Il costrutto vascolarizzato è stato fabbricato utilizzando una tecnica definita con il nome di
indirect bioprinting, secondo cui i canali vascolari non sono direttamente stampati, ma
vengono creati appunto in maniera “indiretta”, tramite la rimozione di materiale sacrificale e successiva perfusione di cellule endoteliali.
Il costrutto vascolarizzato è stato modellizzato tramite CAD solidworks a partire da una semplice forma a parallelepipedo, salvata successivamente come file .stl. Il software Slic3r è stato utilizzato per ottenere facilmente l’assemblamento di una multi-parte (file AMF). La multi-parte è ottenibile allo stesso modo creando un assieme in SolidWorks; tuttavia, a causa del procedimento più macchinoso di quest’ultimo, si è preferito utilizzare Slic3er. Il file AMF è stato caricato sul software HeartWare Cellink per la generazione del g-code. Nonostante l’utilizzo di tre software possa apparire elaborato, i passaggi richiesti sono piuttosto basilari e permettono una veloce generazione del g-code finale.
La tecnica di stampa utilizzata permette la rapida deposizione dei 10 layer modellizzati in un tempo di circa 3 minuti (vtestina=10 mm/s).
La strategia presentata ha permesso lo sviluppo di un primo prototipo di scaffold vascolarizzato (Figura 4.4).
L’idrogelo A50G50 è stato stampato a 27°C, dato che la bioprinter utilizzata non permette di impostare temperature inferiori a quella ambiente. A questa temperatura, come discusso precedentemente, la deposizione di filamenti avviene in maniera meno precisa, con un
Figura 4.4: Confronto tra modello e scaffold realizzato. A destra, visualizzazione in g.code del modello di scaffold vascolarizzato; a sinistra, scaffold vascolarizzato ottenuto (scale bar = 5 mm).
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aumento del diametro. La minore capacità di mantenere la forma a causa dello scioglimento della gelatina appesantisce la struttura all’aumentare dei layer depositati; il Pluronic, depositato al quinto e sesto strato, inoltre, necessita di aderire all’idrogelo durante la stampa, motivo per cui la struttura sottostante viene ulteriormente compressa dal passaggio del puntale. L’idrogelo, inoltre, è soggetto ad un leggero rigonfiamento a causa del parziale assorbimento della soluzione contenente il reticolante. Questi fattori concorrono alla diminuzione dell’accuratezza di stampa e alla deformazione del costrutto finale.
I canali formatisi tramite la rimozione del materiale sacrificale, mostrano un incremento del diametro di quasi due decimi di millimetro. Tale aumento è probabilmente dovuto dal fatto che l’idrogelo, nonostante la reticolazione, non circonda perfettamente il Pluronic ed i canali si allargano una volta rimosso il materiale sacrificale.
Il diametro dei canali ottenuto tramite questa tecnica è di molto superiore rispetto a quello dei capillari (ø ~ 10 μm); un primo passo verso la realizzazione di canali di diametro inferiore, potrebbe essere quello di variare i parametri di pressione e velocità di deposizione del Pluronic o di utilizzare un puntale di diametro inferiore, come un puntale 27G (ø = 200 μm).
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Conclusioni e sviluppi futuri
In questo progetto di tesi è stata sviluppata una metodologia per la creazione di network vascolari all’interno di uno scaffold, al fine di superare il limite legato alla vascolarizzazione dei costrutti per l’ingegneria dei tessuti. La rete vascolare è uno degli elementi chiave che consentono di mimare i tessuti naturali; infatti, la maggior parte delle cellule presenti all’interno di un costrutto, non rimarrebbero vitali senza un’efficiente rete vascolare in grado di distribuire nutrienti e rimuovere sostanze di scarto (cataboliti).
Il costrutto vascolarizzato è stato realizzato mediante una tecnologia di micro-extrusion bioprinting, per la deposizione controllata di biomateriale in una geometria predefinita. La possibilità di utilizzare due testine di stampa ha permesso la deposizione in sequenza di due diversi materiali, così da poter fabbricare un costrutto e contemporaneamente inglobare all’interno un network sacrificale.
