3. METODICHE
3.4. Polymerase Chain Reaction (PCR)
3.4.1. Specificità dell’amplificazione e selezione dei primers
La specificità dell’amplificazione dipende da quanto la sequenza target si differenzia da quella dei primers selezionati per l'appaiamento specifico (Tab 3.2) .
Per campioni complessi di DNA, come il DNA genomico totale di una cellula di mammifero o il genoma totale di un virus a DNA, spesso è sufficiente progettare due primer lunghi 20 nucleotidi ciascuno. Questo perché, in condizioni normali, la probabilità che si verifichi accidentalmente un appaiamento perfetto in un qualche punto del genoma per ciascuno dei primer è estremamente bassa, e la probabilità che entrambe le sequenze si trovino per caso a
e sequenza bersaglio perfettamente appaiate, è comunque possibile osservare prodotti spuri di amplificazione (prodotti aspecifici). Questo può succedere se una o entrambe le sequenze scelte come primer contengono parte di una sequenza di DNA ripetitivo, anche se solitamente i primer sono scelti in modo da evitare l’appaiamento con questo tipo di sequenze.
Lunghezza Solitamente si utilizzano primer di 18-24 nucleotidi di lunghezza. La lunghezza del primer garantisce la specificità e riduce la possibilità di legame in siti non specifici. Tuttavia, primer più lunghi di 24 basi non garantiscono una maggiore specificità in quanto possono portare ad appaiamenti interni aspecifici.
Composizione in basi
Sostanzialmente vanno evitate le unità ripetute in tandem di uno o più nucleotidi. La % complessiva in GC deve essere intorno al 40-60% o rispecchiare il contenuto di GC del DNA bersaglio. Si consiglia di disegnare dei primers nei quali la maggiore quantità di G e C sia nella regione centrale o all’estremità 5’, al fine di incrementarne la stabilità e di conferire una maggiore stabilità al complesso primer-sequenza target.
Struttura secondaria
Vanno evitate sequenze la cui struttura secondaria tenda a formare ripiegamenti a forcina.
Estremità 3’ Va evitata la complementarità tra le due basi all’estremità 3’ dei due primer, altrimenti essi possono formare dei dimeri, che riducono l’efficienza dell’amplificazione. Inoltre, è preferibile disegnare primer con almeno tre A o T nelle ultime 5 basi al 3’, evitando regioni ricche di GC in questa estremità.
Infine, è importante evitare nucleotidi aspecifici proprio in tale regione, in quanto è necessario che gli ultimi nucleotidi al 3’ si appaino perfettamente alla sequenza bersaglio per dare inizio alla reazione di estensione ad opera della polimerasi.
Tabella 3.2 Regole per il disegno dei primer per la PCR.
Un altro importante parametro che caratterizza i primers è la temperatura di melting (Tm). Essa rappresenta la temperatura alla quale il 50% del primer e della sequenza bersaglio sono presenti sotto forma di una molecola a doppio filamento. La Tm è necessaria per stabilire la temperatura di annealing della PCR. Teoricamente, una temperatura di annealing deve essere abbastanza bassa da garantire l’ibridizzazione del primer alla sequenza target, ma sufficientemente alta da limitare gli appaiamenti aspecifici. La temperatura di annealing viene solitamente stabilita intorno e 3°C al di sotto della Tm dei primer o di quella del primer a Tm inferiore nel caso in cui i due primer utilizzati abbiano due Tm diverse.
Per calcolare la Tm di un primer si possono utilizzare diverse formule, ma le due più comunemente utilizzate sono:
1) Tm= 4°C x (G+C) + 2°C x (A+T)
2) Tm= 81,5 + 16,6 x (log10[Na+]) + 0,41 x (%G+C) – 675/n Dove n = numero di basi e
La prima di queste formule è valida per primer con meno di 18 basi, mentre la seconda si basa sul contenuto di GC del primer e sulla concentrazione di sali nella reazione e può essere applicata anche a primer più lunghi.
Nel corso delle nostre sperimentazioni le coppie di primers per ogni citochina sono state in parte tratte dalla letteratura e in parte disegnate mediante il software Oligo (Molecular Biology Insights, Cascade, CO, USA), (tabelle 3.3, 3.4, 3.5 e 3.6) tali da evitare hairpin, formazione di primer dimers e al contempo, ottenere frammenti di lunghezza opportuna da poter essere amplificati mediante Real Time (Bustin, 2000).
