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Effetti del gene PPAR-α sull'edema degli arti indotto da carragenina

Una volta messo a punto il modello di risposta infiammatoria acuta (infiammazione degli arti carragenina indotto) (Hargreaves et al., 1988), è stato investigato il ruolo del ligando del recettore PPAR-α nell’infiammazione acuta. Nel gruppo di topi di controllo WT (wild type) e nel gruppo di controllo di topi PPAR-αKO non è stata osservata alcuna formazione di edema degli arti (dati non mostrati). L’iniezione subplantare di carragenina in topi WT ha portato a un processo infiammatorio il cui sviluppo si è dimostrato essere direttamente proporzionale al tempo con un picco a 4-5 ore. L’assenza del gene PPAR-α funzionale nei topi PPAR-αKO ha comportato l’aumento della formazione di edema negli arti in tutti i tempi sperimentali considerati.

Successivamente, i tessuti degli arti sono stati esaminati per valutare l’attività della mieloperossidasi (MPO) quale indicatore di infiltrazione neutrofilica. Come mostrato in figura 1b, i livelli dell’attività della MPO sono significativamente aumentati (P<0.01) negli arti del gruppo WT a 4 ore dopo l’iniezione di carragenina se comparati coi gruppi di controllo WT e PPAR-αKO. L’assenza del gene PPAR-α funzionale nei topi PPAR-αKO ha determinato un notevole aumento dell’attività della MPO (fig 1b).

Nei tessuti degli arti dei gruppi di controllo WT e PPAR-αKO non è stata osservata alcuna alterazione istologica (fig 2a e 2b). Al contrario, l’esame istologico di biopsie di tessuti degli arti di topi WT trattati con carragenina (fig 2c) ha evidenziato un notevole quadro infiammatorio, inclusa una marcata infiltrazione cellulare (fig 2d).

L’assenza di funzionalità del gene PPAR-α nei topi PPAR-αKO ha comportato un significativo aumento di cambiamenti patologici nei tessuti degli arti (fig 2e), inclusa una maggiore infiltrazione di cellule infiammatorie (fig 2f).

Il possibile ruolo del gene PPAR-α nell’apoptosi nell’infiammazione acuta è stato valutato con l’identificazione tramite metodica immunoistochimica del Fas ligando (FasL). Dai tessuti degli arti dei topi di controllo WT (fig 3a) e PPAR-αKO (fig 3b) non si è ottenuta alcuna colorazione positiva. A 4 ore dalla somministrazione di carragenina, la colorazione positiva per FasL è stata evidenziata nel tessuto infiammato degli arti di topi WT (fig 3c), localizzata soprattutto nelle cellule infiammatorie (fig 3d) infiltrate nel connettivo. La colorazione FasL positiva nelle cellule infiammatorie infiltrate nel tessuto connettivo (fig 3e) era significativamente aumentata nei topi PPAR-αKO a 4 ore dalla somministrazione di carragenina (fig 3f).

Fig. 1. Effetti del gene funzionale PPAR α nell'insorgenza di edema plantare del polpastrello (a) e nell'infiltrazione neutrofilica (b) indotte

dall'iniezione sottoplantare di carragenina in topi. L'edema a carico del polpastrello è stato indotto dall'iniezione nel cuscinetto destro di 0.1 ml di soluzione salina sterile contenente l'1% di carragenina. Il volume del polpastrello è stato misurato prima dell'iniezione e ad intervalli di 1 ora per le 4 ore successive. La sua misurazione è espressa come differenza fra ogni singolo tempo sperimentale e il volume di partenza. Dopo 4 ore il tessuto del polpastrello è stato raccolto, pesato e analizzato per valutare l'attività mieloperossidasica (MPO). L'iniezione sottoplantare di carragenina in topi WT ha determinato una infiammazione crescente nel tempo, con un picco entro le 4-5 ore (a). L'attività

Fig. 2. Effetti del gene PPAR α su lesioni a carico

del polpastrello.

Le biopsie del polpastrello sono state ottenute 4 ore dopo l'iniezione di carragenina. I tessuti sono stati colorati con colorazione tricromica. Non sono state osservate alterazioni nei tessuti raccolti da topi wild

type di controllo (WT) (a) e da topi sham PPAR α

(b). Al contrario significativi cambiamenti

infiammatori sono stati rilevati in polpastrelli di topi prelevati da topi WT (c) associati a infiltrazione cellulare (d). L'assenza del gene funzionale PPAR- α in topi PPAR- α KO risulta in un significativo aumento del danno nel tessuto plantare (e) e al contempo della presenza di numerose cellule infiammatorie (f).

