Le cellule sane in un mezzo di coltura isolato bloccano la proliferazione delle cellule del cancro alla prostata
La competizione cellulare è un meccanismo omeostatico di controllo del numero di cellule in una nicchia o stroma. È quindi possibile che la competizione tra cellule normali e difettose si presenti in uno stato precanceroso. È noto che le cellule sane interrompano lo sviluppo di quelle cancerose tramite interazioni indipendenti dal contatto. Per esempio le cellule endoteliali forniscono la maggior parte del proteoglicano eparan solfato extracellulare come segnali antiproliferativi; comunque il meccanismo molecolare tramite il quale gli altri tipi di cellula, in un ambiente tumorale, si associano con le cellule cancerose non è completamente chiaro.
Per analizzare il meccanismo si è trattata una linea cellulare del carcinoma prostatico ormono-insensibile, chiamata PC-3M-luc, con un mezzo di coltura composto da cellule della prostata sane PNT-2. Dopo tre giorni d’incubazione, il mezzo di coltura PNT-2 ha inibito la crescita delle cellule PC-3M-luc di circa un 10%, in proporzione alla crescita cellulare di un nuovo mezzo di coltura.
48 Al contrario, in un mezzo di coltura composto da sole cellule PC-3M-luc, la crescita non ha mostrato nessun effetto inibitore. Per verificare che effettivamente queste procedure non abbiano influenzato l’attività delle cellule luciferase (PC-3M-luc), abbiamo utilizzato anche un saggio colorimetrico MTT, per misurare la crescita cellulare. Così è stato riscontrato che, non solo il saggio della luciferase, ma anche il saggio MTT ha mostrato un’inibizione della proliferazione PC-3M-luc tramite l’aggiunta di PNT-2, indicando che il trattamento eseguito non ha influenzato l’attività luciferase. Questi risultati indicano che le cellule sane possono secernere alcune molecole che possono sopprimere la proliferazione cellulare cancerosa.
In uno studio recente si è mostrato che i miRNA contenuti negli esosomi vengono rilasciati e la loro secrezione è strettamente regolata dalla sfingomielinasi 2 neutrale, che è solita idrolizzare le sfingomieline per generare ceramidi e scatenare la crescita degli esosomi. Sono state raccolte due aliquote separate di mezzi di coltura composte da cellule PNT-2
49 Attraverso immuno-blotting è stata verificata la presenza di esosomi isolati tramite il rilevamento della proteina CD63, che è per l’appunto, un ben noto indicatore di esosomi; e l’attivita del GW4869 è stata confermata da una riduzione nella quantità della proteina esosomiale.
Il mezzo di coltura preparato in presenza del composto GW4869 ha annullato la maggior parte dell’attività oncosoppressiva del mezzo di coltura PNT-2 non trattato. Inoltre, la proliferazione delle cellule PC-3M-luc è stata inibita dall’aggiunta della frazione esosomiale, isolata dal mezzo di coltura PNT-2, tramite ultracentrifugazione. Queste osservazioni suggeriscono che i miRNA esosomiali derivati dalle cellule non cancerose, sono stati trasferiti alle cellule cancerose causando un’inibizione della loro proliferazione. Per visualizzare il trasferimento dell’esosoma contenente ceramide da PNT-2 a PC-3M-luc in vitro è stato utilizzato un esperimento di co-coltura. Prima della cocoltura, 2 X di cellule PNT-2 sono state incubate per 30 minuti con una tintura rosso-fluorescente BODIPY-ceramide, che può etichettare gli esosomi all’interno delle cellule. Dopo averle lavate 5 volte con il PDS, sono stati aggiunti nei piatti di coltura numeri uguali di cellule
50 PC-3M-luc, etichettate dal PKH67 verde-fosforescente, che è un indicatore di membrana cellulare. Tre ore dopo non abbiamo osservato nessuna cellula PC-3M-luc con un colore giallo, indicando che le tinture rosse riportate erano state rimosse affondo, come se in 3 ore la tintura fosse già stata incorporata direttamente all’interno delle cellule.
Al contrario, dopo 12 ore di cocoltura, è stata osservata una fluorescenza gialla nelle cellule PC-3M-luc etichettate di verde, suggerendo che gli esosomi contenenti ceramide delle cellule PNT-2 erano stati trasferiti alle cellule PC-3M-luc. Questo risultato è confermato dall’esperimento di assorbimento, svolto utilizzando gli esosomi etichettati PKH67 purificati del mezzo di coltura PNT-2 . È stata rilevata una fluorescenza verde nelle cellule PC-3M-luc dopo 16 ore d’incubazione, fornendo una prova diretta per l’assorbimento esosomiale da parte delle cellule cancerose.