La realizzazione dello scaffold richiede l’identificazione ed il controllo di una serie di parametri operativi che influenzano il processo di fabbricazione; in primo luogo, è stata ricercata una composizione di alginato e gelatina in grado di soddisfare i requisiti di stampabilità. La formulazione individuata, denominata A50G50 (alginato al 4% w/v, gelatina 10% w/v miscelate in rapporto 1:1) ha mostrato proprietà di viscosità adeguate alla stampa e al mantenimento dell’integrità strutturale.
Il blend è risultato altamente sensibile alle variazioni di temperatura; per questo è stata individuata una finestra di temperature tra i 22°C e i 27°C alle quali è possibile stampare, variando la pressione di estrusione.
Sono stati analizzati, inoltre, parametri di processo come la velocità di stampa e il diametro del puntale, che hanno particolare influenza sul diametro del filamento estruso. L’uso del puntale 25G (ø = 250 μm) è stato escluso a causa delle pressioni di estrusione eccessive ed il minore controllo sulla regolarità del filamento estruso; allo stesso modo, per un maggiore controllo sulla deposizione del filamento, sono state scelte velocità di 10 mm/s o 15 mm/s.
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La reticolazione chimica dell’alginato è stata esplorata come tecnica per permettere l’aumento delle proprietà meccaniche dell’idrogelo. La stampa dell’idrogelo reticolato internamente si è rivelata fallimentare a causa del difficile controllo sulla cinetica di gelazione dell’alginato. Diversamente, la reticolazione esterna tramite CaCl2 ha permesso
una veloce reticolazione del costrutto subito dopo la stampa, semplicemente gocciolando la soluzione sopra di esso.
La veloce cinetica di degradazione osservata dai test di stabilità, si presenta come il limite principale all’utilizzo di tale blend come bioink. La bassa stabilità termica della gelatina è la principale causa della veloce degradazione dei campioni. L’attività di sviluppo futuro potrebbe comprendere la modifica delle concentrazioni di alginato e gelatina, incrementando la concentrazione di alginato a discapito di quella della gelatina, in modo da aumentare la stabilità dei campioni nel tempo. Alternativamente, si potrebbe incrementare il tempo di immersione del costrutto nella soluzione reticolante (CaCl2), così da permettere una più
efficace reticolazione dell’alginato ed un aumento delle proprietà meccaniche dell’idrogelo. Inoltre, sarebbe necessario ripetere il test di degradazione variando le condizioni sperimentali ed immergendo i campioni in DMEM invece che nel PBS.
In conclusione, è stato illustrato il processo seguito per la modellizzazione di uno scaffold vascolarizzato ed i parametri di processo ottimizzati per la sua stampa. Lo scaffold è stato realizzato tramite una tecnica di indirect bioprinting: l’idrogelo A50G50 è stato utilizzato come componente principe dello scaffold ed il Pluronic commerciale come materiale sacrificale. Il processo metodologico sviluppato nella tesi consente la creazione di costrutti dotati di canali micrometrici di 0,77 mm di diametro, incorporati all’interno dello scaffold secondo una geometria progettata.
Ulteriori sviluppi potrebbero essere indirizzati verso la fabbricazione di un’appropriata camera in cui stampare il costrutto e rimuovere direttamente il materiale sacrificale, evitando il processo poco efficiente di aspirazione manuale tramite microsiringa. La camera dovrebbe garantire oltre che la rimozione, la successiva perfusione dello scaffold.
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La geometria dei canali dovrebbe essere ottimizzata per garantire una perfusione adeguata ad un eventuale applicazione cellulare.
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Appendice A
g-code dello scaffoldCodice generato tramite il software (Cellink) HeartWare per la realizzazione dello scaffold con due testine di stampa, modificato manualmente.