Fig. 3. Localizzazione immunoistochimica di FasL in

polpastrelli di topo.

Le biopsie plantari sono state effettuate 4 ore dopo l'iniezione di carragenina. Le sezioni sono state incubate overnight con anticorpo anti-FasL (1:500 in PBS, v/v). Il counter-stain è stato sviluppato con DAB (brown color) e nuclear fast red (background rosso).

Non sono state rilevate colorazioni positive per FasL nel tessuto di topi WT sham (a) e da topi sham PPAR-α KO (b). Al contrario sono stati osservate colorazioni positive per FasL 4 ore dopo iniezione di carragenina nel tessuto plantare di topi WT (c), pricipalmente localizzate nelle cellule infiammatorie (d), infiltrate nel tessuto connettivo (vedi frecce).

L'assenza del gene funzionale PPAR- αin topi PPAR- α KO risulta in un significativo aumento della colorazione positiva per FasL delle cellule infiammatorie infiltrate nel tessuto connettivo (e e f, vedi frecce).

Effetti del gene PPAR-α sulla pleurite indotta da carragenina

Per analizzare il possibile ruolo del recettore PPAR-α durante l’infiammazione acuta nel polmone, è stato valutato l’effetto della delezione del gene PPAR-α in una pleurite carragenina indotta, a 4 ore dalla somministrazione di carragenina.

Tutti i topi WT in seguito a somministrazione di carragenina hanno sviluppato una pleurite acuta con la produzione di essudato torbido (fig 4a). Rispetto ai topi di controllo WT e PPAR-

αKO, la somministrazione di carragenina in topi WT ha indotto un aumento significativo nel

numero di cellule polimorfonucleate (PMNs) nello spazio pleurico (fig 4b). La presenza di essudato pleurico e il numero di cellule infiammatorie nella cavità pleurica erano significativamente aumentati a 4 ore dalla somministrazione di carragenina in assenza del gene PPAR-α funzionale nei topi PPAR-αKO.

La notevole presenza di cellule infiammatorie nella cavità pleurica è sembrata essere correlata al flusso dei leucociti nel tessuto polmonare. Quindi è stato investigato il ruolo del gene PPAR-

α nell’infiltrazione di neutrofili misurando l’attività della MPO, che è risultata

significativamente elevata (P<0.001) a 4 ore dalla somministrazione di carragenina nei topi WT (fig 4c). Nei topi PPAR-αKO, l’attività nei polmoni di MPO era significativamente aumentata rispetto a quella negli animali WT (fig 4c).

Nei tessuti polmonari dei topi di controllo WT (fig 5a) e PPAR-αKO (fig 5b) non sono state osservate alterazioni istologiche. Al contrario, l’esame istologico di sezioni polmonari di tutti i topi WT trattati con carragenina hanno mostrato lesioni tissutali (fig 5c) e infiltrazione di cellule infiammatorie (fig 5d). I tessuti polmonari prelevati a 4 ore dalla somministrazione di carragenina in topi PPAR-αKO hanno mostrato un notevole aumento delle lesioni polmonari (fig 5e) così some una presenza significativa di cellule infiammatorie (fig 5f).

Per valutare la capacità del gene PPAR-α di modulare il processo infiammatorio regolando la secrezione di altre citochine, sono stati analizzati i livelli di citochine proinfiammatorie nei gruppi WT e PPAR-αKO. A 4 ore dalla somministrazione di carragenina, nell’essudato pleurico di topi WT è stato evidenziato un aumento significativo di TNF-α (fig 6a) e IL-1β (fig 6b), tuttavia la produzione di questi fattori era maggiore nei topi PPAR-αKO rispetto ai WT.

In accordo con i risultati riscontrati per l’essudato pleurico, i tessuti polmonari dei topi WT trattati con carragenina hanno mostrato un aumento significativo dell’mRNA di TNF-α (fig 6c) e IL-1β (fig 6d) rispetto ai topi di controllo WT e PPAR-αKO. I livelli dell’mRNA di TNF-α e IL-1β nei polmoni di topi PPAR-αKO trattati con carragenina erano significativamente maggiori rispetto a quelli di topi WT misurati nelle stesse condizioni.

