La serie MCF10A acquisisce caratteristiche di “un microambiente Basal-like” in fase di DCIS
Ogni linea cellulare nel pannello isogenico MCF10, ha avuto una risposta distinta alla co- coltura con fibroblasti di riduzione mammoplastica (RMF). Attraverso un SAM multiclasse (analisi significativa di microarray) abbiamo individuato circa 700 geni, poiché differentemente espressi lungo queste tre linee cellulari. Un set di geni è stato particolarmente upregolato in cellule MCF10DCIS, e non in cellule MCF10A o MCF10AT1. Questo gruppo di geni è stato analizzato mediante IPA ( Pathway Analysis Ingenuity) e i risultati suggeriscono processi di risposta immunitaria e disordini del tessuto connettivo, come il traffico delle cellule immunitarie, la risposta immunitaria cellulo- mediata, oppure segnali di risposta in fase acuta. Molti di questi processi sono stati upregolati anche in tumori al seno Basal-like infiltranti in co-colture dirette. È stato utilizzato un set di geni (identificati da Camp e la sua equipe), per testare direttamente se le co-colture abbiano up-regolato le caratteristiche di microambiente Basal-like. Questa “signature” (firma molecolare) può distinguere in vitro le co-colture Basal-like da quelle Luminali, ed è inoltre in grado di distinguere in vivo i tumori Basal-like da quelli Luminali. Utilizzando questa signature è stato calcolato un valore per ogni campione, denominato “valore d’interazione Basal-like” .
Le cellule MCF10DCIS avevano un valore d'interazione Basal-like elevato, simile a quello della linea cellulare del cancro al seno infiltrante Basal-like SUM149.
35 Al contrario, le co-colture di cellule precancerose MCF10AT1 e MCF10A mostravano valori d’interazione Basal-like debolmente positivi e la linea cellulare MCF7 Luminale mostrava un valore negativo. Sono state effettuate correlazioni di Pearson anche per le monocolture e le co-colture indirette, di queste stesse linee cellulari. La correlazione osservata in co-colture indirette seguiva la stessa tendenza di quella osservata in co-colture dirette, anche se il valore Basal-like era in qualche modo attenuato. Data la diluizione e la diffusione dei segnali secreti, era prevedibile questo risultato. Nelle cocolture indirette, i segnali provenienti dai fibroblasti sono diluiti in grandi volumi del mezzo, mentre in co- colture dirette, la dipendenza cineticha di diffusione e la stabilità della proteina è ridotta. A differenza degli effetti inibitori della membrana basale sulla segnalazione cellulare, che non vengono simulati né dalle co-colture dirette, che da quelle indirette; la segnalazione cellula-cellula può essere affrontata con notevoli vantaggi in co-colture dirette, in particolare se si considerano gli effettori con breve emivita. Pertanto, tutti i dati di co- coltura derivano da co-colture dirette, se non diversamente specificato.
Upregulation di citochine secrete in co-colture di fibroblasti MCF10DCIS
Stabilito che i microambienti Basal-like sono indotti da fattori solubili, abbiamo cercato di identificare i mediatori secreti. Ottanta citochine e chemochine sono state misurate nei
36 mezzi di coltura delle co-colture dirette. Un aumento impressionante del numero di citochine espresse si è verificato nelle cocolture MCF10DCIS, con un totale di 62 citochine upregolate più di 1,5 volte. Al contrario, nelle cocolture MCF10A e MCF10AT1 sono state upregolate solo un piccolo numero di citochine.
La citochina con il valore più alto di upregulation nelle co-colture DCIS, era il fattore di crescita degli epatociti (HGF), che aumenta in modo monotonico da MCF10A a MCF10AT1, fino a MCF10DCIS ed è stato upregolato più di 80 volte nelle cocolture MCF10DCIS e più di 70 volte nelle cocolture MCF10AT1.
