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INDICE
INTRODUZIONE ……….... 2
CAPITOLO I ………... 3
1.1 Interazioni competitive e pathway coinvolti ……….. 3
1.2 Soppressione neighbor ………. 15
1.3 Cancro ……….. 16
CAPITOLO II ……… 19
2.1 Topologia tissutale e dinamiche dominanti ………... 19
2.2 Interazioni cellulari e teoria dei giochi ………. 23
2.3 Organizzazione epiteliale e sviluppo del cancro ……….. 27
2.4 Prospettive per le dinamiche di rete ………... 29
CAPITOLO III ……….. 32
3.1 Interazioni competitive nel tumore al seno ………... 32
3.2 Risultati sperimentali ……… 34
3.3 Spiegazione ………...…... 42
CAPITOLO IV ………... 46
4.1 miRNA e competizione ……… 46
4.2 Visione dei risultati sperimentali ……….. 47
4.3 Discussioni ………... 58
CONCLUSIONI ………. 60
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INTRODUZIONE
All’interno dei tessuti la competizione cellulare s’innesca nel momento in cui cellule con differenti livelli di salute sono disposte nello stesso microambiente. Il risultato è l’eliminazione della popolazione più debole (danneggiata) attraverso l’apoptosi o senescenza, mentre la popolazione più forte (sana) sopravvive e prolifera. Descritte originariamente nello sviluppo del tessuto epiteliale, le interazioni competitive sono state collegate all’omeostasi tissutale, al controllo dimensionale degli organi e al mantenimento delle cellule staminali. Il coinvolgimento di numerosi geni correlati al cancro di questo fenomeno ha ispirato l’ipotesi di una potenziale connessione tra le interazioni cellulari competitive e il cancro. Anzi, studi iniziali hanno scoperto che i geni che promuovono i tumori possono far diventare le cellule “super-competitive”, in grado quindi di poter uccidere le normali cellule intorno a loro. Tuttavia, più recentemente è stato osservato che le cellule che hanno subìto alcune mutazioni cancerogene, possono essere eliminate dalle cellule normali. Questo suggerisce che le interazioni competitive potrebbero avere anche un ruolo tumore-soppressivo. In definitiva possiamo ritrarre la competizione cellulare in una cornice bellica in cui cellule tumorali e cellule ospite entrano in conflitto, e il cui esito può avere un profondo impatto sulla progressione della malattia.
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CAPITOLO I
1.1 Interazioni competitive e pathway coinvolti
Con l’avvento di pluricellularità, le cellule hanno acquisito sofisticati mezzi di comunicazione che permettono la specializzazione e il coordinamento delle attività per svolgere nuove funzioni. Allo stesso tempo, il comportamento cellulare si è evoluto per puntare principalmente verso il beneficio di tutto l’organismo piuttosto che delle singole cellule. Per esempio, l’apoptosi può essere innescata da infezioni virali per contenere la diffusione dei virus e la morte cellulare programmata è integrata in alcuni processi di sviluppo per consentire una rapido ed efficace rimodellamento tissutale. Allo stesso modo, è ormai noto che interazioni cellula-cellula consentono di vigilare sul livello di benessere delle singole cellule. In virtù di questo, si possono eliminare cellule ancora vitali, se esse sono percepite come quelle più deboli (meno sane) rispetto alle altre. Questo fenomeno fu descritto per la prima volta in studi fatti su Drosophila e venne denominato “Competizione Cellulare”. Si scoprì nel 1975, attraverso la caratterizzazione di difetti della crescita nelle cellule del disco immaginale (cellule quiescenti da cui originano i tessuti adulti) nelle ali di Drosophila, che presentavano mutazioni eterozigoti dette Minute . I geni M (Minute) codificano per subunità ribosomiali. Così le mutazioni omozigoti sono letali per la mancanza della funzionalità ribosomiale; tuttavia gli animali eterozigoti restano vitali e mostrano soltanto un ritardo nello sviluppo e delle anormalità morfologiche minori. Questi studi da parte di Morata, Ripoll e Simpson hanno dimostrato che quando l’eterozigote M minute e le cellule Wild-Type si trovano nello stesso tessuto, quest’ultime hanno la meglio. Quindi le cellule M che hanno una crescita più lenta vengono eliminate e il loro contributo nell’ala adulta è ridotto. Ciò ha suggerito che la competizione potrebbe agire come un sistema di sorveglianza verso le cellule difettose (mutanti), rimuovendole dal tessuto.
4 Nel 2004 Oliver e la sua equipe hanno riscontrato queste scoperte nel topo osservando una mutazione Minute (M). Questo ha fornito una prima indicazione sul fatto che il fenomeno di competizione cellulare visto in Drosophila, potesse accadere anche nei topi. Simili comportamenti cellulari sono stati riportati in risposta agli squilibri locali in numerose vie di segnalazione. Sebbene non sia del tutto chiaro se il denominatore comune dipenda da un unico macchinario molecolare, le interazioni competitive coinvolgono diversi pathway:
Myc
Myc fu la prima molecola identificata nella competizione cellulare corrispondente al proto-oncogene umano c-Myc. c-Myc è un regolatore trascrizionale, che promuove la crescita e la proliferazione cellulare ed è spesso sovraespresso in diversi tipi di tumore.
Johnstone riporta che in Drosophila le cellule con differenti livelli di espressione del fattore trascrizionale dMyc, potrebbero intraprendere la via della competizione. Le cellule con bassi livelli di dMyc a causa di una mutazione del gene corrispondente venivano eliminate in presenza delle cellule Wild-Type, ma rimanevano in vita tra di loro. Moreno e Basler in seguito hanno dimostrato che i cloni mutanti con alti livelli di espressine di dMyc riuscivano a competere con le cellule Wild-type, suggerendo che fossero proprio i livelli relativi di dMyc a decidere l’inizio della competizione. In altre parole l’inizio della competizione dipende dal contesto e le cellule diventano vincenti o perdenti a seconda dello stato di salute delle cellule vicine. Questo studio confermò il concetto della “super-competitività”: le cellule supercompetitive sono quelle capaci di competere con le normali wild-type. La scoperta delle cellule supercompetitive ha stabilito il collegamento iniziale tra competizione cellulare e cancro.
5 Quindi è stato intuito che allo stesso modo di Drosophila, le cellule cancerose con alti livelli di Myc potrebbero causare l’eliminazione delle cellule normali adiacenti, creando lo spazio per espandersi. In uno stato precanceroso, le cellule che hanno acquisito mutazioni preneoplastiche si espandono attraverso cloni. In questo modo si ottiene un terreno fertile, in cui l’insorgere di ulteriori mutazioni può avviare la crescita del cancro.
La ricerca recente ha migliorato la nostra comprensione dei meccanismi di concorrenza Myc-indotta. Interessante è il fatto che almeno parte della segnalazione tra le due popolazioni cellulari è mediata da fattori solubili. In un modello in vitro di Myc, le caratteristiche chiave della competizione possono essere riprodotte anche se le due popolazioni cellulari semplicemente condividono gli stessi terreni di coltura, senza poter essere a contatto tra di loro. In vivo, tuttavia, l’influenza delle cellule supercompetitive si estende in un breve intervallo, fino a otto diametri cellulari. Questo potrebbe essere coerente con il coinvolgimento di proteine di membrana e/o proteine secrete, che in vivo avrebbero una gamma ridotta di diffusione.
Elaborando un profilo trascrizionale delle cellule competitive, Moreno e la sua equipe hanno dimostrato che tre differenti isoforme di splicing del gene Flower, vengono espresse in molti contesti (per esempio myc-competition) in cui s’innesca la competizione cellulare: l’isoforma Flower-ubi viene downregolata nelle cellule perdenti, mentre le altre isoforme Flower-loseA e loseB, vengono up-regolate in quelle vincenti.
6 È importante sottolineare che l’espressione di entrambe le isoforme Flower lose è necessaria e sufficiente per eliminare le cellule perdenti. In particolare, entrambi i geni sono stati collegati al cancro. Flower ha dimostrato di essere upregolata in papillomi e nel tessuto circostante, mentre invece i topi Flower-deficienti mostrano ridotta sensibilità alla formazione di papillomi. Al momento è completamente sconosciuto il meccanismo d’azione delle proteine Flower e di come inducano la morte delle cellule perdenti. In altri studi Flower è stata descritta come una proteina trasportatrice degli ioni Ca; tuttavia non è chiaro se questa funzione sia necessaria nella competizione. Poiché esse sono proteine transmembrana è probabile che le proteine Flower siano partecipi al riconoscimento extracellulare tra cellule vincenti e perdenti. Comunque è importante notare che, nonostante le proteine Flower lose non siano presenti all'inizio della competizione e che diventino espresse soltanto quando essa è già innescata, le molecole addizionali devono essere responsabili di una percezione iniziale che porta ad un’espressione differenziale delle isoforme Flower.
