La sintesi degli eterodimeri 33 e 42 (Schemi 3 e 4, Capitolo1) contenenti la giunzione 1,2,3-triazolica è stata realizzata attraverso una reazione di Click Chemistry ovvero una cicloaddizione 1,3-dipolare di Huisgen Cu(I) catalizzata (CuAAC)56 tra le unità
glicidiche portante la funzione azidica (27a e 32) e l’unità solfonammidica 25a, sintetizzata dal gruppo del Prof. Rossello ed avente uno spaziatore funzionalizzato con un gruppo alchinico terminale.
Il termine “click chemistry” (chimica a scatto) venne coniato nel 2001 da Sharpless in riferimento ad un nuovo approccio alla sintesi di composti organici basato su reazioni di formazione di legami carbonio-eteroatomo definite “near-perfect”. Tali reazioni devono essere versatili, rapide, efficienti ed in grado di assemblare molecole anche assai differenti, in modo regioselettivo e stereoselettivo, minimizzando le problematiche di compatibilità con i diversi gruppi funzionali e potendo usare un ampio ventaglio di condizioni di reazione. Il processo deve richiedere condizioni di reazione blande, impiego di reagenti e prodotti di partenza a basso costo, deve poter evitare l’uso di solventi o impiegare solventi come acqua e fornire prodotti finali isolabili senza ricorrere a purificazione cromatografiche. In letteratura sono riportate numerose reazioni termodinamicamente favorite che rispondono a questi requisiti come ad esempio le reazioni di Diels-Alder, la formazione di idrazoni e eterocicli e l’addizione carbonio-carbonio con formazione di legami multipli come la reazione di Michael.
La reazione di click chemistry per eccellenza è sicuramente rappresentata dalla cicloaddizione 1,3-dipolare tra un alchino ed un azide, conosciuta da decenni come
cicloaddizione di Huisgen. Essa è rappresentata da una reazione termica tra azidi e alchini, appartiene alla grande classe delle reazioni concertate [3+2] (reazioni pericliche) che, mediante l’unione di due reagenti insaturi porta alla formazione di un eterociclo a 5 termini. In particolare, la cicloaddizione azide-alchino che consente l’ottenimento di un anello 1,2,3-triazolico è una delle reazioni più utilizzate appartenente a questa classe: la reazione può essere condotta anche in presenza di H2O e O2 e l’anello triazolico formatosi
è stabile nella maggior parte delle condizioni di sintesi organica. I prodotti di partenza di questo tipo di reazione sono dei dipolarofili come alcheni, alchini e molecole che possiedono gruppi leganti eteroatomi funzionali, mentre i reagenti 1,3-dipolari, contengono uno o più eteroatomi e possono essere descritti con strutture mesomerica che rappresentano il dipolo. Le azidi, non sono classificate tra gli 1,3-dipoli più reattivi per questo tipo di reazione, ma sono preferite perché non danno reazioni collaterali e sono stabili nelle usuali condizioni di sintesi. I 2 π-elettroni del dipolarofilo e i 4 elettroni del composto dipolare partecipano in modo concertato, attraverso uno spostamento periciclico e la reazione è stereoconservativa e risulta una cicloaddizione simile alla reazione di Diels-Alder.
Il primo a capire l’importanza della cicloaddizione 1,3-dipolare azide-alchino fu il chimico tedesco Rolf Huisgen che ne studiò il processo che veniva condotto per semplice riscaldamento dei due reagenti. Esso ha trovato scarsa applicazione in sintesi organica in quanto scarsamente regioselettivo, poiché l’orientamento relativo dell’alchino e dell’azide durante la cicloaddizione è praticamente casuale e si ottengono miscele di triazoli disostituiti in posizione 1,4 e 1,5 (Schema 15).
Schema 15
Questa cicloaddizione è estremamente favorita dal punto di vista termodinamico (∆H° da -45 a -55 kcal/mole), ma è molto lenta a temperatura ambiente perché possiede un’energia di attivazione relativamente alta (ca. 26 kcal/mole per metilazide e propino), ne consegue che la formazione dell’anello triazolico richieda temperature elevate e lunghi tempi di reazione.
