. Le cellule SH-SY5Y
differenziate con acido retinoico venivano portate ad una condizione di subconfluenza per essere poi esposte a 10 µg/ml di olio di oliva per 24 ore in un mezzo contenente basse concentrazioni (1%) di FBS. Al termine del periodo di trattamento le cellule venivano staccate, centrifugate e le proteine opportunamente estratte venivano utilizzate per l’analisi proteomica. Abbiamo utilizzato un
approccio proteomico in cui la separazione delle proteine è stata eseguita tramite elettroforesi bidimensionale.
In Figura 30 è riportata un’immagine rappresentativa del profilo proteico ottenuto da cellule di controllo cioè a cui era stato addizionato al mezzo di coltura solo dimetilsulfossido (DMSO), il solvente utilizzato per risospendere gli estratti.
Figura 30: Pattern proteico bidimensionale (2D-GE) caratteristico di cellule di neuroblastoma
SH-SY5Y incubate in mezzo di coltura contenete DMSO (controllo).
Per l’analisi comparativa sono stati analizzati tre replicati biologici per ogni trattamento, ciascuno condotto in doppio. L’analisi è stata eseguita con il programma Same Spots (TotalLab) che confronta i profili di espressione ottenuti utilizzando algoritmi in grado di valutare la variabilità intraclasse ed interclasse. L’applicazione di un test statistico di analisi della varianza (ANOVA) ci
3
pH NL
10
10kDa
95kDa
ha permesso di individuare 36 spots che risultano differenzialmente espressi in modo significativo con valori di p value <0.05. In Tabella 3 è riportato l’elenco con il numero dello spot, l’entità più alta di variazione di espressione ed il valore di p.
#spot Anova
(p) Fold Average Normalised Volumes
CTRL Collina Corniolo Pianura SPES 1196 5,12E-13 11,2 7,53E+06 9,11E+06 1,52E+06 8,12E+05 8,68E+06 1343 2,91E-12 9,6 5,33E+05 2,55E+06 4,79E+06 5,13E+06 1,96E+06 2194 7,57E-12 3,2 8,48E+06 2,69E+06 4,04E+06 3,59E+06 5,38E+06 4060 1,01E-10 2,2 6,55E+06 5,30E+06 3,91E+06 2,93E+06 5,51E+06 2592 1,35E-10 3,6 2,81E+06 6,18E+06 3,92E+06 1,71E+06 5,61E+06 1677 5,14E-10 2,5 1,13E+07 2,26E+07 1,97E+07 1,38E+07 2,84E+07 2898 5,49E-10 3,9 2,22E+06 8,69E+06 4,23E+06 2,93E+06 8,15E+06 4072 7,53E-10 3,5 2,49E+06 8,09E+06 7,68E+06 8,80E+06 6,47E+06 1728 1,13E-09 1,9 4,24E+06 6,64E+06 5,09E+06 5,73E+06 8,19E+06 1854 1,15E-09 3,8 3,49E+06 1,29E+07 1,08E+07 1,34E+07 8,11E+06 1491 1,20E-09 3,4 9,69E+05 2,02E+06 2,07E+06 3,30E+06 1,56E+06 1483 1,62E-09 2 1,91E+06 3,75E+06 3,49E+06 3,79E+06 3,87E+06 1467 1,83E-09 3,4 1,79E+06 1,84E+06 3,32E+06 4,12E+06 1,21E+06 1752 2,19E-09 2 6,29E+06 1,03E+07 1,29E+07 1,15E+07 1,11E+07 1654 2,75E-09 4,3 5,17E+06 4,58E+06 3,07E+06 1,83E+06 7,80E+06 4069 3,54E-09 2,2 5,90E+06 2,92E+06 5,48E+06 3,90E+06 6,48E+06 2763 9,25E-09 5,8 4,42E+06 8,40E+05 1,18E+06 1,49E+06 7,68E+05 1227 1,71E-08 2,5 6,38E+06 1,58E+07 1,47E+07 1,15E+07 1,14E+07 2890 1,04E-07 19 1,14E+06 4,63E+05 1,04E+06 8,63E+05 8,80E+06 3183 1,16E-07 1,4 2,54E+07 1,88E+07 2,09E+07 1,89E+07 2,69E+07 1327 1,40E-07 1,9 3,72E+06 6,91E+06 6,63E+06 4,83E+06 6,34E+06 1951 1,55E-07 2,3 3,28E+06 6,66E+06 4,99E+06 5,69E+06 7,47E+06 1127 9,70E-07 6,2 1,73E+06 1,69E+06 2,81E+05 3,15E+05 1,57E+06 4066 1,97E-06 2,3 3,14E+06 2,84E+06 2,42E+06 1,42E+06 3,32E+06 1848 2,35E-06 2,2 2,94E+06 5,85E+06 5,50E+06 6,55E+06 4,12E+06 3166 2,59E-06 1,5 1,39E+07 1,40E+07 1,30E+07 1,23E+07 1,83E+07 1784 2,93E-06 4,8 1,74E+06 2,52E+06 7,26E+06 7,40E+06 1,53E+06 1988 3,18E-06 11,6 9,47E+05 4,49E+06 1,10E+07 8,39E+06 3,48E+06 1415 7,56E-06 1,7 3,13E+06 3,42E+06 2,17E+06 2,00E+06 2,24E+06 1046 1,13E-05 1,8 1,26E+06 1,43E+06 8,99E+05 1,04E+06 1,58E+06 2000 4,77E-05 1,5 9,39E+06 7,92E+06 7,38E+06 6,08E+06 7,08E+06 1998 5,87E-05 5,2 2,04E+06 5,20E+06 1,05E+07 8,75E+06 3,24E+06 1637 2,90E-04 2,4 3,55E+06 7,35E+06 8,47E+06 4,88E+06 4,30E+06 1798 9,80E-04 9 4,50E+05 2,20E+06 4,05E+06 2,34E+06 2,19E+06 1774 0,004 4,3 7,91E+05 2,86E+06 3,39E+06 2,47E+06 1,22E+06