Le cellule perdenti non muoiono senza combattere: sempre riguardo al Myc-pathway, è stato identificato il componente della matrice extracellulare (ECM), SPARC (proteina secreta acida e ricca in cisteina) come mediatore della competizione cellulare. SPARC è una glicoproteina coinvolta nel rimodellamento della matrice extracellulare e nel modulare l’attività di molteplici vie di segnalazione. Un recente rapporto effettuato su Drosophila, mostra che durante le prime fasi della competizione, le cellule perdenti esprimono SPARC. L’espressione di SPARC protegge temporaneamente le cellule perdenti dalla competizione, ritardando l’induzione di apoptosi, anche se il meccanismo esatto non è attualmente chiarito. Si propone che l’azione di SPARC sia quella di scudo per ritardare l’effetto della competizione cellulare.
7 Ciò consentirebbe di evitare l’inutile eliminazione delle cellule che sono in grado di riprendersi da danni transitori. La connessione tra SPARC e cancro è stata nota da tempo, anche se il suo ruolo è poco chiaro perché sembra promuovere tumori in alcuni contesti e sopprimerli in altri.
Hippo pathway
Recentemente, la Hippo-Pathway è stata coinvolta anche nelle interazioni cellulari competitive. Hippo-YAP è una via di soppressione tumorale, che è stata scoperta all’incirca 10 anni fa in Drosophila e regola la dimensione degli organi. La via comprende una reazione a cascata di proteine chinasi, che vincola la crescita dei tessuti ed è regolata da segnali di sviluppo, dal contatto e dalla densità delle cellule. L’attivazione del Pathway coincide con l’inibizione del coattivatore trascrizionale Yorkie (i geni omologhi nei mammiferi sono YAP e TAZ). Nel 2007, durante la ricerca di mediatori della competizione cellulare in Drosophila, il Gruppo di Nick Baker ha dimostrato che l’inattivazione mutazionale della Hippo Pathway permette alle cellule mutanti di eliminare le wild-type vicine. È stato poi dimostrato che in queste cellule l’effetto è mediato da Yorkie, che scatena una upregulation per la trascrizione di Myc. In accordo con questo, le relative differenze nei livelli di Myc sono necessarie per la competizione Hippo-mediata; perché quando i livelli di Myc sono uniformi in tutto il tessuto, le cellule mutanti per i componenti di Hippo non possono più manifestare un comportamento supercompetitivo.
Wnt
Wnt è un regolatore fondamentale per la sopravvivenza, per la proliferazione e per il destino specifico delle cellule in tutti i metazoi; sia durante lo sviluppo che nell’omeostasi del tessuto adulto. L’iperattivazione della via Wnt, per esempio a seguito di mutazioni nei
8 regolatori negativi axin e APC, è una causa comune di cancro al colon e al fegato. Studi su Drosophila hanno dimostrato che l’iperattivazione di segnali Wnt può conferire alle cellule uno stato di supercompetitività. Quindi, le cellule mutanti per APC o axin possono indurre l’apoptosi nelle wild-type che le sono vicine e prendere il controllo del tessuto. È interessante notare, che in questo caso l’eliminazione di cellule wild-type non è mediata da una relativa differenza nei livelli di Myc tra cellule adiacenti. Questo potrebbe indicare l’esistenza di un distinto pathway molecolare che innesca interazioni cellulari competitive. In alternativa, la via Wnt potrebbe convergere sulla stessa cascata molecolare a valle dell’attività Myc. Il comportamento competitivo delle cellule con segnalazione Wnt iperattiva, richiede la presenza del glypicano specifico Notum (attività fosfolipasica). Notum è un inibitore di Wnt secreto, che è rilasciato da cellule supercompetitive ad alta Wnt ed esso smorza la segnalazione Wnt nelle cellule wild-type limitrofe. Come conseguenza dell’attività Notum, la disparità relativa alla segnalazione Wnt tra cellule normali e mutanti è ulteriormente amplificata. Grazie a questa disparità le cellule mutanti sovrastano le wild-type. È interessante notare che, il Notum umano è iper-espresso in alcuni carcinomi epatocellulari e del colon-retto dove per l’appunto la segnalazione Wnt è anch’essa iper-espressa. Il significato funzionale di questa upregulation nel cancro umano è attualmente sconosciuto, ma potrebbe rivelarsi utile indagare se l’espressione Notum sia in grado di fornire cellule tumorali con un vantaggio competitivo.
Segnalazione Fas/FasL
Le scoperte fatte sul cancro nei mammiferi rafforzano l’ipotesi che le interazioni cellulari competitive potrebbero facilitare la crescita tumorale. Per esempio, le cellule del cancro gastrointestinale spesso formano tumori secondari nella cavità addominale, un processo che richiede cellule tumorali per violare la barriera del mesotelio peritoneale, prima che
9 essi possono raggiungere il tessuto connettivo sottostante. Ciò che desta interesse è che tale evento si basa sulla capacità delle cellule tumorali di uccidere le cellule mesoteliali per apoptosi. In vitro, la morte delle cellule mesoteliali si verifica solo seguentemente al contatto cellulare tra i due tipi di cellule ed è parzialmente dipendente dal sistema recettoriale Fas/FasL(ligando), un noto induttore di apoptosi appartenente alla super famiglia del fattore di necrosi tumorale (TNF) .
Inoltre gli esperimenti fatti sui topi, indicano che l’inibizione della morte cellulare nel tessuto ospite, è sufficiente a sopprimere significativamente la capacità delle cellule tumorali che esprimono Fas di dare metastasi al fegato. Questo suggerisce che l’uccisione delle cellule ospite limitrofe, facilita la colonizzazione metastatica. Questi risultati sono compatibili con l’esistenza di interazioni competitive tra cellule metastatiche e cellule del tessuto ospite; ed evidenziano la possibilità che il sistema FasL/Fas potrebbe svolgere un ruolo attivo in questo processo.
Interazioni competitive e cellule staminali
Recenti osservazioni suggeriscono che le interazioni cellulari competitive sono presenti anche in compartimenti di cellule staminali e potrebbero svolgere un ruolo di promozione tumorale, in base ai risultati ottenuti sui mammiferi. Per esempio, nel midollo osseo, le
10 cellule staminali ematopoietiche (HSC) competono per la colonizzazione della “nicchia” (microambiente dove sono localizzate le cellule staminali) sulla base dell’attività di p53. p53 è uno dei geni oncosoppressori più conosciuti e più studiati. Le cellule con attività di p53 inferiore, colonizzano la nicchia in modo più efficiente rispetto alle cellule ad alta p53, le quali sono condotte ad un arresto permanente della proliferazione, attraverso senescenza. Una riduzione nella funzione di p53 è una caratteristica comune delle cellule tumorali, pertanto questo meccanismo potrebbe essere utilizzato da cellule mutanti in p53 (pre-cancerose) per conquistare la nicchia e progredire a cancro.
È interessante notare che le cellule del cancro metastatico alla prostata competono anche con le HSC per la colonizzazione della nicchia. Ciò comporta lo spostamento delle normali HSC, che successivamente si uniscono alla circolazione del sangue, dove si differenziano. Pertanto, in questi casi, le cellule perdenti sono eliminate indirettamente, tramite spostamento dalla nicchia piuttosto che attraverso la morte cellulare, un fenomeno che è stato anche mostrato in Drosophila in compartimenti di cellule staminali.
11 Geni della polarità segmentale
Studi incentrati sui geni della polarità segmentale in Drosophila, hanno stabilito che le interazioni cellulari competitive sono un possibile meccanismo di soppressione del tumore. I geni della polarità scrib (scribble), lgl (lethal giant larvae), dlg (discs large), e crumbs sono coinvolti nello stabilire e mantenere la normale polarità apicobasale delle cellule epiteliali in Drosophila e nei mammiferi. La perdita di questi geni è stata anche coinvolta nella formazione e progressione del tumore. In Drosophila, mutazioni dei geni dlg, lgl, o scrib nei dischi immaginali sono causa di perdita di architettura tissutale e di proliferazione incontrollata. Tuttavia, un mosaicismo di mutazioni genetiche spesso scatena l’induzione di apoptosi e l’eliminazione delle cellule mutanti, da parte delle cellule normali limitrofe, con grande allusione alle interazioni competitive.