In seguito abbiamo valutato tramite immunoistochimica l’espressione a livello polmonare di TNF-α e IL-1β. Nei polmoni di topi di controllo WT e PPAR-αKO non è stata evidenziata positività per TNF-α (fig 7a e 7b). Al contrario, i tessuti di topi WT 4 ore dopo la somministrazione di carragenina hanno mostrato positività per TNF-α, localizzato nelle cellule infiammatorie infiltrate, negli pneumoniti, così come nella parete vascolare (fig 7d). Nei topi PPAR-αKO trattati con carragenina, la positività per TNF-α nelle cellule infiammatorie infiltrate, negli pneumoniti e nella parete vascolare (fig 7f) era significativamente superiore rispetto a quella nei topi WT.

In modo analogo, nessuna positività per IL1-β è stata osservata nei polmoni dei topi WT di controllo (fig 8a) e topi PPAR-αKO di controllo (fig 8b). A 4 ore dalla somministrazione di carragenina, la positività per IL1-β, localizzata nelle cellule infiammatorie infiltrate, negli pneumoniti, così come nella parete vascolare, è stata osservata in tessuti polmonari ottenuti da topi WT. Nei soggetti PPAR-αKO trattati con carragenina, questa positività per IL1-β nelle cellule infiammatorie infiltrate, negli pneumoniti e nella parete vascolare (fig 8e) era significativamente maggiore rispetto a quella riscontrata nei topi WT.

Il potenziale ruolo del gene PPAR-α nell’apoptosi durante processi infiammatori polmonari acuti è stata valutata con l’evidenziazione tramite immunoistochimica del FasL. Dai topi di controllo WT e PPAR-αKO (fig 9a e 9b) non è stata evidenziata positività per FasL nei tessuti polmonari. A 4 ore dalla somministrazione di carragenina, positività per FasL è stata riscontrata nei polmonari di topi WT (fig 9c), localizzata specialmente nella parete vascolare e negli pneumoniti. Questa positività per FasL nella parete vascolare e negli pneumoniti era significativamente aumentata nei topi PPAR-αKO, cioè in assenza del gene PPAR-α funzionale. (fig 9d).

Fig. 6. Gli effetti del gene PPAR-αsulla produzione di TNF-α and IL-1β sono stati valutati nell'essudato pleurale. e nel tessuto polmonare 4 ore dopo l'iniezione di carragenina utilizzando un kit commerciale ELISA colorimetrico per valutare la componente proteica, mentre l'RNA codificante per tali citochine è stato quantificato con Real Time PCR

Un significativa produzione di TNF-α (a) e IL-1β(b) è stata osservata nell'essudato pleurale raccolto da topi WT. L'assenza del recettore funzionale PPAR-α in topi PPAR-αKO ha determinato un significativo incremento della produzione di TNF- α (a) and IL-1β(b) nell'essudato pleurico. In maniera analoga è stato osservato anche un incremento dei livelli di mRNA codificante per TNF-α(c) and IL-1β(d) nel tessuto polmonare di topi WT trattati con carragenina.

Nel tessuto polmonare di topi PPAR-αKO trattati con carragenina i livelli di mRNA per TNF-α(c) and IL-1β(d) erano significativamente più elevati se comparati a quelli di topi PPAR-αWT misurati nelle medesime condizioni. I risultati della real-time PCR sono espressi come rapporto fra il numero di copie della citochina target e il numero di copie del gene housekeeeping (GAPDH) al fine di normalizzare i dati ottenuti. *, P < 0.01, vs sham; o, P <0.01, vs carragenina-WT group.

Fig. 5.

Effetti del gene PPAR α in danno al polmone. Le biopsie sono state effettuate 4 h dopo la iniezione di carragenina. I tessuti sono stati colorati con ematossilina eosina. Non sono state rilevate alterazioni nel tessuto di topi WT sham di controllo (a) e da topi sham PPAR-α (b). Al contrario sono stati osservati danni nel tessuto polmonare di topi iniettati con carragenina (c) e infiltrazione di cellule infiammatorie (d) . L'assenza del gene funzionale PPAR- αin topi PPAR- α KO risulta in un significativo aumento del danno nel tessuto polmonare (e) e al contempo della presenz adi numerose cellule infiammatorie (f).

