SOGGETI
I criteri di inclusione dei soggetti sono gli stessi per entrambi gli studi.
Per essere inseriti nello studio, i soggetti con diagnosi di asma, di grado lieve o moderato, dovevano soddisfare i seguenti criteri:
- Età compresa tra i 18 e i 60 anni
- Assenza di trattamento regolare con corticosteroidi inalatori o sistemici negli ultimi 3 mesi, e comunque nessun trattamento antinfiammatorio nell’ultimo mese
- Sintomi non quotidiani ma presenti nell’ultimo mese, come documentato dalla presenza di almeno 2 sintomi giornalieri o notturni e/o di abnorme variabilità del PEF, in almeno 2 giorni della settimana, nelle ultime due settimane di monitoraggio
- Presenza di eosinofilia (eosinofili >3% del totale delle cellule infiammatorie) nell’espettorato indotto.
I soggetti reclutati per il primo studio sono stati 27. I soggetti reclutati nel secondo studio sono stati 28.
In entrambi gli studi i soggetti sono stati divisi in due gruppi:
1. Nel gruppo A la gestione del paziente seguiva i parametri stabiliti dalle linee guida internazionali, sulla base dei sintomi e della funzione polmonare
2. Nel gruppo B la gestione del paziente seguiva i parametri stabiliti dalle linee guida internazionali, associati alla misurazione degli eosinofili nell’espettorato indotto.
43 PROTOCOLLO DI STUDIO
Tutti i pazienti che soddisfacevano ai criteri di inclusione iniziavano terapia con il trattamento iniziale previsto. Al controllo successivo (un mese) veniva valutato il grado di controllo dell’asma, nel gruppo A solo sulla base dei sintomi e della funzione respiratoria, nel gruppo B anche considerando se l’eosinofilia nell’espettorato fosse risultata nella norma. Se l’asma veniva considerato non controllato sia nel gruppo A (presenza di sintomi o riduzione della funzione polmonare) che nel gruppo B (idem e/o presenza di eosinofilia nell’espettorato), il paziente eseguiva uno step-up di terapia secondo lo schema riportato, che era differente nei due studi. Il paziente era successivamente rivalutato dopo un altro mese, con identica procedura. Lo studio era prolungato per 6 mesi, dopodiché il paziente usciva dallo studio e veniva trattato liberamente secondo la normale pratica clinica.
Il protocollo di trattamento dei pazienti del primo studio prevedeva:
1. Trattamento iniziale: Fluticasone 125 mcg bid 2. Primo step – up: Fluticasone + salmeterolo
3. Secondo step – up: Fluticasone + salmeterolo + montelukast
4. Terzo step – up: Fluticasone ad alte dosi + salmeterolo + montelukast
Il protocollo di trattamento dei pazienti del secondo studio invece prevedeva l’utilizzo di soli corticosteroidi, con aumento progressivo della dose come segue:
5. Trattamento iniziale: Fluticasone 50 mcg bid 6. Primo step – up: Fluticasone 125 mcg bid 7. Secondo step – up: Fluticasone 250 mcg bid 8. Terzo step – up: Fluticasone 500 mcg bid
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Ogni paziente poteva inoltre usare il farmaco di emergenza (salbutamolo, 200 mcg per spray dosato) ogni volta che fosse necessario per il sollievo dei sintomi. I pazienti compilavano il diario dei sintomi e misuravano il PEF del mattino e della sera in maniera continua per tutta la durata dello studio.
I pazienti venivano osservati in ambulatorio in visite mensili per un periodo di sei mesi e ad ogni visita veniva effettuato:
- Spirometria basale - Test alla metacolina
- Esame dell’espettorato indotto
L’obiettivo primario in entrambi gli studi era il miglioramento della reattività bronchiale alla metacolina. L’ipotesi era che, se il trattamento antiasmatico era adeguato alla necessità di tenere sotto controllo non solo i sintomi e la funzione polmonare, ma anche l’infiammazione bronchiale (espressa dall’eosinofilia nell’espettorato), ciò doveva determinare un più evidente miglioramento della reattività bronchiale alla metacolina (espressa da un incremento della PD20FEV1 metacolina) rispetto al miglioramento ottenuto valutando solo sintomi e funzione polmonare. Se ciò venisse dimostrato, sarebbe un elemento a favore dell’inserimento della misurazione del grado di infiammazione bronchiale tra le misure utili per una buona gestione dell’asma.