Rilevante è notare che, risultati simili sono stati ottenuti in sistemi di colture cellulari di mammifero; indicando che la perdita di geni della polarità può innescare interazioni cellulari competitive anche nei mammiferi. Recentemente si è visto che l’espressione differenziale di crumbs tra cellule vicine è capace d’innescare interazioni competitive.
12 L’attivazione della segnalazione JNK è un evento centrale nella eliminazione delle cellule con mutazioni in geni della polarità che sono anche oncosoppressori. Le cellule scrib, con valori di traffico endocitotico alterati per l’iperattivazione della segnalazione Eiger (il TNF omologo di Drosophila) tramite il suo recettore Wengen , determinano l’attivazione di JNK e l’apoptosi. Infatti, l’inibizione della segnalazione JNK nei cloni scrib dei dischi immaginali, blocca l’apoptosi delle cellule mutanti e scatena così una proliferazione aggressiva con formazione di tumori. In particolare, la segnalazione Eiger-JNK si attiva anche in una linea di cellule Wilde-Type che circondano il tessuto scrib mutante.
In queste cellule l’attivazione di JNK non induce apoptosi, ma al contrario è a loro necessaria per eliminare le scrib vicine attraverso la fagocitazione.
Queste scoperte indicano che le interazioni competitive tra cellule adiacenti contribuiscono all’eliminazione delle cellule scrib. Recenti studi mostrano anche che le cellule mancanti di polarità reclutano gli emociti (i macrofagi di Drosophila). Essi sono una fonte di Eiger e contribuiscono alla morte e fagocitazione delle cellule mutanti.
La fagocitosi non è semplicemente un evento secondario che elimina i detriti cellulari dal tessuto, ma piuttosto si tratta di un componente attivo e fondamentale nel processo di competizione cellulare. A questa conclusione si è giunti, osservando che l’inibizione della funzione delle proteine necessarie per la fagocitosi, in realtà conduce all’ inibizione della competizione.
13 È interessante notare che, anche se la perdita di scrib, dlg o lgl da origine a simili fenotipi di polarità; nei tessuti mosaici Mahjong (una proteina lgl-interagente recentemente identificata) può evitare l’eliminazione delle cellule mutanti per lgl, ma non di quelle mutanti per scrib. Infatti, i cloni lgl non vengono sempre eliminati dai tessuti Wild-type e in alcuni contesti possono restare proliferanti. Il diverso comportamento dei cloni lgl sembra dipendere dal contesto tissutale e correlarsi con la modulazione locale di segnali Hippo ed espressione Myc.
È importante sottolineare che si può evitare l’eliminazione di cloni mutanti per dlg, scrib e lgl (che portano alla formazione di tumori), se queste cellule hanno anche la via Ras (RasV12) costitutivamente attiva. Ciò indica che ulteriori mutazioni possono permettere a queste cellule di eludere i meccanismi di soppressione tumorale e superare i vincoli del tessuto. Questi risultati potrebbero essere particolarmente rilevanti per comprendere l’impatto di mutazioni multiple sulla progressione del cancro.
Src e ras
In Drosophila, l’attivazione globale dell'oncogene Src (attraverso la demolizione della catena C-terminale di Src chinasi dCsk) si traduce con un’eccessiva proliferazione e crescita tissutale. Tuttavia, la degradazione di dCsk determina l’eliminazione delle cellule mutanti da parte delle wild-type limitrofe, mediante estrusione epiteliale, migrazione basale invasiva e apoptosi. In questo caso, morte cellulare ed estrusione si verificano ai confini tra wild-type e cellule mutanti, suggerendo un segnale a corto raggio. Un fatto rilevante è che l’estrusione di cellule oncogene attive dai normali fogli epiteliali, è stato riscontrato anche in una coltura cellulare di mammifero.
14 Le cellule MDCK trasformate attraverso l’attivazione dell’oncogene Ras (RasV12) o Src, vengono estromesse dal mono-strato epiteliale quando le normali cellule MDCK le circondano. Tuttavia, in questo caso, queste cellule non muoiono dopo l’estrusione e infatti le cellule mutanti in Ras V12 continuano a proliferare, formando aggregati multicellulari.
Vie estrinseche di morte
L’attivazione di pathway estrinseci di morte, come il TNF, è chiaramente importante per la rimozione di cellule potenzialmente dannose. Come visto sopra Eiger, il ligando omologo a TNF in Drosophila, è un componente chiave nella eliminazione di cellule mutate per scrib per mezzo delle interazioni competitive. Attualmente si deve ancora approfondire il coinvolgimento nei mammiferi di TNF in questo fenomeno. Tuttavia, si evidenzia che una via di morte estrinseca può attivare l’apoptosi nel contesto di interazioni competitive con funzione tumore-soppressiva. Nello specifico, è stato dimostrato che una coltura di normali cellule epiteliali di mammifero possa determinare la morte e la differenziazione di una linea di cellule del cancro al seno. La caratterizzazione nel mezzo di fattori solubili ha evidenziato la citochina pro-infiammatoria interleuchina IL-25, come il più potente effettore citotossico. Questa citochina è capace di uccidere selettivamente le cellule del cancro al seno, a causa di un espressione differenziale del suo recettore (IL-25R): alti livelli sulle cellule tumorali e basse livelli o assenti sulle cellule normali.
15 Descrizione: nelle colture 3D di normali cellule della mammella ci sono molecole capaci di far differenziare o uccidere le cellule cancerose attraverso la secrezione di citochine. Caratterizzazione dell’interleuchina 25 (IL-25) come il più potente mediatore di morte cellulare attraverso il proprio recettore IL-25R, che contiene un dominio di morte.
1.2 Soppressione neighbor
Quasi 50 anni fa, un studio pioniere ha dimostrato che i normali fibroblasti primari nel topo potevano sopprimere la crescita di una linea virale di fibroblasti trasformati, suggerendo una potenziale interazione competitiva:
16 La crescita delle cellule trasformate veniva inibita solo quando erano a contatto con le cellule normali. La soppressione della crescita era dipendete da uno stretto contatto cellulare e questo non si verificava se i due tipi di cellule condividevano semplicemente lo stesso mezzo di coltura. Questo fenomeno, definito “soppressione neighbor” letteralmente “vicino di casa”, comporta l’inibizione della crescita non attraverso l’induzione di apoptosi o un blocco nella fase G1/G0 come nella fase stazionaria dei fibroblasti; ma attraverso un allungamento del ciclo cellulare che porta a un blocco nella fase G2/M. Dai primi studi, sono state osservate combinazioni differenti di cocolture di cellule normali/trasformate, ottenendo risultati simili. Ciò suggerisce che le cellule precancerose potrebbero inizialmente essere contenute entro il normale tessuto circostante e rimanere dormienti attraverso il processo di soppressione neighbor (o altre forme di interazioni competitive), fino a che ulteriori mutazioni le rendono insensibili all’effetto inibitorio delle cellule normali.
1.3 Cancro
Come precedentemente detto in Drosophila le cellule epiteliali sane competono con quelle trasformate per la sopravvivenza in un processo che viene chiamato competizione cellulare. Se un gruppo di cellule viene esposto a un qualche tipo di stress, esse si suddivideranno in sottopopolazioni più o meno danneggiate. In condizioni non competitive le cellule con danni maggiori muoiono in breve tempo, mentre quelle moderatamente danneggiate sopravvivono alla generazione successiva, indicando la trasduzione di un fenotipo negativo. Invece in condizioni competitive anche le cellule leggermente danneggiate sono eliminate; poiché le cellule sane o vincenti, mandano segnali di morte alle cellule danneggiate o perdenti e quest’ultime reciprocamente trasmettono segnali di crescita alle vincenti. Questa regolazione di imput (feed-forward) rende possibile
17 l’eliminazione di cellule anormali e il mantenimento dello stesso numero di cellule sane in un gruppo ristretto. In definitiva, la competizione agisce durante lo sviluppo come un meccanismo di controllo qualità che elimina le cellule subottimali prima che contribuiscano alla formazione dell’organismo adulto.