M761
G21 ; set units to millimeters G90 ; use absolute coordinates M83 ; use relative distances for extrusion G1 Z0.150 F600.000 ; move to next layer (0) G1 X0.304230769231 Y0.3895 E1
G1 X7.910 Y10.127 F600.000 ; move to first infill point M760
G4 P0
G1 X7.91 Y9.63348780488 E1 G1 X7.91 Y-9.61348780488 E1
G1 X7.910 Y-10.107 E0.05059 F600.000 ; infill G1 X7.44257142857 Y-10.107 E1
G1 X5.10542857143 Y-10.107 E1 G1 X4.638 Y-10.107 E0.00818 ; infill G1 X4.638 Y-9.61348780488 E1 G1 X4.638 Y9.63348780488 E1 G1 X4.638 Y10.127 E0.05059 ; infill G1 X4.17042857143 Y10.127 E1 G1 X1.83257142857 Y10.127 E1 G1 X1.365 Y10.127 E0.00818 ; infill G1 X1.365 Y9.63348780488 E1 G1 X1.365 Y-9.61348780488 E1 G1 X1.365 Y-10.107 E0.05059 ; infill G1 X0.897571428571 Y-10.107 E1 G1 X-1.43957142857 Y-10.107 E1 G1 X-1.907 Y-10.107 E0.00818 ; infill G1 X-1.907 Y-9.61348780488 E1 G1 X-1.907 Y9.63348780488 E1 G1 X-1.907 Y10.127 E0.05059 ; infill G1 X-2.37457142857 Y10.127 E1 G1 X-4.71242857143 Y10.127 E1
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G1 X-5.180 Y10.127 E0.00818 ; infill G1 X-5.18 Y9.63348780488 E1 G1 X-5.18 Y-9.61348780488 E1 G1 X-5.180 Y-10.107 E0.05059 ; infill G1 X-5.64742857143 Y-10.107 E1 G1 X-7.98457142857 Y-10.107 E1 G1 X-8.452 Y-10.107 E0.00818 ; infill G1 X-8.452 Y-9.61348780488 E1 G1 X-8.452 Y9.13997560976 E1 G1 X-8.452 Y9.63348780488 E1 G1 X-8.452 Y10.127 E0.05059 ; infill M761
G1 Z0.350 F600.000 ; move to next layer (1) G1 X-8.73116666667 Y9.7575 E1 G1 X-9.84783333333 Y8.2795 E1
G1 X-10.127 Y7.910 F600.000 ; move to first infill point M760
G4 P0
G1 X-9.63348780488 Y7.91 E1 G1 X9.61348780488 Y7.91 E1
G1 X10.107 Y7.910 E0.56207 F600.000 ; infill G1 X10.107 Y7.44257142857 E1
G1 X10.107 Y5.10542857143 E1 G1 X10.107 Y4.638 E0.09090 ; infill G1 X9.61348780488 Y4.638 E1 G1 X-9.63348780488 Y4.638 E1 G1 X-10.127 Y4.638 E0.56207 ; infill G1 X-10.127 Y4.17042857143 E1 G1 X-10.127 Y1.83257142857 E1 G1 X-10.127 Y1.365 E0.09090 ; infill G1 X-9.63348780488 Y1.365 E1 G1 X9.61348780488 Y1.365 E1 G1 X10.107 Y1.365 E0.56207 ; infill G1 X10.107 Y0.897571428571 E1 G1 X10.107 Y-1.43957142857 E1 G1 X10.107 Y-1.907 E0.09090 ; infill G1 X9.61348780488 Y-1.907 E1 1 X-9.63348780488 Y-1.907 E1 G1 X-10.127 Y-1.907 E0.56207 ; infill G1 X-10.127 Y-2.37457142857 E1 G1 X-10.127 Y-4.71242857143 E1 G1 X-10.127 Y-5.180 E0.09090 ; infill
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G1 X-9.63348780488 Y-5.18 E1 G1 X9.61348780488 Y-5.18 E1 G1 X10.107 Y-5.180 E0.56207 ; infill G1 X10.107 Y-5.64742857143 E1 G1 X10.107 Y-7.98457142857 E1 G1 X10.107 Y-8.452 E0.09090 ; infill G1 X9.61348780488 Y-8.452 E1 G1 X-9.13997560976 Y-8.452 E1 G1 X-9.63348780488 Y-8.452 E1 G1 X-10.127 Y-8.452 E0.56207 ; infill M761