45 METODI
Esami spirometrici
Per tutti i pazienti le misurazioni di VEMS e CVF sono state eseguite, tramite spirometria con manovra espiratoria forzata in accordo con le raccomandazioni, per la standardizzazione della spirometria, stabilite dall’European Respiratory Society. La procedura è ripetibile, ma sforzo dipendente, quindi si devono istruire i pazienti riguardo all’esecuzione corretta della manovra espiratoria forzata; si prendono poi i valori migliori di 2 o 3 registrazioni. Tali valori sono confrontati con valori teorici di VEMS, CVF, PEF basati su età, sesso, e altezza, ed ottenuti tramite lo studio di una popolazione con analoghe caratteristiche etniche e range di età. Si considera quale limitazione del flusso aereo il rapporto VEMS/CVF. Una limitazione al flusso aereo in espirazione forzata è rappresentata da un rapporto VEMS/CVF inferiore all’80% negli adulti. Nei soggetti con ridotta funzione polmonare è stata misurata la risposta alla somministrazione di una singola dose di broncodilatatore (2 puff di salbutamolo corrispondenti a 200 mcg). La misurazione della funzione polmonare è abitualmente eseguita dai 10 ai 30 minuti dopo la somministrazione del farmaco. Un incremento del FEV1 del 12-15% è considerato un indice positivo di reversibilità.
Test di provocazione bronchiale con metacolina
La metacolina (Sigma, St. Luis, MO, USA) è stata somministrata tramite un nebulizzatore a getto (modello Devilbiss 646) connesso con un dosimetro ad aria compressa tarato per erogare 10 mcg per 0.8-1 sec. Dopo l’esecuzione della spirometria basale è stato calcolato il valore del FEV1 basale di riferimento, misurazione ottenuta dopo avere fatto inalare 3 puffs di una soluzione di tampone fosfato. Si è quindi eseguita la somministrazione, per via inalatoria, di dosi crescenti di metacolina (metacolina cloruro liofilizzata in soluzione tampone) ogni due minuti secondo la tecnica delle dosi cumulative.
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Il FEV1 è stato misurato due minuti dopo la fine di ogni serie di inalazioni di metacolina. Il test è stato interrotto quando si è registrata una caduta del FEV1 maggiore del 20% rispetto al valore ottenuto dopo il tampone. Il risultato è stato espresso in PD20 FEV1, ovvero la dose di metacolina (in mg) che provoca una riduzione del FEV1 del 20% rispetto al valore dio riferimento, ottenuto dopo inalazione di tampone. Un valore del PD20 FEV1 inferiore a 1000 mg di metacolina è stato considerato come positivo per ipereattività bronchiale specifica.
Induzione ed analisi dell’espettorato indotto Induzione dell’espettorato
L’espettorato è stato indotto con inalazione di una soluzione salina ipertonica, nebulizzata tramite l’utilizzo di un nebulizzatore ultrasonico (Sirius, Technomed, Firenze, Italia). Dopo la misurazione basale del FEV1, è stata effettuata una premeditazione con salbutamolo ( 200 mg) per aerosol dosato, allo scopo di prevenire una eccessiva broncocostrizione indotta dalla soluzione salina ipertonica. L’aerosol, prodotto con portata di 2,8 mL/min, è stato inalato per un periodo variabile da un minimo di 5 minuti ad un massimo di 30. La concentrazione di NaCl è stata incrementata progressivamente, ad intervalli di 10 minuti, dal 3% al 4% al 5%. Ad intervalli di 5 minuti, a partire dall’inizio dell’inalazione, al paziente è stato chiesto di risciacquare accuratamente bocca e gola e provare ad espettorare in un apposito contenitore. La misurazione del FEV1 è stata eseguita basalmente ed ogni 5 minuti dopo l’inizio dell’inalazione, nonché ogni qual volta il paziente riferiva segni di broncostenosi. Il test è stato interrotto dopo 30 minuti dall’inizio dell’inalazione ed in ogni caso per caduta del FEV1 maggiore del 20% rispetto al valore basale.
47 Analisi dell’espettorato
I campioni di espettorato dei pazienti sono stati diluiti con uguale volume di tampone fosfato contenente ditiotreitolo allo 0’1% (Sputasol, Unipath, Ltd, Basingstoke, UK). I campioni sono stati incubati a 37°C per 15 minuti, quindi pipettati per dissolvere ulteriormente gli aggregati di muco. Alla fine dell’incubazione i campioni sono stati filtrati con una garza di nylon da 53 mcm (Giuliani Filtrazioni, Torino, Italia) per eliminare i detriti. Un aliquota di campione di espettorato è stata citocentrifugata per 5 minuti a 1300 rpm. (Cytospin; Shandon scientific, Sewickley, PA) e colorata con Diff-Quilk (Baxter Scientific Products, Miami, FL). Due ricercatori senza accesso al codice del paziente, hanno indipendentemente, contato un minimo di 500 cellule non squamose in ogni vetrino con un campione di espettorato. Il conteggio di macrofagi, linfociti, neutrofili ed eosinofili è stato quindi espresso come valore percentuale di 500 cellule infiammatorie. La concordanza fra le due osservazioni è espressa come coefficiente di correlazione tra classi diverse, ed i valori definitivi sono stati ottenuti dalla media dei dati acquisiti nelle due osservazioni. Il campione di espettorato restante è stato configurato a 450 g per 10 minuti. Il supernatante è stato raccolto e conservato a -80° C per esser successivamente utilizzato per ulteriori analisi ( quali la ricerca dei mediatori dell’infiammazione, ECP e PNX). Il sedimento cellulare è stato risospeso in una soluzione salina normale per effettuare il conteggio totale della cellule, con la colorazione di Turk, e per la valutazione della vitalità cellulare, mediante Typan blu, tramite un emocitometro. Sono stati scartati i campioni in cui è stata riscontrata una vitalità cellulare inferiore al 70%. Pazienti il cui espettorato presentava scarsa vitalità cellulare nella valutazione iniziale sono stati esclusi dallo studio.