L’oncogenesi è caratterizzata dai cambiamenti genetici e metabolici che riprogrammano le cellule viventi per moltiplicarsi liberamente. Questo suggerisce che le cellule anormali destinate originariamente all’eliminazione, possano sopravvivere e moltiplicarsi a dispetto della competizione cellulare portando alla formazione di una massa tumorale.
Di conseguenza la competizione cellulare è collegata al cancro, poiché nei vertebrati molti dei geni coinvolti sono oncogeni o soppressori tumorali. La scoperta di geni che possono trasformare le cellule in “super-competitori” ha portato ad ipotizzare che le cellule con lesioni precancerose sarebbero in grado di colonizzare il tessuto eliminando le cellule circostanti. Questa popolazione di cellule che si è espansa, sarebbe dunque esposta a subire ulteriori mutazioni con una probabilità maggiore. Mutazioni che alla fine permetteranno alle cellule di superare i vincoli del tessuto ed evolversi a tumore. Questa teoria è coerente con il modello della “cancerizzazione di campo” , che è stato proposto per spiegare lo sviluppo di molteplici tumori primari e concomitanti nello stesso tessuto, insieme all’osservazione che il tessuto anomalo spesso circonda il tumore.
18 È stato quindi proposto che precoci lesioni precancerose potrebbero consentire alle cellule di espandersi e di colonizzare i tessuti. In questo campo, ulteriori “hits-genetici” indipendenti che avvengono in diverse regioni tissutali, porteranno a tumori con la stessa origine monoclonale. Questa conclusione è infatti sostenuta dal fatto che le mutazioni genetiche associate al tumore sono frequentemente presenti in biopsie macroscopiche effettuate sulla mucosa normale adiacente al tumore. Lo studio della topologia tissutale e delle dinamiche di rete ha permesso di far luce sulla connessione esistente tra interazioni competitive e cancro.
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CAPITOLO II
2.1 Topologia tissutale e dinamiche dominanti
Lo studio della topologia tissutale può aiutare a definire le interazioni competitive. In un epitelio mono-stratificato le cellule apicali superficiali appaiono di forma poligonale; in un tessuto normale questi poligoni s’incastrano perfettamente in una struttura priva di spazi vuoti. Ogni poligono è circondato da cellule adiacenti su ogni lato. Usando quest’informazione per costruire una “rete epiteliale” di contatto cellulare è possibile capire gli schemi d’organizzazione spaziale delle cellule epiteliali.
Il punto centrale di ogni cellula dell’epitelio è considerato come un nodo, e due nodi vengono collegati quando due cellule sono vicine (per esempio attraverso un contatto fisico), questa situazione ci può aiutare a capire le interazioni tissutali locali, chiamate anche “sociologia cellulare”. Concettualizzare la posizione delle cellule in una rete, apre nuove possibilità di ricerca sull’organizzazione e la configurazione dei tessuti, usando principi di grafica. Per esempio considerando la rete d’interazione cellulare dell’epitelio nello sviluppo dell’ala di Drosophila, si è visto che generalmente ogni cellula è circondata a sua volta da altre 6, ma se né potevano trovare anche altre circondate da 4 o 9. Incredibilmente altri tessuti multicellulari mostravano una distribuzione molto simile per il numero di cellule confinanti ad ogni lato o per la quantità di nodi nella rete di contatto. Sono state fatte molte ipotesi per spiegare l’origine di questa distribuzione usando teorie
20 sull’elasticità, sulla meccanica o modelli stocastici di replicazione cellulare . Mentre il grado di distribuzione sembra seguire un principio generale che può essere compreso attraverso modelli matematici, per distinguere tessuti differenti sono invece necessarie delle misurazioni topologiche più specifiche di contatto di rete cellulare, per esempio il grado o il coefficiente cluster dei nodi. In particolar modo, la “signature” quantitativa (letteralmente “l’impronta” di una cellula; corrisponde all’espressione differenziale di geni, dovuta alla tipo di differenziazione acquisita) di un tessuto può essere ottenuta considerando una serie appropriata di statistiche relative alle reti di contatto cellulare. Per esempio, l’analisi delle biopsie muscolari consente di valutare le differenze tra tessuti muscolari normali e malati. Questo metodo non solo automatizza il lavoro del patologo catturando le informazioni geometriche dalla biopsia, ma coglie anche l’organizzazione spaziale delle fibre muscolari mediante la costruzione di una “rete muscolare” di contatti fibra-fibra.
interessante notare che, utilizzando questo approccio sono state trovate alcune “caratteristiche di rete” come parametri chiave per quantificare il grado di patologia in pazienti affetti da distrofia muscolare. Si può quindi concludere che l’organizzazione topologica dell’epitelio differisce tra tessuti e specie ed è in grado di fornire preziose informazioni. D’altro canto l’alta riproducibilità della struttura di rete di uno stesso tessuto epiteliale proveniente da differenti individui, allude alla presenza di controlli genetici che regolano l’organizzazione di un tessuto adiacente o a distanza. Come una competizione. Questo suggerisce la presenza di multipli livelli di controllo che danno forma alla completa rete d’interazione cellulare di tessuti viventi attraverso scale multiple .
21 Le forze che guidano la topologia epiteliale
Come precedentemente detto il fenomeno generale denominato come “competizione cellulare”, può sorgere quando due popolazioni di cellule che differiscono per la loro crescita, coesistono in un tessuto di sviluppo. In una popolazione omotipica, le cellule prolifereranno e il tessuto si svilupperà normalmente. Tuttavia, quando due popolazioni coesistono in un tessuto e devono competere per lo spazio, la popolazione più sana (più veloce nella crescita) prolifererà a scapito di quella meno sana. Le cellule “vincitrici” possono infine conquistare il compartimento di sviluppo inducendo l’apoptosi nelle cellule “perdenti”. Inoltre, si è visto che in differenti organismi le cellule identiche competono per la conquista dello spazio in tessuti epiteliali molto ricchi di cellule, così che quelle “perdenti” vengono perse per “delaminazione”. Così, interazioni meccaniche e segnali molecolari (comunicazione) che s’instaurano tra cellule circostanti, sono in grado di pilotare la morte cellulare. In tessuti sani la rimozione delle cellule perdenti e la proliferazione delle vincenti sembra essere accuratamente bilanciata, a tal punto che la competizione agisce per garantire l’omeostasi tissutale. Viceversa, è stata avanzata la proposta che le cellule cancerogene, mancanti dei controlli necessari per rispondere al tessuto sovraffollato, sconfiggano le vicine wild-type, attraverso un processo noto come “cancerizzazione di campo”, che porta alla crescita di un primo stadio di tumore iperplasico a spese del tessuto ospite. In particolare, le lesioni preneoplastiche dell’epitelio progrediscono da un tessuto normale, differenziato e in equilibrio omeostatico, ad un carcinoma indifferenziato in situ. Ciò si verifica attraverso un complesso accumulo di mutazioni genetiche associate alla perdita della struttura tissutale e alla modificazione delle interazioni cellulari. È pertanto importante determinare come la topologia tissutale possa cambiare in diversi tessuti epiteliali come la mucosa della pelle, del polmone o della cervice uterina. Tecnicamente, la topologia del tessuto può essere ottenuta analizzando
22 campioni istologici di pazienti con algoritmi di teoria dei grafici, come ad esempio diagrammi di Voronoi, triangolazioni di Delaunay, o altri algoritmi basati sulla vicinanza di cellule adiacenti. Per esempio, questi approcci vengono utilizzati per valutare il grado di differenziazione, le perdita di ordine e di equilibrio omeostatico nelle lesioni preneoplastiche dell’epitelio, così come la perdita di differenziazione cellulare nei carcinomi. I parametri statistici delle reti di interazione cellulare, combinati con misure precise dei cambiamenti morfologici nei nuclei delle cellule, hanno mostrato un potenziale promettente come markers surrogati per il grado di malignità e progressione del cancro.
Descrizione: La figura presenta diversi esempi di lesioni pre-neoplastiche p16 cervicali e le corrispondenti reti topologiche ottenute dal tessuto.