G1 X9.61348780488 Y-8.452 E1 G1 X-9.13997560976 Y-8.452 E1 G1 X-9.63348780488 Y-8.452 E1 G1 Z0.550 F600.000 ; move to next layer (2) G1 X-10.0829210526 Y-7.96307894737 E1 G1 X-8.49607894737 Y9.63807894737 E1
G1 X-8.452 Y10.127 F600.000 ; move to first infill point M760
G4 P0
G1 X-8.452 Y9.63348780488 E1 G1 X-8.452 Y-9.61348780488 E1
G1 X-8.452 Y-10.107 E0.56207 F600.000 ; infill G1 X-7.98457142857 Y-10.107 E1
G1 X-5.64742857143 Y-10.107 E1 G1 X-5.180 Y-10.107 E0.09090 ; infill G1 X-5.18 Y-9.61348780488 E1 G1 X-5.18 Y9.63348780488 E1 G1 X-5.180 Y10.127 E0.56207 ; infill G1 X-4.71242857143 Y10.127 E1 G1 X-2.37457142857 Y10.127 E1 G1 X-1.907 Y10.127 E0.09090 ; infill G1 X-1.907 Y9.63348780488 E1 G1 X-1.907 Y-9.61348780488 E1 G1 X-1.907 Y-10.107 E0.56207 ; infill G1 X-1.43957142857 Y-10.107 E1 G1 X0.897571428571 Y-10.107 E1 G1 X1.365 Y-10.107 E0.09090 ; infill G1 X1.365 Y-9.61348780488 E1 G1 X1.365 Y9.63348780488 E1 G1 X1.365 Y10.127 E0.56207 ; infill G1 X1.83257142857 Y10.127 E1
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G1 X4.17042857143 Y10.127 E1 G1 X4.638 Y10.127 E0.09090 ; infill G1 X4.638 Y9.63348780488 E1 G1 X4.638 Y-9.61348780488 E1 G1 X4.638 Y-10.107 E0.56207 ; infill G1 X5.10542857143 Y-10.107 E1 G1 X7.44257142857 Y-10.107 E1 G1 X7.910 Y-10.107 E0.09090 ; infill G1 X7.91 Y-9.61348780488 E1 G1 X7.91 Y9.63348780488 E1 G1 X7.910 Y10.127 E0.56207 ; infill M761
G1 Z0.750 F600.000 ; move to next layer (3) G1 X7.42251351351 Y10.0670810811 E1 G1 X-9.63951351351 Y7.96991891892 E1
G1 X-10.127 Y7.910 F600.000 ; move to first infill point M760
G4 P0
G1 X-9.63348780488 Y7.91 E1 G1 X9.61348780488 Y7.91 E1
G1 X10.107 Y7.910 E0.56207 F600.000 ; infill G1 X10.107 Y7.44257142857 E1
G1 X10.107 Y5.10542857143 E1 G1 X10.107 Y4.638 E0.09090 ; infill G1 X9.61348780488 Y4.638 E1 G1 X-9.63348780488 Y4.638 E1 G1 X-10.127 Y4.638 E0.56207 ; infill G1 X-10.127 Y4.17042857143 E1 G1 X-10.127 Y1.83257142857 E1 G1 X-10.127 Y1.365 E0.09090 ; infill G1 X-9.63348780488 Y1.365 E1 G1 X9.61348780488 Y1.365 E1 G1 X10.107 Y1.365 E0.56207 ; infill G1 X10.107 Y0.897571428571 E1 G1 X10.107 Y-1.43957142857 E1 G1 X10.107 Y-1.907 E0.09090 ; infill G1 X9.61348780488 Y-1.907 E1 G1 X-9.63348780488 Y-1.907 E1 G1 X-10.127 Y-1.907 E0.56207 ; infill G1 X-10.127 Y-2.37457142857 E1 G1 X-10.127 Y-4.71242857143 E1 G1 X-10.127 Y-5.180 E0.09090 ; infill