I miRNA oncosoppressori downregolati nelle cellule cancerose sono stati secreti dalle cellule sane
Si propone un modello ipotetico di origine tumorale che coinvolge la competizione cellulare e i miRNA antiproliferativi . In un ciclo di competizione cellulare, i miRNA inibitori della crescita vengono rilasciati attivamente dalle cellule sane, per uccidere quelle
51 difettose, che hanno una parziale attività oncogenica, riportandoli così ad uno stato di salute. Anche se la capacità inibitoria di questi miRNA appare limitata con un singolo trattamento di PNT-2, comunque essi possono potenzialmente prevenire la comparsa di cellule tumorali in una condizione fisiologica.
Poiché le tante cellule sane esistenti, forniscono continuamente e per lungo tempo dei miRNA oncosoppressori alle cellule nascenti iper-proliferanti, una concetrazione locale di miRNA secreti può diventare abbastanza grande da contenere la nascita del tumore. Comunque ci può essere una via tramite la quale l’interruzione del sistema omeostatico porta all’espansione del tumore. Se le cellule precancerose acquisiscono resistenza ai miRNA antiproliferativi o le normali cellule non possono fornire un’adeguata quantità di miRNA, questo sistema difensivo non riuscirà a mantenere una condizione salutare. Per testare quest’ipotesi abbiamo controllato la quantità di secrezione dei rappresentativi miRNA oncosoppressori, comparando le cellule PNT-2 e PC-3M-luc con l’analisi Taq- Man QRT-PCR. Nel cancro alla prostata era già nota una disfunzione dell’espressione di miR-16, miR-205 e miR-143, e qua risultano essere downregolati nelle cellule PC-3M-luc
52 a livello cellulare e extra cellulare. L’inibitore GW4869 ha represso la secrezione di miR- 143 dalle cellule PNT-2 in modo dose-dipendente, mentre il suo livello cellulare non è stato alterato. In più, l’applicazione di piccoli RNA interferenti specifici per il gene umano di sfingomielinasi 2 neutrale ha abbattuto i propri mRNA, dando come risultato una profonda diminuzione nella secrezione di miR-143.
Al contrario, l’espressione di miR143 nelle cellule non è cambiata dopo la trasfezione della siRNA sfingomielinasi 2 neutrale. La valutazione di tutti questi risultati, suggerisce che i miRNA oncosoppressivi sono implicati nel processo d’inibizione della crescita dal mezzo di coltura di PNT-2.
Per una comprensione globale del cambiamento dell’espressione nelle cellule sane e cancerose, abbiamo effettuato un’analisi microarray dei miRNA su gli RNA esosomiali e cellulari, purificati dalle PNT-2 e PC-3M-luc. Dalla sequenza di dati ottenuti dall’analisi dei miRNA esosomiali delle PNT-2, sono stati individuati 40 miRNA la cui quantità cellulare era dimezzata nelle PC-3M-luc. I miRNA selezionati, come era previsto, includono diversi tipi di miRNA oncosoppressori, come miR-15a, la famiglia dei miR-200, miR-148a, miR-193b, miR-126, e miR-205. Questa osservazione supporta la
53 teoria, secondo la quale i miRNA oncosoppressori vengono trasferiti dalle cellule sane alle cancerose, secondo il gradiente di concentrazione del miRNA.
Si è fino ad ora dimostrato che le cellule sane hanno una maggiore secrezione di miRNA oncosoppressori rispetto alle cancerose; rimane però poco chiaro se questi miRNA influiscano o meno sulla proliferazione delle cellule, nello sviluppo iniziale del cancro. Per rispondere a questa domanda si è introdotto un miR-143 sintetizzato sia nelle PNT-2 che nelle PC-3M-luc e si è fatta una stima dei loro tassi di proliferazione. Dopo tre giorni di trasfezione i miR-143 analoghi hanno indotto un’inibizione della crescita nelle PC-3M-luc, mentre invece le molecole senza RNA (mock) e le molecole di controllo negativo (control) non hanno sortito alcun effetto.
Al contrario l’miR-143 esogeno transdotto non ha mostrato il suo effetto antiproliferativo nelle cellule PNT-2, indicando che l’miR-143 in eccesso non ha conferito un addizionale effetto inibitore sulle cellule sane, nelle quali l’espressione di miR-143 è mantenuta a un livello fisiologico. Questa scoperta suggerisce che le cellule animali possono avere la loro propria soglia per un’attività di miRNA. La differente sensibilità trovata in diversi tipi di cellule aiuta i miRNA a compiere la loro funzione di combattere esclusivamente le cellule precancerose. È possibile che i miRNA derivati dalle cellule PNT-2 quantomeno possano integrare i segnali di soppressione della crescita che erano diminuiti nelle cellule
54 cancerose. Così, l’miR-143 secreto potrebbe essere coinvolto nel sistema regolatore competitivo della cellula.