I recenti progressi di immagine, microscopia, tecnologie ottiche, e patologia digitale, rendono possibile l’analisi dettagliata e simultanee misurazioni di proteine multiple ed
altre molecole (miRNA , ecc) in campioni istologici e microarray di tessuto. Questo permette la segmentazione e l’identificazione di sottopopolazioni (cloni) di cellule
23 ibridazione a fluorescenza loco-specifica in situ (FISH ), dopo aver posto segnali per ogni nucleo. Queste nuove metodologie possono poi facilitare la costruzione della topologia globale di un tessuto epiteliale e l’analisi quantitativa della distribuzione spaziale della sottopopolazione clonale.
2.2 Interazioni cellulari e teoria dei giochi
La competizione cellulare, la cooperazione e interazioni più generali presenti nei tessuti viventi possono essere studiate usando la “teoria dei giochi”. Gli approcci teorici del gioco sono ampiamente utilizzati per analizzare interazioni tra individui che utilizzano strategie diverse. Nella teoria del gioco rivoluzionario si presuppone che le strategie ( “fenotipi”) sono associate a varianti genotipiche, consentendo di analizzare la nascita e la diffusione di strategie di successo specifiche in una popolazione . Gli individui che utilizzano strategie di successo avranno un livello di salute più alto, si riprodurranno più velocemente e si diffonderanno nella popolazione . Uno dei giochi evolutivi più analizzati, noto come “il dilemma del prigioniero”, è usato per analizzare il problema della cooperazione tra individui che interagiscono.
24 In questo gioco gl’individui possono scegliere tra due strategie : di cooperare o di tradire. Un cooperatore paga un costo per distribuire benefici ai propri partner d’interazione. I traditori (imbroglioni) non pagano nessun costo e non producono benefici per i loro partner. Il maggior profitto si ottiene quando entrambi gli individui cooperano; tuttavia la tentazione di tradire per ottenere un maggior profitto rispetto all’altro, può portare entrambi gli individui a tradire e questo conduce all’esito peggiore. Il gioco può essere generalizzato a qualsiasi popolazione di individui interagenti. Nel caso di una competizione cellulare i profitti e i costi si traducono in cambiamenti corrispondenti al benessere (salute) della cellula : individui che utilizzano strategie di successo si replicano più velocemente. Una popolazione ben mescolata di cooperatori può avere in se dei traditori . Il diffondersi di traditori porta ad una diminuzione nel tasso di benessere della popolazione e può portare al collasso, se la sua sostenibilità dipende dalla presenza dei cooperatori ( in quella che è conosciuta come la “tragedia dei beni comuni” ). La teoria dei giochi evolutivi è stata utilizzata per elaborare strategie specifiche in differenti interazioni complesse, come per esempio nella popolazione di cellule strutturate nello spazio. Ciò è stato generalmente fatto organizzando una griglia statica di celle ( ad es l’automa cellulare) e osservando come le loro interazioni influenzino i loro movimenti e la loro proliferazione. Questo approccio può essere esteso per studiare topologie tissutali, ma la griglia fissata pone un limite non reale a variazioni dinamiche nella rete d’interazione cellulare. Questo è evidente quando la nozione astratta della cooperazione e del tradimento tra le cellule è meccanicamente spiegata con diversi tipi di comunicazione cellula-cellula. È nota l’esistenza di numerosi meccanismi, per esempio le dirette interazioni dei recettori di segnalazione trans-membrana possono inviare informazioni tra le cellule, per poterne quindi determinare il destino attraverso la competizione.
25 Questo può avvenire anche su lunghe distanze così che le molecole di segnalazione sulla superficie di una cellula vengono rilevate da recettori che sono sulla superficie di cellule più lontane a distanza di diversi micron, modificandone il comportamento. Questi recettori inducono risposte specifiche nella cellula ricevente, che possono dipendere dalla concentrazione e dalla durata di un segnale, e sono in grado di determinare l’espressione di un’altra molecola di segnalazione . Da questo punto di vista, le cellule che cooperano sono quelle che s’impegnano attivamente nella comunicazione (al “prezzo” di produrre e recepire i segnali di comunicazione) e che aiutano a dare forma all’ambiente tissutale. Questo potrebbe compensare la presenza di forze meccaniche che possono alterare il tasso di divisione o il tasso di morte delle cellule a livello locale o a distanza. In questo contesto, una cellula difettosa è una cellula che in parte sfugge ai meccanismi di controllo da parte dell’ambiente, che le permette di comportarsi in modo diverso, ad esempio, ignorando alcuni imput di segnalazione. Nel dilemma del prigioniero a livello cellulare, le cellule traditrici che non segnalano e/o ignorano i segnali hanno un prezzo minore da pagare rispetto alle cellule che cooperano e possono moltiplicarsi più velocemente, portando in definitiva a un tessuto in cui la segnalazione globale del sistema è compromessa. In ogni caso, la segnalazione tra le cellule è strettamente legata all’architettura del tessuto, perciò alla rete d’interazioni cellulari precedentemente descritta.
Le interazioni alterano la crescita della cellula e i tassi di mortalità delle cellule vicine. Questo influenza la topologia del tessuto che, infine, va di nuovo ad influenzare la comunicazione microambientale fra le cellule. A causa di ciò, le reti di interazione e le comunicazioni cellulari sono interdipendenti e altamente dinamiche .
Per studiare la complessa interazione precedentemente descritta, consideriamo la replicazione e la morte della cellula prendendo in considerazione le reti di collegamento dinamiche e la teoria dei giochi. Una rete di collegamento dinamica può modificare la rete
26 d’interazione cellulare di un tessuto epiteliale che cambia nel tempo, a seconda delle interazioni (i “ giochi”) fra cellule adiacenti e di conseguenza la loro replicazione e la loro morte. Questo fenomeno mostra come la topologia del tessuto viene alterata dalla duplicazione e dalla morte cellulare che si verificano in modo stocastico e con probabilità determinate, facendo una media del profitto che le cellule tra loro vicine possono ottenere partecipando o meno al gioco di cooperazione. Così le cellule competono per le risorse e quelle più forti (sane) riescono a replicarsi più velocemente. Un tessuto sano può essere determinato da un’uniforme popolazione di cellule. Infatti, la distribuzione poligonale delle cellule che cooperano all’interno di questo modello, coincide con quelle dei tessuti biologici sani. Quando la rete dei collegamenti contiene un certo numero di cellule difettose la topologia cambia, determinando uno stato patologico.
Questo semplice schema rivela la profonda influenza della competizione cellulare sulla topologia del tessuto.
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2.3 Organizzazione epiteliale e sviluppo del cancro
Il cancro si sviluppa nel tempo attraverso la mutazione di determinate cellule e perciò può essere inteso come un’applicazione ai sistemi Darwiniani. Al di là delle differenze fra i diversi tipi di cancro, si può generalizzare l’insorgere dei tumori solidi come “l’evoluzione della mancanza e del crollo della cooperazione”. Stando alla metafora del dilemma del prigioniero le cellule cancerose sono considerate dei traditori. Nel tessuto sano le cellule si moltiplicano in maniera organizzata come stabilito dal programma di sviluppo. Le cellule che cooperano sono quelle che rispondono allo scambio d’informazioni delle molecole segnale, che coordinano il programma di sviluppo e che indicano se una cellula può proliferare o deve andare in apoptosi. Le cellule traditrici (mutate o cancerose) non partecipano a tale sistema di segnalazione, ottengono un profitto in termini di salute e possono moltiplicarsi da sole e in maniera incontrollata. Come per le altre cellule, comunque la capacità di riprodursi delle cellule cancerose è determinata dalla loro interazione con le cellule vicine, dal loro microambiente e dalle architetture che probabilmente il tessuto ha già perfezionato, in modo da ottimizzare le funzioni multicellulari e contenere la diffusione delle cellule difettose. La capacità di recupero di un tessuto sano può perciò dipendere dalla organizzazione spaziale e dalle strutture di tessuti specifici (dunque dalla rete d’interazioni cellulari). Questo è stato dimostrato usando modelli matematici, dove l’evoluzione somatica del cancro veniva considerata in una determinata varietà di cellulare. Questa idea può essere generalizzata nel quadro di reti dinamiche proposte. Si può considerare un dato tessuto bidimensionale, nel quale le cellule cooperative e traditrici possono dividersi o essere eliminate per apoptosi e dove la salute di ogni cellula è determinata dalle sue interazioni locali. La struttura dinamica del tessuto e i diversi livelli di salute delle cellule cooperative e traditrici “che modificano la
28 competizione cellulare” porta a un complesso fenomeno di evoluzione topologica: le cellule traditrici sono più forti delle cooperative adiacenti, ma la popolazione omotipica delle cellule traditrici è svantaggiata poiché si può trarre solo un piccolo beneficio dalle interazioni fra le sole cellule traditrici. Invece le singole cellule traditrici che sono inserite in una popolazione di cellule cooperative, sono avvantaggiate e possono crescere più velocemente del tessuto circostante. Man mano che la popolazione delle cellule traditrici cresce, si viene a creare una condizione per loro limitante, perché le traditrici verranno circondate da alte traditrici, che è uno svantaggio in termini di profitto . Si creerebbe così una popolazione isolata di cellule traditrici circondate da cellule cooperative che può essere vista come una sorta di tumore benigno .