Per ottimizzare la resa dell'amplificazione si è ricorsi anche all'utilizzo di reazioni di amplificazione a gradiente in modo da identificare la temperatura ottimale per l'appaiamento dei due primer di interesse (Figura 3.3).
Mk 1 2 3 4 5
Fig 3.3. Gel di agarosio al 2% colorato con etidio
bromuro.Per ottimizzare la resa dell'amplificazione si è ricorsi anche all'utilizzo di reazioni di amplificazione a gradiente in modo da identificare la temperatura ottimale per l'appaiamento dei due primer di interesse. In tale gel si evidenzia l'amplificato per il gene CALCA di cane ottenuto a diverse temperature di annealing da milza. Lane
1: 56,9°C, lane 2: 58,1°C; lane 3: 59,4°C; lane 4: °C lane
Primers disegnati mediante software OLIGO per le diverse specie animali
Gene target Primers forward (5’-3’) Primer reverse (5’-3’) Frame (bp)
GADPH GGCGTGAACCACGAGAAGTATAA CCCTCCACGATGCCAAGT 119
IL 2 TATCTGTTCGGTCGTTCAT GTTAACCTTGGGCGCGTAA 236
IL 8 AGCTGGCTGTTGCTCTCTTGG ACCTGCACAACCTTCTGCAC 262
IFN γ AGCCCAGATGTAGCTAAGGG CTCCAGTTTCTCAGAGCTGC 216
IL 6 AGGCGATTTGCTTGATCAG TCTTTGCGTTCTTTACCCA 188
TNF α AAGCATGATCCGGGATGT TGGGCTACCGGCTTGTTAC 316
IL 1 ββββ AACAGCCATGGCAACCGTA GGCCACGATGACCGACA 232
IL 10 TGCACAGCTTACTGTTGACC CGCAGGGTCTTCAGCTTCTC 178
Tab. 3.3: Primers disegnati per la specie bovina (Bos Taurus)
Gene target
Primers forward (5’-3’) Primer reverse (5’-3’) Frame
(bp)
ββββ actina CTGGCACCACACCTTCTACAACGAG TCACCGGAGTCCATCACGA 214
IL 2 GCTTGCATCGCACTAACTC CCTTCTTGGGCATGTTAAT 187
IL 8 TCTCTTGGCCGTCTTCCTG CCGTTGACGAGCTTTACAA 195
IFN γ GTGTGCGATTTTGGGTTCTTCTA TTGAATGACCTGGTTATCT 235
IL 6 CTGCCCTGAAAAATGAGATGTGTA ACTCGTTCTGGAGGTACTC 204
TNF α AGCTCTCCTGGGCACCTAC TGGGGTTCGGAGGGGTGTTAC 205
IL 1 ββββ GAGGCAGCCATGGCAGCAGTA TGTGAGCAGGGAACGGGTATCTT 257
IL 4 CCTTTGCTGGCCCGAAGAA GTACAGCAGGTCCCGTTTG 157
Primers disegnati mediante software OLIGO per le diverse specie animali
Gene target
Primers forward (5’-3’) Primer reverse (5’-3’) Frame
(bp)
GADPH AACATCATCCCTGCATCCA CAGATCCACGACGGACACA 123
IL 2 CTCGCATCCTGTGTCACAT GGAGCTCCTGTAGGTCCAT 160
IFN γ TTTAACTCAAGTGGCATAG CAAACTTGGCAATACTCA 250
IL 6 TGAGATCTACTCGGCAAAC TTGTTCTCTACGAAGAACT 125
TNF α CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA GGGTTGTACCTTGTCTACTCCCA 175
IL 1 ββββ CAACCAACAAGTGATATTCTCCATG GATCCACACTCTTCCAGCTGCA 152
MCP 1 TGTCACCAAGCTCAAGAGA CAGATTTACGGGTCAACTT 173
Tab. 3.5 Primers disegnati per la specie murina (Mus musculus)
Gene target
Primers forward (5’-3’) Primer reverse (5’-3’) Frame
(bp)
GADPH GGCGTGAACCACGAGAAGTATAA CCCTCCACGATGCCAAGT 119
TGF ββββ GAGAAGAACTGCTGCGTCC TTGCTGTACTGCGTGTCCA 146
CALCA AGTCCTCCCCCTTCCTGGCTTTCA CCGCTGGCTATGTCCCTTTTCTTG 361
IL 8 ACTTCCAAGCTGGCTGTTGC GGCCACTGTCAATCACTCT 172
IFN γ TTTCAGCTTTGCGTGATTT ATTTGGCTCTGAATGATTG 188
IL 6 TGCCACTTCAAATAGTCTA AGTTTGGGAAGATGTAGGT 168
TNF α TGCCGTCAGATGGGTTGTA TTGATGGCAGAGAGTAGGT 145
IL 1 ββββ AGAAGCTGAAGAAGCCCTG CCTGTAACTTGCAGTCCAC 154
Per testare l’efficacia dei primers è stato raccolto il sangue in EDTA da bovini adulti clinicamente sani. Linfociti in particolare (95%) e limitate cellule periferiche mononucleate (PBMCs) sono state separate mediante gradiente di densità di centrifugazione usando il composto privo di tossine Ficoll-Paque (gravità specifica 1.077, Pharmacia Biotech, Quebec, Canada) e lavate con soluzione fosfato salina (PBS).