Quando la secrezione di HGF è misurata dalle co-colture, la fonte di HGF non è distinguibile. Pertanto, per identificare quale componente del sistema produce HGF, vengono misurati i livelli di RNA e proteine HGF intracellulari in ciascuna linea cellulare dopo 48 ore di co-coltura. HGF è esclusivamente prodotto dai fibroblasti. Le cellule epiteliali non avevano livelli rilevabili di trascrizione o proteine nelle monocoltura, tuttavia in co-coltura, alcune proteine HGF sono state osservate nelle cellule epiteliali, presumibilmente a causa di internalizzazione del complesso recettore-ligando. La secrezione e l’attivazione di HGF, sono eventi che fanno parte di una cascata complessa
37 che regola le azioni di HGF. Coerentemente con i risultati precedentemente pubblicati, si suggerisce che l’attività di HGF è regolata pericellularmente a livello proteico da HAI-1. Abbiamo trovato HAI-1 espresso in modo differenziale nella mappa di calore. HAI-1 inibisce l’ HGF- attivatore, inibendo così la stimolazione e la successiva funzione di HGF stesso. HAI-1 è stato espresso in quantità maggiore in cocolture MCF10A, e attraverso l’analisi array per le citochine, è stato associato a un’espressione minore di proteina HGF secreta. HGF è il principale ligando per il recettore tirosin-chinasico MET ed è anche un regolatore negativo della trascrizione MET. Per valutare se MET è presente in queste linee cellulari, e se i livelli del MET sono differenzialmente regolati in condizioni di co-coltura, abbiamo saggiato l’espressione del recettore nella serie MCF10, solo e in co-coltura nel corso di 48 ore. Sia a livello proteico che dell’ RNA, si è riscontrato che il contatto con i fibroblasti (6 ore), ha indotto le cellule MCF10DCIS ad upregolare notevolmente l’RNA MET.
Il picco dell’induzione di RNA dopo 6 ore è stato seguito dal picco dell’espressione proteica dopo 12 ore. Questo effetto non è stato osservato (in MCF10A) oppure è stato riscontrato in maniera notevolmente ridotta (in MCF10AT1) nelle altre due linee cellulari della serie. Così, l'interazione delle cellule MCF10DCIS con RMF in co-coltura, stimola un aumento della secrezione di HGF e un concomitante aumento dell'espressione del recettore HGF epiteliale, MET.
38 Una signature del gene HGF generato in vitro è correlata con i tumori basal-like
I nostri risultati di co-coltura hanno stabilito un aumento del fold-change (rapporto differenziale) della segnalazione HGF nei microambienti Basal-like precancerosi. Tuttavia, se questi cambiamenti sono essenziali per la cancerogenesi del tumore al seno basal-like, allora dovrebbero essere presenti anche nei tumori al seno Basal-like infiltranti. Per valutare questa ipotesi, è stata generata una signature HGF in vitro. Successivamente s’identificano i cambiamenti dell’espressione genica che si sono verificati in entrambe le monocolture MCF10DCIS trattate con rhHGF e le co-colture di MCF10DCIS con RMF. Questi geni HGF-regolati hanno maggiore probabilità di essere determinati con l’azione di HGF su MET in co-coltura. L’analisi IPA della signature HGF ha suggerito, tra le altre vie di segnalazione uparegolate dalla segnalazione HGF in co-colture, la Sonic Hedgehog Signaling, Basal Cell Carcinoma Signaling , e Tight Junction Signaling.
Usando questa signature abbiamo ottenuto 707 tumori infiltranti da tre set di dati indipendenti, avendo così un’alta o bassa correlazione con questa signature HGF.
L’86% dei tumori aggressivi Basal-like in questo set di dati sono positivamente correlati con la signature HGF, mentre solo il 23,6% dei tumori Luminal A presenta un’associazione positiva. Inoltre, il 40% di HER2-like e il 36% dei tumori Luminal B, entrambi i quali sono più aggressivi dei tumori Luminal A, sono stati positivamente associati con la signature HGF.
39 Inoltre, i pazienti Basal-like che sono positivi per la signature HGF, hanno una minore probabilità di sopravvivere. Questi risultati sottolineano l’importanza della segnalazione HGF nel cancro al seno aggressivo. Mentre i risultati sulla co-coltura dimostrano che la segnalazione HGF è già presente nella fase DCIS, l’importanza di questo pathway nella sopravvivenza dimostra che la disfunziona della regolazione del pathway HGF persiste nei tumori Basal-like infiltranti e contribuisce al loro sviluppo.
Il blocco di HGF inibisce tre morfogenesi dimensionali
I precedenti studi di co-colture Basal-like vs cocolture Luminal indicavano che la segnalazione di “fibrosi epatica”, è stata upregolata in co-colture Basal-like. Alla luce dei dati attuali che mostrano che le co-colture MCF10DCIS RMF hanno alti valori d’interazione Basal-like , che HGF è stato secreto/attivo in co-colture MCF10DCIS, e che la segnalazione HGF è notevolmente presente tra i tumori Basal-like infiltranti e che in generale è indice di sopravvivenza, sono stati impiegati gli anticorpi con target per HGF, per studiare il ruolo dell’HGF nel valore di interazione Basal-like e per i saggi di funzionalità morfogenica delle co-colture. In primo luogo, le co-colture MCF10DCIS RMF sono state incubate per 36 ore per permettere che s’instaurassero interazioni epitelio- stromali, e nelle ultime 12 ore sono stati aggiunti anticorpi anti-HGF ogni 2 ore.