L’miR-143 secreto inibisce la proliferazione in vitro del cancro alla prostata
Per esaminare se l’miR-143, rilasciato dalle cellule sane, eserciti un’attività
antiproliferativa, abbiamo generato delle cellule HEK293, che sovraesprimono miR-143 circa 200 volte rispetto alle molecole di controllo negativo (control).
Dopo 3 giorni d’incubazione nel mezzo di coltura composto da cellule HEK293, che sovraesprimono miR-143 e cellule HEK293 di controllo negativo, le cellule PC-3M-luc presentavano una diminuzione di circa il 50% nella proliferazione. È molto importante sottolineare che, la proliferazione riprendeva nella trasfezione con cellule anti-miR-143. Questi dati indicano che l’inibizione della crescita è attribuibile al miR-143 contenuto nel sovranatante delle cellule HEK293 che sovraesprimono miR-143. In accordo con la secrezione esosomiale di miRNA, abbiamo osservato un risultato simile utilizzando frazioni di esosomi purificati da cellule HEK293 che esprimono miR-143.
55 Per studiare ulteriormente il trasferimento di miRNA a livello molecolare, è stata fatta un’analisi dell’espressione del gene target e del saggio reporter dell’miRNA di risposta. L’analisi di immunoblotting mostra che, l’aggiunta del mezzo di coltura isolato composto da cellule HEK293 che sovraesprimono miR-143, riduce significativamente l’espressione di KRAS, un gene target per il miR-143, nelle cellule PC-3M-luc. In aggiunta, sono state effettuate delle analisi luciferasi utilizzando un vettore sensoriale contenente renilla- luciferina (2-monoossigenasi), fuso in tandem all’estremità della sequenza 3’-UTR. Le attività della renilla-luciferina normalizzate erano ridotte dal trattamento del mezzo di coltura contenente cellule HEK293 arricchite con miR-143. Al contrario, non si è riportato alcun cambiamento della luminescenza, utilizzando un vettore mutato, al posto di un vettore sensoriale intatto.
56 Inoltre, si è determinata la quantità cellulare di miR-143 nelle cellule PC-3M-luc incubate in un mezzo di coltura composto da cellule HEK293 o cellule HEK293 che sovraesprimono miR-143 attraverso il metodo della QRT-PCR. Il miR-143 era chiaramente aumentato a livello cellulare dal trattamento nel mezzo di coltura arricchito di miR-143. Questi risultati indicano che il miR-143 secreto, mostra il suo effetto d’inibizione della crescita on-target nelle cellule precancerose adiacenti, sopprimendo dunque la loro crescita anomala.
Le funzioni del miR-143 secreto come oncosoppressore in vivo
Non è mai stato dimostrato che i miRNA extracellulari oncosoppressori possano essere trasferiti alle cellule viventi e indurre un cambiamento fenotipico in vivo. Per affrontare questa possibilità è stato iniettato nei topi glabri, insieme alle cellule PC-3M-luc, un mezzo di coltura composto da cellule HEK293 che sovraesprimono miR-143 oppure da cellule HEK293 parentali. Quattro giorni dopo il trapianto sottocutaneo, è stato eseguito un imaging (diagnostica per immagini) in vivo e iniezioni di mezzi di coltura, in accordo con la tabella seguente:
Le espansioni tumorali sono state contenute per 8 giorni con somministrazioni intratumorali del mezzo di coltura arricchito con miR-143 e in seguito, all’ottavo giorno le masse tumorali si sono ridotte di circa 0,5 volte.
57 Le immagini luminescenti delle cellule PC-3M-luc inoculate durante il giorno 8, mostrano l’attività luciferasi nei topi trattati con mezzi di coltura arricchiti di miR-143 e con mezzi di coltura di controllo.
In accordo con la scoperta che miR-143 non riduceva l’attività di crescita delle cellule sane in vitro, non è stata osservata nessuna tossicità in questi topi. Inoltre l’espressione dei geni target miR-143 come il KRAS e le ERK5, sono diminuite dopo le iniezioni del mezzo di coltura contenente miR-143 trasdotto, indicando un trasferimento di miRNA in vivo. Così, il modello xenografico di cancro alla prostata in esame, suggerisce che i miRNA
58 oncosoppressori secreti dalle cellule sane potrebbero efficientemente integrarsi nei tumori adiacenti in vivo.