In figura 31 sono riportate le immagini ingrandite di alcuni spots differenzialmente espressi nelle diverse condizioni.
Figura 31: Immagini ingrandite degli spots differenzialmente espressi
Gli spots di interesse sono stati quindi tagliati, le proteine estratte e digerite con tripsina ed inviate all’analisi di spettrometria di massa e sono attualmente in corso di identificazione. Tuttavia sulla base di un lavoro condotto precedentemente e in cui è stato valutato l’effetto dell’oleocantale sull’espressione delle proteine delle cellule SH-SY5Y, possiamo avanzare un’identificazione per alcuni di questi spots. Infatti dalla comparazione dei pattern proteici gli spots 1196, 1343, 1677, 4072 e 1848 corrispondono rispettivamente alle proteine Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H1 (HNRNPH1), vimentina (VIM), Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 (HNRNPA1), Cofilina 1 (COF1) e piruvato chinasi (PKM). Queste proteine mostravano una variazione dei loro
# 1848
# 4072
# 1677
livelli di espressione in seguito al trattamento delle cellule SH-SY5Y con il solo oleocantale (10 µM).
Da un punto di vista funzionale le proteine potenzialmente coinvolte sono collegate ad un aumento della vitalità cellulare alla concentrazione che abbiamo testato. Allo stesso tempo tutti gli oli di oliva testati sono in grado di influenzare positivamente la vitalità cellulare come dimostrato in Figura 32.
Tuttavia concentrazioni da 1 a 10 µM di oleocantale, come evidenziato da precedenti risultati, non hanno alcun effetto positivo sulla vitalità delle cellule SH-SY5Y (Figura 32).
Figura 32: Confronto nei test di vitalità cellulare della linea SH-SY5Y trattata con diverse
concentrazioni di oleocantale ed il controllo.
Al fine di valutare per queste proteine come cambiassero i livelli e gli andamenti di espressione prodotti dall’effetto di un solo fenolo (oleocantale) e dall’insieme dei componenti dell’olio di oliva, in figura 33 è riportato l’istogramma che mette a confronto le ratio (densità ottica spots olio densità ottica spots controllo) dei diversi oli di oliva con quella ottenuta, in precedenza, per l’oleocantale.
Figura 33: Istogramma che mette a confronto le ratio dei diversi oli di oliva e quella
dell’oleocantale.
Da questa prima osservazione risulta evidente che l’effetto degli oli di oliva sull’espressione delle proteine funzionalmente coinvolte nella vitalità cellulare, è maggiore rispetto a quello prodotto dall’oleocantale. Probabilmente altri fenoli e polifenoli o forse la sinergia di più costituenti possono giocare un ruolo importante.
Questa osservazione richiede di essere ulteriormente investigata ed unita ai risultati che deriveranno dall’identificazione degli spots differenzialmente espressi, aggiungerà importanti informazioni sul
panel di proteine coinvolte e sulle funzioni biologiche che vengono influenzate dall’utilizzo
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