È stata dunque osservata una riduzione dei valori d’interazione Basal-like, dovuta al trattamento anti-HGF. Mentre si osserva una variazione (dovuta a cause inspiegabili o casuali) dei dati nel tempo trascorso tra le 4, 8 o 12 ore dopo l’esposizione si hanno valori d’interazione Basal-like che vanno da negativo a leggermente positivo, è chiaro che in tutti e tre gli intervalli di tempo, il valore è drasticamente ridotto.
40 Saggi morfogenetici hanno dimostrato di tenere traccia del normale sviluppo fisiologico acinoso, come del potenziale patologico maligno delle cellule epiteliali.
I laboratori di Brugge e Bissell hanno caratterizzato lo sviluppo di strutture 3D nelle cellule MCF10A nel corso del tempo, individuando importanti meccanismi morfogenetici. Cioè, la morfogenesi rappresenta un equilibrio tra la varietà di processi fisiologici e patologicamente-rilevanti compresi la proliferazione, l’apoptosi e la migrazione cellulare. Sono stati applicati saggi di morfogenesi per sviluppare un quadro integrato di come i fenotipi cellulari chiave cambino con e senza la segnalazione HGF. In breve, il previsto sviluppo delle cellule MCF10A in 3D impone che per 6-8 giorni esse abbiano raggiunto la dimensione finale e saranno quindi avviate all’acquisizione di un lume delle cellule in posizione centrale attraverso l’apoptosi. Usando questo come metrica, sono state impiegate co-colture 3D di MCF10A e MCF10DCIS con RMF in un mix di Matrigel-collagene per due settimane. Le cellule sono state trattate in presenza o assenza di anticorpi anti-HGF e le strutture acinose risultanti sono state analizzate utilizzando due tecniche:
1) Optical Coherence Tomography (OCT) d’immagine longitudinale in due punti temporali (una settimana e due settimane)
2) la tradizionale colorazione H & E e IF per due settimane.
Per tracciare la morfogenesi di queste linee cellulari nel corso del tempo, abbiamo utilizzato OCT, che come precedentemente visto, permette di utilizzare l’immagine longitudinale 3D in vitro senza interruzione delle strutture acinose. Inoltre, con queste immagini si possono stimare le dimensioni delle strutture acinose e il loro lumen. Dopo aver contato 50 strutture per ogni condizione, non è stata osservata alcuna differenza complessiva delle dimensioni delle co-colture MCF10DCIS, con e senza trattamento con anticorpi anti-HGF. Tuttavia, il blocco HGF determina statisticamente una diminuzione significativa nella dimensione del lume.
41 Co-colture MCF10DCIS trattate con l’anticorpo anti-HGF sono più simili all’ MCF10A non maligna.
Il numero di strutture senza un lumen è alto in co-colture MCF10A, e simile in co-colture MCF10DCIS trattati con anti-HGF, mentre le co-colture MCF10DCIS non trattate sono progredite a formare un lume. Queste differenze non possono essere attribuibili a differenze nei tassi di proliferazione delle linee cellulari, perché i tempi di raddoppiamento della popolazione (PDT in co-colture indiretti 2D) sono molto simili; PDT di MCF10A e MCF10DCIS in co-coltura con RMF sono di rispettivamente 21,3 ore nella prima e 21,5 ore, nella seconda. Quando la segnalazione HGF è bloccata, questi tempi di duplicazione sono rispettivamente 21,6 ore e 21,0 ore. Così, i cambiamenti morfogenetici si verificano in assenza di significativi cambiamenti statistici nella proliferazione. Infine, le colorazioni di H & E sono state usate per misurare l’apoptosi. Contando la presenza di corpi apoptotici nei lumi, le strutture sono state classificate in base alla presenza o meno dei corpi apoptotici. Poiché l’apoptosi è il meccanismo mediante il quale si formano i lumen, ci si aspetterebbe che nelle cellule dove la formazione dei lumen non è ancora completa (MCF10A) , i livelli di apoptosi siano superiori in un determinato punto nel tempo. Infatti, come previsto, l’apoptosi è stata maggiore nelle co-colture di MCF10A rispetto alla
42 co-coltura MCF10DCIS e che il trattamento con anticorpi anti-HGF, ripristina livelli di apoptosi di MCF10, a quelli più simili a MCF10A. Prendendo complessivamente questi risultati, il trattamento con anti-HGF riporta le cellule MCF10DCIS a fenotipi morfogenetici che ricordano le cellule meno maligne (MCF10A), bloccando in tal modo un aumento del potenziale maligno mediato dal microambiente.