Nel 2002 è stata descritta per la prima volta in lavori contemporanei e indipendenti una variante della cicloaddizione di Huisgen in cui si utilizzava quantità catalitiche di un sale di rame(I) come catalizzatore. Questa semplice modifica ha portato sia ad un notevole incremento della velocità di reazione, tale da non richiedere prolungati riscaldamenti e sia ad una totale regioselettività a favore dell’isomero 1,4-disostituito che viene isolato rese elevate. Questa variante è denominata cicloaddizione azide-alchino catalizzata da rame(I),
CuAAC come si evince dall'acronimo inglese Copper(I)-catalyzed Azide-Alkyne
Cycloaddition.
Il meccanismo proposto prevede diversi passaggi (Schema 16) e il ciclo catalitico inizia con la formazione dell’intermedio chiave 56b, un acetiluro di rame formatosi in situ per reazione dell’alchino terminale 56a con il sale di rame(I).56 Calcoli teorici hanno
evidenziato che il passaggio diretto da 56b a 56f, attraverso un meccanismo di tipo concertato, è fortemente sfavorito, e probabilmente la reazione procede per tappe (B→C→D) con la formazione dell’intermedio a 6 termini 56e. L’aumento della resa e della velocità di reazione della cicloaddizione rame-catalizzata è dimostrata dai valori
dell’energia di attivazione relativi alla formazione del complesso π acetilene-azide 56c che risulta 11 kcal/mole, un valore notevolmente più basso (23.7 kcal/mole) di quello misurato nella reazione non catalizzata.
Schema 16
Evidenze sperimentali mostrano che la catalisi promossa dal Cu(I) procede solamente su alchini terminali mentre gli alchini interni non mostrano alcuna reattività in questa reazione. In particolare lo ione rameoso Cu+1 coordinandosi con gli elettroni
con conseguente rimozione e formazione esotermica (11.7 kcal/mole) del complesso Cu+1-
acetiluro (56b). Questo complesso va a coordinare l’azide portando all’intermedio 56c che subisce un riarrangiamento a dare il metallociclo a sei termini 56e, promosso da un attacco nucleofilo del C4-acetilidico all’N3 azidico. Il metallociclo subisce una veloce contrazione di anello a dare il complesso triazolo-rame 56f, attraverso un’associazione transanulare del lone pair dell’N-1 con l’orbitale π* del C5-Cu. Il complesso Cu-triazolo, in seguito a protonazione o reazione con altri elettrofili, rilascia il nucleo triazolico libero e la specie LnCu(I), terminando il ciclo e rigenerando la catalisi. La reazione di cicloaddizione azide- alchino rame catalizzata, dunque, si caratterizza quale processo a più passaggi, in cui la totale regioselettività è assicurata dal legame di entrambi i reagenti al catalizzatore (56c) prima della formazione dei nuovi legami.
I fattori elettronici influenzano sia la formazione del complesso Cu+1-acetiluro 56b e
sia la stabilizzazione dello stato di transizione della reazione e, in generale, α-carbonil- alchini risultano più reattivi di alchil-alchini, mentre gli alchini aromatici hanno reattività analoga o di poco inferiore. Aumentando le dimensioni dell’alchino e dell’azide la reazione risulta meno efficiente e le rese di conversione risultano inferiori: ciò può essere rilevante nel caso dell’accoppiamento tra azidi e alchini contenuti in molecole biologiche di grandi dimensioni, quali proteine o frammenti di DNA. E’ osservata una differente velocità di reazione tra azidi primarie e secondarie, come conseguenza importante della coordinazione terminale dell’azide con il catalizzatore nello stato di transizione. La reazione non risulta essere particolarmente influenzata dalla presenza di acqua e dalla maggior parte dei gruppi funzionali e ciò la rende applicabile a substrati multifunzionali non protetti. L’unità 1,2,3-triazolica risultante gode di elevata stabilità chimica, di un forte momento dipolare, di un carattere aromatico e della capacità di accettare legami a idrogeno.
In letteratura sono riportate diverse varianti della reazione di cicloaddizione che possono essere raggruppate in tre metodi: in soluzione, in fase solida e attraverso un meccanismo intramolecolare. Il protocollo più utilizzato prevede di effettuare la reazione tra un alchino ed un’azide in soluzione, in presenza di quantità catalitiche di ioni Cu(I) che possono essere generati attraverso addizione diretta di ioni Cu+1, riduzione in situ di ioni
Cu+2, ossidazione in situ di Cu metallico a ione Cu+1, uso di altri ligandi che promuovono il
un arilalogenuro reagisce inizialmente con NaN3 e solo successivamente reagisce con
l’alchino a dare il derivato 1,4-disostituito.