Le cellule traditrici possono moltiplicarsi ulteriormente soltanto con un corrispettivo tasso di morte, come può accadere per le cellule perdenti, che a contatto con le traditrici hanno poche chance di sopravvivere, come riscontrato in diversi tipi di cancro. La rete d’interazione cellulare della popolazione traditrice è molto diversa dal tessuto delle cellule
29 cooperatrici, nel quale è inserito e questi cambiamenti nella cito-architettura del tessuto si riscontrano anche in vari tumori. Tali esempi suggeriscono che i cambiamenti nell’architettura del tessuto influenzano la genesi dei tumori.
2.4 Prospettive per le dinamiche di rete
L’uso della teoria dei giochi e delle reti di collegamento dinamiche costituiscono un quadro generale per analizzare le dinamiche evolutive di una rete d’interazione cellulare. Pensiamo che questo quadro possa diventare un nuovo e utile approccio computazionale allo studio del processo della genesi tumorale come una malformazione del tessuto e per studiare il ruolo delle interazioni cellula-cellula e il ruolo della competizione nel ristretto ambiente delle cellule mutate. Infatti, nel caso di malattie muscolari e neuromuscolari, è già stato dimostrato che la rete d’interazione cellulare può fornire una valida visione a livello biologico riguardo l’eziologia della malattia . Poiché la maggior parte dei cancri originano dall’epitelio, questo approccio è particolarmente rilevante, poiché aiuta a capire come le cellule interagiscono nei tessuti epiteliali malati, e come l’iperplasia e la competizione possa alterare l’architettura epiteliale e cambiare la probabilità per i piccoli cloni precancerosi di espandersi e di invadere i tessuti adiacenti. In più, le interazioni locali cellula-cellula sono importanti nel mantenimento dell’omeostasi tissutale e nel controllare i gruppi di cellule staminali e potrebbero perciò aiutare a far luce sui processi d’invecchiamento e rigenerazione. Una ulteriore sfida è quella di spostare l’analisi della rete di collegamento dinamica a delle vere e proprie strutture in 3D. Per ottenere questo si dovrebbe estendere il metodo di analisi esistente e del campione di tessuto, usato per vedere il diffondersi delle cellule mutanti in una popolazione 3D. Infatti questo metodo può essere utilizzato per creare sequenze bidimensionali dei tessuti artificiali e compararli con i campioni dei pazienti. L’appropriata analisi sperimentale in situ dell’espressione e
30 della distribuzione delle proteine, permette d’identificare i fenotipi cellulari individuali presenti in un tessuto (le “strategie” che utilizzano le cellule). Per esempio l’analisi appropriata per le aree diagnostiche, che mostrano dei distinti pattern di espressione. L’analisi della rete d’interazione cellulare di vari tessuti è già realizzabile. I relativi approcci vengono utilizzati anche per studiare lo sviluppo delle piante e alcuni di questi possono essere adattati anche alla ricerca sul cancro. A questo punto si deve lavorare tramite fermi-immagine, perché è praticamente impossibile seguire i cambiamenti delle reti d’interazione cellulare nel tempo. Sarebbe necessario sviluppare ulteriormente queste linee guida in modo che possano permetterci di seguire le interazioni fra i vari tipi di cellule e i conseguenti cambiamenti nella topologia del tessuto.
Il quadro generale che comprende la teoria evolutiva del gioco e le reti di collegamento dinamiche, fra loro collegati, può già aiutarci a fare un passo avanti usando solamente i dati statistici disponibili. Adattando le topologie dei vari tipi di tessuto, per esempio con o senza le cellule mutate (cancerose), ai modelli di reti dinamiche, si potrebbe riuscire a capire i tipi di interazione che potrebbero aver portato alle topologie di tessuto osservato (per esempio, provando a ricostruire i tipi di strategie fenotipiche che le cellule hanno usato). Inoltre il modello di rete dinamica presentato potrebbe dunque essere confrontato con le analisi dei pazienti, per avere delle misure specifiche in maniera da discriminare i diversi stadi evolutivi di un tessuto, nel quale si stanno diffondendo le cellule cancerose. La caratterizzazione topologica di questi stadi, potrebbe essere un primo passo per capire cosa permette ad alcune cellule mutanti di diffondersi e ad altre di morire e per determinare la traiettoria evolutiva della rete d’interazione che conduce al crollo della cooperazione cellulare. La teoria del gioco potrebbe anche aiutare a considerare molteplici tipi d’interazione cellula-cellula nella nicchia microambientale delle cellule mutate; a valutare il ruolo della topologia del tessuto e delle interazioni cellula-cellula nel mantenimento
31 omeostatico della normale citoarchitettura e le perturbazioni scatenate durante la formazione del cancro. Questo potrebbe completare gli altri studi sulla formazione dei tessuti, specialmente quelli che si concentrano direttamente sulla comunicazione della cellula e sull’organizzazione epiteliale. Un quadro completo che comprenda analisi quantitative dei campioni di tessuto, reti di collegamento dinamiche e la teoria evolutiva del gioco, potrebbe rappresentare uno studio fruttuoso per spiegare i risultati recenti che riguardano le interazioni molecolari delle cellule, con la possibilità d’integrare le segnalazioni intra/intercellulari con i cambiamenti dell’architettura dei tessuti, fornendo nuove indicazioni per differenti tipi di cancro e infine far luce sui processi della crescita pre-neoplastica.
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CAPITOLO III
3.1 Interazioni competitive nel tumore al seno
Il normale sviluppo e l’omeostasi richiedono interazioni epitelio- stromali .
I tumori devono evolversi e adattarsi nel contesto dello stroma e quindi, la progressione del cancro dipende dalla capacità delle cellule di utilizzare segnali permissivi e aggirare segnali repressivi. Secondo le teorie evolutive sul cancro, i tumori che si sviluppano hanno caratteristiche che sono vantaggiose, considerato il loro micro-ambiente. Le cellule tumorali possono anche modificare il loro ambiente per indurre segnali che stimolano la crescita. Dati recenti suggeriscono che l’ospite e/o fattori stromali influenzino il sottotipo tumorale. Per esempio, l’invecchiamento stromale può influenzare il tipo di tumore che si sviluppa, o può promuovere una malattia più aggressiva. Viceversa, le caratteristiche tumorali possono definire le interazioni epitelio-stromali. Tumori al seno “Basal-Like” hanno un distinto schema d’interazione microambientale, relativo ad altri sottotipi di cancro al seno e sembra che siano associati con distinti microambienti immunitari. Questi e molti altri dati suggeriscono che le complementari co-evoluzioni epitelio-stromali sono influenti nello sviluppo del cancro. Tuttavia, poiché la maggior parte di questi studi hanno esaminato le interazioni epitelio-stromali, dopo che i tumori hanno acquisito caratteristiche invasive; non è noto come le interazioni ospite-tumore vengano mantenute all'inizio della progressione della malattia.
S’ipotizza che i tumori al seno Basal-Like possano avere determinate interazioni con i loro microambienti, a partire dai primi stadi di progressione. Negli studi epidemiologici, ci sono prove che i tumori al seno Basal-Like progrediscano molto rapidamente attraverso il carcinoma duttale nello stadio in situ (DCIS), rispetto ad altri tipi di cancro. Tuttavia, molti degli studi di DCIS adiacenti al tessuto stromale sono stati fatti su pazienti che
33 presentavano anche tumori infiltranti, e data la natura trasversale di questi studi (con i dati raccolti in un preciso momento temporale della progressione della malattia), è difficile identificare interazioni epitelio-stromali che sono indotte durante la progressione. Inoltre, gli stromi derivanti da lesioni DCIS e tumori infiltranti sono molto simili, il che suggerisce che si possano verificare cambiamenti stromali prima dell’infiltrazione. È importante identificare i pathway che vengono alterati nello stroma prima dell’infiltrazione, e capire come essi possano essere identificati.