48 Monitoraggio del punteggio dei sintomi e del PICCO di FLUSSO espiratorio
A ciascun paziente, eleggibile allo studio, è stato consegnato un diario per effettuare il monitoraggio giornaliero dei sintomi di malattia e del picco di flusso espiratorio nelle due settimane precedenti l’inizio della terapia. È stata valutata l’entità della limitazione del flusso aereo, la variabilità della funzione respiratoria ed il livello di gravità dei sintomi, prima dell’ingresso nello studio (diario basale). Dopo l’ingresso nel protocollo di studio, i pazienti hanno continuato puntualmente ad effettuare la compilazione mensile del diario. Per le nostre valutazioni abbiamo considerato il diario basale, e quelli che venivano compilati ogni mese.
Sintomi
In ogni diario i pazienti hanno annotato un punteggio per i sintomi diurni ( valutati retrospettivamente alla fine di ogni giornata) ed un punteggio per i sintomi notturni.
Per i sintomi diurni il punteggio è variabile da 0 (nessun sintomo) a 5 (non è stato in grado di compiere le consuete attività giornaliere a causa della malattia asmatica). Per i sintomi notturni il punteggio assegnato varia da 0 (nessun sintomo) a 4 (non ha mai dormito a causa dell’asma). Nella nostra valutazione abbiamo considerato, per ogni diario mensile i punteggi riportati nelle ultime due settimane di monitoraggio. I punteggi dei sintomi, notturni e diurni, sono stati sommati per ottenere una valutazione media, giornaliera, dei sintomi.
Picco di flusso espiratorio (PEF)
Per la determinazione del picco di flusso i soggetti hanno utilizzato un misuratore di picco di flusso portatile tipo Mini-Wright (PFM). Le misurazioni sono state effettuate al mattino (al risveglio, prima dell’assunzione della terapia inalatoria) ed alla sera. I soggetti sono stati istruiti ad eseguire
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misurazioni, tramite manovra di espirazione forzata, annotando i due valori più alti nel diario. I soggetti inoltre sono stati istruiti a misurare il PEF al verificarsi di episodi broncospasmo, con sibili o dispnea, e , nel caso si fosse reso necessario l’utilizzo di β2-agonista a breve durata d’azione (farmaco
d’emergenza) a ripetere la misurazione dopo 10 minuti dall’assunzione del farmaco. Abbiamo quindi calcolato la variabilità giornaliera del PEF durante le ultime due settimane di monitoraggio. La variabilità del PEF, espressa come massima ampiezza è stata calcolata come segue: ( maggior valore PEF- minor valore PEF)/valore medio giornaliero X100. È stato considerato elevato un valore di variabilità >10.
50 Analisi statistica
Cell counts and sputum volume are expressed as median (range). Alcuni dei camoioni risultavano non attendibili, ma nella maggioranza erano raccolti alla fine dello studio. These patients, however, were not excluded from the study if they had no deterioration of asthma symptoms and had an acceptable sputum sample at the following visit. Non acceptable samples were not included in the statistical analysis. Symptom score, morning PEF, daily PEF amplitude percent mean, percent of days with abnormal PEF amplitude percent mean, and short-acting rescue beta2- agonist use were averaged over the last 14 days before each visit and expressed as median (range) except for morning PEF and daily PEF amplitude percent mean, which are expressed as mean ± SD. FEV1 is expressed as mean ± SD. PD20FEV1 methacholine is expressed as geometric mean, and was log transformed for
comparisons.
MannWhitney U test and Friedman test were used to compare differential sputum cell counts between groups and within groups respectively. Unpaired t test and ANOVA for repeated measures were used to compare FEV1 and log
PD20FEV1 methacholine between groups and within groups respectively. A p value lower than 0.05 was considered as significant.
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RISULTATI
STUDIO # 1
I soggetti che hanno partecipato allo studio # 1 sono 29, e questi sono stati randomizzati in due gruppi: A e B. Nel gruppo A i pazienti venivano trattati in base alle indicazioni delle linee guida internazionali, giudicando quindi il controllo solo sulla base dei sintomi e della funzione respiratoria, mentre nel gruppo B i pazienti venivano trattati includendo nei parametri di valutazione del controllo anche la concentrazione degli eosinofili nell’espettorato indotto.