Fig. 7. Localizzazione immunoistochimica di TNF α

nel tessuto polmonare. Le sezioni sono state incubate overnight con anticorpo anti- TNF α risospeso in PBS 1:500 . Il rilevamento di colore è stato realizzato con DAB (marrone) e fast red nucleare (background rosso).

Non è stata rivelata colorazione positiva per tale citochina in polmoni di nel tessuto di topi WT sham di controllo (a) e da topi sham PPAR-α (b). Al contrario sono state osservate colorazioni positive per danni nel tessuto polmonare di topi iniettati con carragenina (c) e infiltrazione di cellule infiammatorie (d) . L'assenza del gene funzionale PPAR- α in topi PPAR- α KO risulta in un significativo aumento del danno nel tessuto polmonare (e) e al contempo della presenza di numerose cellule infiammatorie (f).

Fig. 8. Localizzazione immunoistochimica di IL-1β nel tessuto polmonare. Le biopsie polmonari sono ste prelevate 4 ore dopo

l'iniezione di carragenina. Le sezioni sono state incubate overnight con anticorpo anti-IL 1β risospeso in PBS 1:500 . Il rilevamento di colore è stato realizzato con DAB (marrone) e fast red nucleare (background rosso). Non sono state rilevate colorazioni positive per IL 1β nel tessuto polmonare di topi di controllo WT sham (a) e di topi sham PPAR-α (b). La colorazione positiva per IL 1β (c), prevalentemente localizzata nelle cellule infiammatorie infiltrate, nello spazio vascolare (c) è stata evidenziata in tessuto polmonare di topi WT. L'assenza del gene funzionale PPAR-α nei topi PPAR-α KO ha decretato un significativo aumento della colorazione positiva per IL 1β (d) nelle cellule infiammatorie infiltrate, nei pneumociti e nello spazio vascolare e nei pneumociti (e).

Fig. 4.Effetti del gene funzionale PPAR-α sulla produzione di essudato indotto da carragenina (a), sull'accumulo di polimorfonucleati in cavità pleurica (b) e sull'infiltrazione di neutrofili nel polmone (c). La pleurite è stta indotta mediante somministrazione di 0,2 ml di soluzione salina sterile contenente carragenina all'1% a livello del sesto spazio intercostale. Dopo 4 ore è stato calcolato l'essudato totale prodotto previa sottrazione di quello iniettato. I leucociti presenti nell'essudato sono stati contati con camera di Burker mediante colorazione vitale Tripan Blue.

E' stata registrata una rilevante produzione di essudato pleurico (a) e una imponente infiltrazione di polimorfonucleati (b) nella cavità pleurica di topi WT. Inoltre nel tessuto polmonare di topi WT trattati con carragenina si è notato un incremento dell'attività mieloperossidasica, indicativa dell'infiltrazione dei neutrofili (c). L'assenza del gene funzionale PPAR-α in topi PPAR-αKO determina un notevole incremento dell'essudato pleurico (a) e del numero di celule infiammatorie in cavità pleurica (b) e nel polmone (c) 4 ore dopo la somministrazione di carragenina. *, P < 0.01, versus sham; o, P <0.01, versus gruppo carragenina-WT.

Fig. 9. Localizzazione immunoistochimica di FasL nel polmone. Le biopsie polmonari sono state prelevate 4 ore dopo l'iniezione di carragenina. Le sezioni sono state incubate overnight con anticorpo anti-Fas risospeso in PBS 1:500 . Il rilevamento di colore è statorealizzato con DAB (marrone) e fast red nucleare (background rosso). Non sono state rilevate colorazioni positive per FasL nel tessuto polmonare di topi di controllo WT sham (a) e di topi sham PPAR-α (b). La colorazione positiva per FasL (c), prevalentemente localizzata nello spazio vascolare (vedi frecce) e nei pneumociti (vedi frecce a punta larga), è stata evidenziata in tessuto polmonare di topi WT. L'assenza del gene funzionale PPAR-α nei topi PPAR-α KO ha decretato un significativo aumento della colorazione positiva per FasL (d) nello spazio vascolare (vedi frecce) e nei pneumociti (vedi frecce a punta larga),