La metodologia più utilizzata è sicuramente quella che prevede l’impiego di CuSO4 e
la specie catalitica attiva Cu(I), generata in situ dalla riduzione con ascorbato di sodio, forma velocemente l’acetiluro di rame e porta al derivato 1,2,3-triazolico in rese elevate. Inoltre l’agente riducente ascorbato sodio contribuisce a rendere la reazione meno sensibile all’ossigeno e la reazione può essere condotta liberamente in condizioni open-air.
L’impiego di alogenuro di CuI e CuBr portano a perdita di efficienza della cicloaddizione in quanto richiedono la presenza di una base quale Et3N, piridina, DIPEA,
DBU o alte temperature per formare complesso Cu+1-acetiluro. Tale differenza è principalmente dovuta al fatto che CuI o CuBr si trovano sotto forma di clusters stabili e richiedono una certa concentrazione di anioni acetiluro prima che il complesso reattivo si possa formare.
Le condizioni di reazione più comunemente usate prevedono l’utilizzo CuSO4/ascorbato in solventi quali THF, DMSO, DMF, t-BuOH, acetone o toluene e spesso
miscele acqua/alcol che facilitano la solvatazione dei reagenti. La solubilità dei reagenti non è una condizione essenziale e la reazione funziona anche in condizioni di parziale solubilità. Generalmente il prodotto di reazione viene isolato per semplice filtrazione e non necessita processi di purificazione.
E’ importante sottolineare che mentre le azidi presentano grande affinità per gli alchini (chemoselettività), entrambe queste funzionalità sono invece inerti verso la maggior parte dei gruppi funzionali presenti nella struttura di biomolecole più complesse (cosiddetta bioortogonalità), come lo stesso nucleo triazolico risulta essere stabile alla degradazione chimica ed enzimatica. Tutto ciò rende la cicloaddizione 1,3-dipolare particolarmente adatta ed applicabile come metodo di unione tra molecole di interesse biologico (cosiddetto bioaccoppiamento). Più precisamente, il nucleo 1,2,3-triazolico risulta essere più stabile di un legame ammidico e può partecipare alla formazione di legami ad idrogeno e interazioni dipolari, favorendo quindi la solubilità ed il legame al target biologico.
Sulla base di queste considerazioni la preparazione degli etereodimeri 33 e 42 (Schemi 3 e 4, Capitolo 1) contenenti la giunzione 1,2,3-triazolica è stata realizzata applicando il protocollo sperimentale previsto per la cicloaddizione 1,3-dipolare di Huisgen Cu(I) catalizzata (CuAAC).57 In particolare il coupling tra le opportune azidi (27a
o 32) e l’alchino 25a (1.1eq) è realizzato in soluzione DMF:H2O 4:1 in presenza di CuSO4
(1.5 eq) e ascorbato di sodio (3 eq) e conducendo la reazione con irradiazione a microonde (Schema 17). Dopo 30 minuti, evidenziata la scomparsa delle azidi di partenza (TLC), il trattamento della reazione seguita da purificazione flash cromatografica dei grezzi di reazione consente di isolare gli eterodimeri 33 (94%) e 42 (81%) puri all’analisi NMR Schema 17 AcO O AcO NHAc OAc O N3 AcO O AcO NHAc OAc N3 N O SO2 O AcO O AcO NHAc OAc N O SO2 O N N N O N O SO2 O AcO O AcO NHAc OAc N N N 27a 32 25a 42 (81%) 33 (94%) DMF-H2O 4:1 DMF-H2O 4:1
Gli eterodimeri 33 e 42, non riportati in letteratura, sono stati completamente caratterizzati dal punto di vista chimico-fisico e gli spettri NMR sono concordi con la struttura assegnata (vedi parte sperimentale). In particolare la presenza, nello spettro protonico di 33 di un singoletto a δ 8.05, integrante per un protone, conferma la presenza del nucleo 1,2,3-triazolico. Esso è inoltre confermato nello spettro 13C da due segnali a δ
146.3 e δ 124.8 attribuibili, rispettivamente, al carbonio quaternario e al CH triazolico. L’analisi dello spettro protonico del derivato 42 non consente di evidenziare la risonanza relativa al protone triazolico ma la presenza di un multipletto nella zona dei protoni aromatici (δ 7.92-7.76) integrante per 10 protoni conferma il legame triazolico. Anche in questo caso nello spettro 13C due segnali a δ 146.0 e δ 125.4 sono attribuititi,