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G1 X-9.63348780488 Y-5.18 E1 G1 X9.61348780488 Y-5.18 E1 G1 X10.107 Y-5.180 E0.56207 ; infill G1 X10.107 Y-5.64742857143 E1 G1 X10.107 Y-7.98457142857 E1 G1 X10.107 Y-8.452 E0.09090 ; infill G1 X9.61348780488 Y-8.452 E1 G1 X-9.13997560976 Y-8.452 E1 G1 X-9.63348780488 Y-8.452 E1 G1 X-10.127 Y-8.452 E0.56207 ; infill M761 G1 X9.61348780488 Y-8.452 E1 G1 X-9.63348780488 Y-8.452 E1 ;TESTINA 2 G1 E-10 F2400 M753 G91 G0 Z5 G90 M712 G0 X0 Y0 M752 T1
G1 Z0.250 F600.000 ; move to next layer (4) G1 X-10.0829210526 Y-7.96307894737 E1 G1 X-10.0388421053 Y-7.47415789474 E1 G1 X-8.54015789474 Y9.14915789474 E1 G1 X-8.49607894737 Y9.63807894737 E1
G1 X-8.452 Y10.127 F600.000 ; move to first infill point M762
G4 P0
G1 X-8.452 Y9.63348780488 E1 G1 X-8.452 Y-9.61348780488 E1
G1 X-8.452 Y-10.107 E0.56207 F600.000 ; infill G1 X-7.98457142857 Y-10.107 E1
G1 X-5.64742857143 Y-10.107 E1 G1 X-5.180 Y-10.107 E0.09090 ; infill G1 X-5.18 Y-9.61348780488 E1 G1 X-5.18 Y9.63348780488 E1 G1 X-5.180 Y10.127 E0.56207 ; infill G1 X-4.71242857143 Y10.127 E1 G1 X-2.37457142857 Y10.127 E1
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G1 X-1.907 Y10.127 E0.09090 ; infill G1 X-1.907 Y9.63348780488 E1 G1 X-1.907 Y-9.61348780488 E1 G1 X-1.907 Y-10.107 E0.56207 ; infill G1 X-1.43957142857 Y-10.107 E1 G1 X0.897571428571 Y-10.107 E1 G1 X1.365 Y-10.107 E0.09090 ; infill G1 X1.365 Y-9.61348780488 E1 G1 X1.365 Y9.63348780488 E1 G1 X1.365 Y10.127 E0.56207 ; infill G1 X1.83257142857 Y10.127 E1 G1 X4.17042857143 Y10.127 E1 G1 X4.638 Y10.127 E0.09090 ; infill G1 X4.638 Y9.63348780488 E1 G1 X4.638 Y-9.61348780488 E1 G1 X4.638 Y-10.107 E0.56207 ; infill G1 X5.10542857143 Y-10.107 E1 G1 X7.44257142857 Y-10.107 E1 G1 X7.910 Y-10.107 E0.09090 ; infill G1 X7.91 Y-9.61348780488 E1 G1 X7.91 Y9.63348780488 E1 G1 X7.910 Y10.127 E0.56207 ; infill M763
G1 Z0.350 F600.000 ; move to next layer (5) G1 X7.42251351351 Y10.0670810811 E1 G1 X-9.15202702703 Y8.02983783784 E1 G1 X-9.63951351351 Y7.96991891892 E1
G1 X-10.127 Y7.910 F600.000 ; move to first infill point M762
G1 Z0.250
G1 X-9.63348780488 Y7.91 E1 G1 X9.61348780488 Y7.91 E1
G1 X10.107 Y7.910 E0.56207 F600.000 ; infill G1 X10.107 Y7.44257142857 E1
G1 X10.107 Y5.10542857143 E1 G1 X10.107 Y4.638 E0.09090 ; infill G1 X9.61348780488 Y4.638 E1 G1 X-9.63348780488 Y4.638 E1 G1 X-10.127 Y4.638 E0.56207 ; infill G1 X-10.127 Y4.17042857143 E1 G1 X-10.127 Y1.83257142857 E1 G1 X-10.127 Y1.365 E0.09090 ; infill
68