Tale metodica impedisce che durante le manualità di prelevamento del buffy coat permangano dei residui di globuli rossi che contenendo emoglobina vadano ad inficiare la funzionalità dell’enzima di amplificazione Taq polimerasi.
Queste sono state incubate fino a raggiungere la concentrazione di 5x106 cellule per ml e messe in piastra in RPMI 1640 medium (Gibco BRL Burlington, Ont., Canada) contenente il 10 % di siero fetale bovino (Gibco BRL) supplementato con streptomicina, penicillina G e furazolidone ad una concentrazione di 100mg/ml rispettivamente. Per catalizzare le reazioni mitotiche fra le PBMCs è stata addizionata della Concanavalina A (ConA) alla sospensione cellulare ad una concentrazione di 10 mg/ml. Quindi un volume di 2 ml di sospensione cellulare è stata posta ad incubare per 24 e 48 ore a 37°C in atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2.
In ciascuna mix di reazione sono contenuti diversi reagenti a seconda del kit commerciale considerato (tabelle 3.7 e 3.9) e dopo aggiunta di cDNA, sottoposti a cicli di amplificazione come elencato nelle tabelle 3.8 e 3.10 con temperature di annealing per l’appaiamento dei primer diverse a seconda del gene target considerato.
Componenti Volume/reazione Concentrazione Finale
10x QIAGEN PCR Buffer 5 µl 1x
5x Q-solution 10 µl 1x
dNTP mix (10mM each) 4 µl 250 µM of each dNTP
Primer A 1 0,4 µM
Primer B 1 0,4 µM
Taq DNA Polymerase 0,25 µl 2,5 units/reaction
Acqua distillata 23,75
Templato DNA 5 DNA ≤ 1 µg/reaction
Volume Totale 50 µl
Temperatura (°C) Tempo per ciclo N° cicli In attivazione dell’Rtasi e denaturazione iniziale 94°C 2 min 1 ciclo Denaturazione
Appaiamento dei primers
Estensione del filamento di DNA
94°C
temperatura diversa a seconda della coppia di primer considerata 72°C 20 sec 30 sec 20 sec 40 cicli
Estensione finale 72°C 7 min 1 ciclo
Tab. 3.8: Protocollo utilizzato per la reazione di amplificazione con kit Qiagen
Per amplificare il gene CALCA di cane si è ricorsi al kit Titanium Taq PCR kit (Clontech). Sono stati aggiunti 2,5 µl di cDNA alla miscela contenente i reagenti elencati nella tabella 3.9 per un volume totale di 25 µl.
Componenti Volume/reazione Concentrazione finale
Buffer 2,5 µl 10x dNTP 0,5 µl 10mM Primer forward 0,5 µl 10µM Primer reverse 0,5 µl 10µM Taq 0,5 µl 50x Distilled water 18 µl Template DNA 2,5 µl Total volume 25 µl
Tabella 3.9. Componenti reazione di amplificazione con Taq Titanium.
TEMPERATURA TEMPO PER CICLO N° CICLI
Inattivazione RTasi e denaturazione iniziale
94 °C 5 min 1
Denaturazione 94°C 30 sec
Appaiamento dei primers XX°C 30 sec 40
Estensione del filamento di DNA 68°C 1 min
Estensione finale 68°C 7 min 1