Per studiare le interazioni epitelio-stromali nelle fasi pre-invasive dello sviluppo del tumore Basal-Like al seno, sono state utilizzate linee cellulari MCF10 in co-coltura. Le linee cellulari MCF10 rappresentano un background isogenico (essendo derivate da un singolo paziente), ma esprimono caratteristiche patologiche in xenotrapianti, che vanno dalla morfologia non-neoplastica benigna (MCF10A), alla iperplasia atipica (MCF10AT1) e infine al DCIS (MCF10DCIS). Queste linee erano co-coltivate con fibroblasti (sia bidimensionali su plastica, che tridimensionali in Matrigel ®/collagene).
Sono state condotte analisi cellulari e profili di espressione genica per seguire l’evoluzione delle interazioni cellula-cellula durante la progressione. I dati sperimentali risultanti, insieme ai dati del paziente, suggeriscono il ruolo determinante della segnalazione HGF nella fase pre-maligna che porta allo sviluppo del carcinoma Basal-Like infiltrante.
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3.2 Risultati sperimentali
La serie MCF10A acquisisce caratteristiche di “un microambiente Basal-like” in fase di DCIS
Ogni linea cellulare nel pannello isogenico MCF10, ha avuto una risposta distinta alla co-coltura con fibroblasti di riduzione mammoplastica (RMF). Attraverso un SAM multiclasse (analisi significativa di microarray) abbiamo individuato circa 700 geni, poiché differentemente espressi lungo queste tre linee cellulari. Un set di geni è stato particolarmente upregolato in cellule MCF10DCIS, e non in cellule MCF10A o MCF10AT1. Questo gruppo di geni è stato analizzato mediante IPA ( Pathway Analysis Ingenuity) e i risultati suggeriscono processi di risposta immunitaria e disordini del tessuto connettivo, come il traffico delle cellule immunitarie, la risposta immunitaria cellulo-mediata, oppure segnali di risposta in fase acuta. Molti di questi processi sono stati upregolati anche in tumori al seno Basal-like infiltranti in co-colture dirette. È stato utilizzato un set di geni (identificati da Camp e la sua equipe), per testare direttamente se le co-colture abbiano up-regolato le caratteristiche di microambiente Basal-like. Questa “signature” (firma molecolare) può distinguere in vitro le co-colture Basal-like da quelle Luminali, ed è inoltre in grado di distinguere in vivo i tumori Basal-like da quelli Luminali. Utilizzando questa signature è stato calcolato un valore per ogni campione, denominato “valore d’interazione Basal-like” .
Le cellule MCF10DCIS avevano un valore d'interazione Basal-like elevato, simile a quello della linea cellulare del cancro al seno infiltrante Basal-like SUM149.
35 Al contrario, le co-colture di cellule precancerose MCF10AT1 e MCF10A mostravano valori d’interazione Basal-like debolmente positivi e la linea cellulare MCF7 Luminale mostrava un valore negativo. Sono state effettuate correlazioni di Pearson anche per le monocolture e le co-colture indirette, di queste stesse linee cellulari. La correlazione osservata in co-colture indirette seguiva la stessa tendenza di quella osservata in co-colture dirette, anche se il valore Basal-like era in qualche modo attenuato. Data la diluizione e la diffusione dei segnali secreti, era prevedibile questo risultato. Nelle cocolture indirette, i segnali provenienti dai fibroblasti sono diluiti in grandi volumi del mezzo, mentre in co-colture dirette, la dipendenza cineticha di diffusione e la stabilità della proteina è ridotta. A differenza degli effetti inibitori della membrana basale sulla segnalazione cellulare, che non vengono simulati né dalle co-colture dirette, che da quelle indirette; la segnalazione cellula-cellula può essere affrontata con notevoli vantaggi in co-colture dirette, in particolare se si considerano gli effettori con breve emivita. Pertanto, tutti i dati di co-coltura derivano da co-colture dirette, se non diversamente specificato.
Upregulation di citochine secrete in co-colture di fibroblasti MCF10DCIS
Stabilito che i microambienti Basal-like sono indotti da fattori solubili, abbiamo cercato di identificare i mediatori secreti. Ottanta citochine e chemochine sono state misurate nei
36 mezzi di coltura delle co-colture dirette. Un aumento impressionante del numero di citochine espresse si è verificato nelle cocolture MCF10DCIS, con un totale di 62 citochine upregolate più di 1,5 volte. Al contrario, nelle cocolture MCF10A e MCF10AT1 sono state upregolate solo un piccolo numero di citochine.
La citochina con il valore più alto di upregulation nelle co-colture DCIS, era il fattore di crescita degli epatociti (HGF), che aumenta in modo monotonico da MCF10A a MCF10AT1, fino a MCF10DCIS ed è stato upregolato più di 80 volte nelle cocolture MCF10DCIS e più di 70 volte nelle cocolture MCF10AT1.
Quando la secrezione di HGF è misurata dalle co-colture, la fonte di HGF non è distinguibile. Pertanto, per identificare quale componente del sistema produce HGF, vengono misurati i livelli di RNA e proteine HGF intracellulari in ciascuna linea cellulare dopo 48 ore di co-coltura. HGF è esclusivamente prodotto dai fibroblasti. Le cellule epiteliali non avevano livelli rilevabili di trascrizione o proteine nelle monocoltura, tuttavia in co-coltura, alcune proteine HGF sono state osservate nelle cellule epiteliali, presumibilmente a causa di internalizzazione del complesso recettore-ligando. La secrezione e l’attivazione di HGF, sono eventi che fanno parte di una cascata complessa
37 che regola le azioni di HGF. Coerentemente con i risultati precedentemente pubblicati, si suggerisce che l’attività di HGF è regolata pericellularmente a livello proteico da HAI-1. Abbiamo trovato HAI-1 espresso in modo differenziale nella mappa di calore. HAI-1 inibisce l’ HGF- attivatore, inibendo così la stimolazione e la successiva funzione di HGF stesso. HAI-1 è stato espresso in quantità maggiore in cocolture MCF10A, e attraverso l’analisi array per le citochine, è stato associato a un’espressione minore di proteina HGF secreta. HGF è il principale ligando per il recettore tirosin-chinasico MET ed è anche un regolatore negativo della trascrizione MET. Per valutare se MET è presente in queste linee cellulari, e se i livelli del MET sono differenzialmente regolati in condizioni di co-coltura, abbiamo saggiato l’espressione del recettore nella serie MCF10, solo e in co-coltura nel corso di 48 ore. Sia a livello proteico che dell’ RNA, si è riscontrato che il contatto con i fibroblasti (6 ore), ha indotto le cellule MCF10DCIS ad upregolare notevolmente l’RNA MET.
Il picco dell’induzione di RNA dopo 6 ore è stato seguito dal picco dell’espressione proteica dopo 12 ore. Questo effetto non è stato osservato (in MCF10A) oppure è stato riscontrato in maniera notevolmente ridotta (in MCF10AT1) nelle altre due linee cellulari della serie. Così, l'interazione delle cellule MCF10DCIS con RMF in co-coltura, stimola un aumento della secrezione di HGF e un concomitante aumento dell'espressione del recettore HGF epiteliale, MET.
38 Una signature del gene HGF generato in vitro è correlata con i tumori basal-like
I nostri risultati di co-coltura hanno stabilito un aumento del fold-change (rapporto differenziale) della segnalazione HGF nei microambienti Basal-like precancerosi. Tuttavia, se questi cambiamenti sono essenziali per la cancerogenesi del tumore al seno basal-like, allora dovrebbero essere presenti anche nei tumori al seno Basal-like infiltranti. Per valutare questa ipotesi, è stata generata una signature HGF in vitro. Successivamente s’identificano i cambiamenti dell’espressione genica che si sono verificati in entrambe le monocolture MCF10DCIS trattate con rhHGF e le co-colture di MCF10DCIS con RMF. Questi geni HGF-regolati hanno maggiore probabilità di essere determinati con l’azione di HGF su MET in co-coltura. L’analisi IPA della signature HGF ha suggerito, tra le altre vie di segnalazione uparegolate dalla segnalazione HGF in co-colture, la Sonic Hedgehog Signaling, Basal Cell Carcinoma Signaling , e Tight Junction Signaling.