G1 X-9.63348780488 Y1.365 E1 G1 X9.61348780488 Y1.365 E1 G1 X10.107 Y1.365 E0.56207 ; infill G1 X10.107 Y0.897571428571 E1 G1 X10.107 Y-1.43957142857 E1 G1 X10.107 Y-1.907 E0.09090 ; infill G1 X9.61348780488 Y-1.907 E1 G1 X-9.63348780488 Y-1.907 E1 G1 X-10.127 Y-1.907 E0.56207 ; infill G1 X-10.127 Y-2.37457142857 E1 G1 X-10.127 Y-4.71242857143 E1 G1 X-10.127 Y-5.180 E0.09090 ; infill G1 X-9.63348780488 Y-5.18 E1 G1 X9.61348780488 Y-5.18 E1 G1 X10.107 Y-5.180 E0.56207 ; infill G1 X10.107 Y-5.64742857143 E1 G1 X10.107 Y-7.98457142857 E1 G1 X10.107 Y-8.452 E0.09090 ; infill G1 X9.61348780488 Y-8.452 E1 G1 X-9.63348780488 Y-8.452 E1 G1 X-10.127 Y-8.452 E0.56207 ; infill M763 ;TESTINA 1 M106 S247.35 G91 G0 Z5 G90 M753 M721 G0 X0 Y0 M751 T0 G4 P0 M761 G1 Z0.950 G1 X9.61348780488 Y-8.452 E1
G1 X-9.63348780488 Y-8.452 E1 ; move to next layer (6) M760
G1 X-10.0829210526 Y-7.96307894737 E1 G1 X-8.49607894737 Y9.63807894737 E1
G1 X-8.452 Y10.127 F600.000 ; move to first infill point M760
69
G4 P0
G1 X-8.452 Y9.63348780488 E1 G1 X-8.452 Y-9.61348780488 E1
G1 X-8.452 Y-10.107 E0.56207 F600.000 ; infill G1 X-7.98457142857 Y-10.107 E1
G1 X-5.64742857143 Y-10.107 E1 G1 X-5.180 Y-10.107 E0.09090 ; infill G1 X-5.18 Y-9.61348780488 E1 G1 X-5.18 Y9.63348780488 E1 G1 X-5.180 Y10.127 E0.56207 ; infill G1 X-4.71242857143 Y10.127 E1 G1 X-2.37457142857 Y10.127 E1 G1 X-1.907 Y10.127 E0.09090 ; infill G1 X-1.907 Y9.63348780488 E1 G1 X-1.907 Y-9.61348780488 E1 G1 X-1.907 Y-10.107 E0.56207 ; infill G1 X-1.43957142857 Y-10.107 E1 1 X0.897571428571 Y-10.107 E1 G1 X1.365 Y-10.107 E0.09090 ; infill G1 X1.365 Y-9.61348780488 E1 G1 X1.365 Y9.63348780488 E1 G1 X1.365 Y10.127 E0.56207 ; infill G1 X1.83257142857 Y10.127 E1 G1 X4.17042857143 Y10.127 E1 G1 X4.638 Y10.127 E0.09090 ; infill G1 X4.638 Y9.63348780488 E1 G1 X4.638 Y-9.61348780488 E1 G1 X4.638 Y-10.107 E0.56207 ; infill G1 X5.10542857143 Y-10.107 E1 G1 X7.44257142857 Y-10.107 E1 G1 X7.910 Y-10.107 E0.09090 ; infill G1 X7.91 Y-9.61348780488 E1 G1 X7.91 Y9.63348780488 E1 G1 X7.910 Y10.127 E0.56207 ; infill M761
G1 Z1.150 F600.000 ; move to next layer (7) G1 X7.42251351351 Y10.0670810811 E1 G1 X-9.63951351351 Y7.96991891892 E1
G1 X-10.127 Y7.910 F600.000 ; move to first infill point M760
G4 P0
70
G1 X9.61348780488 Y7.91 E1
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G1 X9.61348780488 Y-8.452 E1 G1 X-9.13997560976 Y-8.452 E1 G1 X-9.63348780488 Y-8.452 E1 G1 Z1.350 F600.000 ; move to next layer (8) G1 X-10.0829210526 Y-7.96307894737 E1 G1 X-10.0388421053 Y-7.47415789474 E1 G1 X-8.54015789474 Y9.14915789474 E1 G1 X-8.49607894737 Y9.63807894737 E1
71
G1 X-8.452 Y10.127 F600.000 ; move to first infill point M760
G4 P0
G1 X-8.452 Y9.63348780488 E1 G1 X-8.452 Y-9.61348780488 E1
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G0 Z50
M84 ;disable motors ;END
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