Usando questa signature abbiamo ottenuto 707 tumori infiltranti da tre set di dati indipendenti, avendo così un’alta o bassa correlazione con questa signature HGF.
L’86% dei tumori aggressivi Basal-like in questo set di dati sono positivamente correlati con la signature HGF, mentre solo il 23,6% dei tumori Luminal A presenta un’associazione positiva. Inoltre, il 40% di HER2-like e il 36% dei tumori Luminal B, entrambi i quali sono più aggressivi dei tumori Luminal A, sono stati positivamente associati con la signature HGF.
39 Inoltre, i pazienti Basal-like che sono positivi per la signature HGF, hanno una minore probabilità di sopravvivere. Questi risultati sottolineano l’importanza della segnalazione HGF nel cancro al seno aggressivo. Mentre i risultati sulla co-coltura dimostrano che la segnalazione HGF è già presente nella fase DCIS, l’importanza di questo pathway nella sopravvivenza dimostra che la disfunziona della regolazione del pathway HGF persiste nei tumori Basal-like infiltranti e contribuisce al loro sviluppo.
Il blocco di HGF inibisce tre morfogenesi dimensionali
I precedenti studi di co-colture Basal-like vs cocolture Luminal indicavano che la segnalazione di “fibrosi epatica”, è stata upregolata in co-colture Basal-like. Alla luce dei dati attuali che mostrano che le co-colture MCF10DCIS RMF hanno alti valori d’interazione Basal-like , che HGF è stato secreto/attivo in co-colture MCF10DCIS, e che la segnalazione HGF è notevolmente presente tra i tumori Basal-like infiltranti e che in generale è indice di sopravvivenza, sono stati impiegati gli anticorpi con target per HGF, per studiare il ruolo dell’HGF nel valore di interazione Basal-like e per i saggi di funzionalità morfogenica delle co-colture. In primo luogo, le co-colture MCF10DCIS RMF sono state incubate per 36 ore per permettere che s’instaurassero interazioni epitelio-stromali, e nelle ultime 12 ore sono stati aggiunti anticorpi anti-HGF ogni 2 ore.
È stata dunque osservata una riduzione dei valori d’interazione Basal-like, dovuta al trattamento anti-HGF. Mentre si osserva una variazione (dovuta a cause inspiegabili o casuali) dei dati nel tempo trascorso tra le 4, 8 o 12 ore dopo l’esposizione si hanno valori d’interazione Basal-like che vanno da negativo a leggermente positivo, è chiaro che in tutti e tre gli intervalli di tempo, il valore è drasticamente ridotto.
40 Saggi morfogenetici hanno dimostrato di tenere traccia del normale sviluppo fisiologico acinoso, come del potenziale patologico maligno delle cellule epiteliali.
I laboratori di Brugge e Bissell hanno caratterizzato lo sviluppo di strutture 3D nelle cellule MCF10A nel corso del tempo, individuando importanti meccanismi morfogenetici. Cioè, la morfogenesi rappresenta un equilibrio tra la varietà di processi fisiologici e patologicamente-rilevanti compresi la proliferazione, l’apoptosi e la migrazione cellulare. Sono stati applicati saggi di morfogenesi per sviluppare un quadro integrato di come i fenotipi cellulari chiave cambino con e senza la segnalazione HGF. In breve, il previsto sviluppo delle cellule MCF10A in 3D impone che per 6-8 giorni esse abbiano raggiunto la dimensione finale e saranno quindi avviate all’acquisizione di un lume delle cellule in posizione centrale attraverso l’apoptosi. Usando questo come metrica, sono state impiegate co-colture 3D di MCF10A e MCF10DCIS con RMF in un mix di Matrigel-collagene per due settimane. Le cellule sono state trattate in presenza o assenza di anticorpi anti-HGF e le strutture acinose risultanti sono state analizzate utilizzando due tecniche:
1) Optical Coherence Tomography (OCT) d’immagine longitudinale in due punti temporali (una settimana e due settimane)
2) la tradizionale colorazione H & E e IF per due settimane.
Per tracciare la morfogenesi di queste linee cellulari nel corso del tempo, abbiamo utilizzato OCT, che come precedentemente visto, permette di utilizzare l’immagine longitudinale 3D in vitro senza interruzione delle strutture acinose. Inoltre, con queste immagini si possono stimare le dimensioni delle strutture acinose e il loro lumen. Dopo aver contato 50 strutture per ogni condizione, non è stata osservata alcuna differenza complessiva delle dimensioni delle co-colture MCF10DCIS, con e senza trattamento con anticorpi anti-HGF. Tuttavia, il blocco HGF determina statisticamente una diminuzione significativa nella dimensione del lume.
41 Co-colture MCF10DCIS trattate con l’anticorpo anti-HGF sono più simili all’ MCF10A non maligna.
Il numero di strutture senza un lumen è alto in co-colture MCF10A, e simile in co-colture MCF10DCIS trattati con anti-HGF, mentre le co-colture MCF10DCIS non trattate sono progredite a formare un lume. Queste differenze non possono essere attribuibili a differenze nei tassi di proliferazione delle linee cellulari, perché i tempi di raddoppiamento della popolazione (PDT in co-colture indiretti 2D) sono molto simili; PDT di MCF10A e MCF10DCIS in co-coltura con RMF sono di rispettivamente 21,3 ore nella prima e 21,5 ore, nella seconda. Quando la segnalazione HGF è bloccata, questi tempi di duplicazione sono rispettivamente 21,6 ore e 21,0 ore. Così, i cambiamenti morfogenetici si verificano in assenza di significativi cambiamenti statistici nella proliferazione. Infine, le colorazioni di H & E sono state usate per misurare l’apoptosi. Contando la presenza di corpi apoptotici nei lumi, le strutture sono state classificate in base alla presenza o meno dei corpi apoptotici. Poiché l’apoptosi è il meccanismo mediante il quale si formano i lumen, ci si aspetterebbe che nelle cellule dove la formazione dei lumen non è ancora completa (MCF10A) , i livelli di apoptosi siano superiori in un determinato punto nel tempo. Infatti, come previsto, l’apoptosi è stata maggiore nelle co-colture di MCF10A rispetto alla
42 co-coltura MCF10DCIS e che il trattamento con anticorpi anti-HGF, ripristina livelli di apoptosi di MCF10, a quelli più simili a MCF10A. Prendendo complessivamente questi risultati, il trattamento con anti-HGF riporta le cellule MCF10DCIS a fenotipi morfogenetici che ricordano le cellule meno maligne (MCF10A), bloccando in tal modo un aumento del potenziale maligno mediato dal microambiente.
3.3 Spiegazione
La progressione del cancro al seno richiede che le cellule epiteliali acquisiscano la capacità di migliorare la loro crescita e sopravvivenza. Mentre modelli biologici di cancro hanno tradizionalmente sottolineato le caratteristiche delle cellule autonome, è chiaro che anche i cambiamenti nel microambiente sono necessari. Castro e collaboratori hanno dimostrato che lo stroma derivante da lesioni DCIS, possieda già alterazioni riscontrate nei tumori completamente invasivi. Successivamente è stato riscontrato che si verificano cambiamenti genomici in molte popolazioni di cellule del microambiente.
Questi modelli ipotizzano esplicitamente che le cellule epiteliali devono essere sottoposte a un adattamento evolutivo dei loro microambienti. Altri modelli propongono che il microambiente sia la forza motrice dell’evoluzione delle lesioni benigne in tumori pienamente infiltranti; Gatenby e Gillies addirittura ipotizzano che l’origine del cancro potrebbe risiedere non in mutazioni all’interno delle cellule epiteliali, ma in cambiamenti mutazionali acquisiti o somatici, nelle cellule mesenchimali che controllano la struttura del tessuto. Mentre i dati non supportano questi ultimi modelli, allo stesso tempo suggeriscono invece che la progressione non è isolata in un singolo compartimento (l’epitelio), ma piuttosto riflette la co-evoluzione di epitelio e stroma. Interazioni eterotipiche tra epitelio e stroma favoriscono questa co-evoluzione, selezionando fenotipi complementari nello stroma e nell’epitelio. La prova della progressiva complementarietà tra stroma ed epitelio è
