376 (65) e 396 (struttura non mostrata, 126) sono ulteriori inibitori di ALK È stato riportato che 126 ha un rapporto di concentrazioni cervello-plasma nei top

paragonabile a quello di crizotinib (un substrato di P-gp con scarsa penetrazione nel SNC nell’uomo). Tuttavia, i ricercatori suggeriscono che, a causa della maggiore potenza di 126, può esserci una potenziale efficacia a livello del SNC. Comunque,

74 non sono stati riportati i livelli di farmaco libero nel cervello.

Mentre tutti questi inibitori di ALK di nuova generazione (Tabella 13) possono avere un potenziale per il trattamento del cancro ALK-positivo, i dati preclinici non sono sufficienti per dimostrare se queste molecole hanno minor efflusso mediato dal trasportatore e/o se raggiungono una significativa penetrazione cerebrale. PF-06463922 (66, Tabella 13) si distingue chiaramente tra gli inibitori di nuova generazione di ALK, poiché il raggiungimento di una penetrazione cerebrale libera era un evidente considerazione progettuale. 66, il quale ha un’azione opposta rispetto alle proteine di fusione EML4-ALK e a crizotinib resistente ad ALK mutato, è stato disegnato per essere un inibitore di ALK che penetra nel cervello attraverso la riduzione del trasporto di P-gp.(45)

Poichè la resistenza a crizotinib viene acquisita attraverso mutazioni di varie chinasi, o per la presenza di metastasi nel SNC, la Pfizer ha cercato di ottenere una molecola che potesse superare simultaneamente entrambi questi meccanismi di resistenza. Gli analoghi iniziali, capaci di inibire potentemente le mutazioni di ALK resistenti a crizotinib, non hanno raggiunto un equilibrio favorevole tra potenza e proprietà fisicochimiche che permettano di avere sia una buona stabilità metabolica che un basso efflusso mediato da P-gp. Per progettare i successivi inibitori di ALK con caratteristiche di lipofilia migliorate, sono stati utilizzati studi cristallografici. La “forma a U” che i ligandi hanno adottato in una struttura co-cristallina con ALK ha ispirato la sintesi di analoghi macrociclici. È stato visto che un anello lattamico a 12 termini migliora la stabilità microsomiale del fegato umano e riduce l’efflusso mediato da P-gp se confrontato con il suo analogo non ciclico (66 vs 67, Figura 9).

75 Figura 9. Macrociclizzazione condotta per migliorare la stabilità, la potenza e per ridurre l’efflusso mediato di P-gp in questa serie di inibitori di ALK

Invece di focalizzarsi sull’influenza di una singola proprietà fisicochimica sull’efflusso mediato da P-gp, la Pfizer ha messo in risalto la necessità di un’ottimizzazione di molti parametri vista l’influenza delle numerose proprietà fisico-chimiche sull’efflusso. In particolare, sono stati considerati HBD, log D e PM. In questi studi, gli analoghi non ciclici avevano livelli di efflusso mediato di P-gp superiori rispetto ai macrocicli con valori simili di PM, log D e HBD. Il composto 66, come gli altri macrocicli e anche gli analoghi non ciclici descritti, hanno la possibilità formare un legame a idrogeno intramolecolare tra l’amminopiridina e l’ossigeno adiacente dell’etere. Questo legame a idrogeno intramolecolare può mascherare efficacemente un HBD. È stato suggerito che i macrocicli possono avere un efflusso ridotto rispetto agli analoghi non ciclici dovuto a un numero ridotto di legami liberi e ad un’area di superficie accessibile al solvente più piccola del 10%. Sostanzialmente, 66 raggiunge un rapporto di concentrazione AUC di farmaco libero cervello-plasma di 0.2 dopo una somministrazione orale nei ratti.

76 In conclusione, ALK è uno dei pochi target di tipo chinasico, insieme a PI3K, EGFR e PLK, in cui i programmi di ricerca sono stati indirizzati specificatamente all’ottenimento di inibitori che penetrano il cervello. Con un inibitore di ALK attualmente in fase di studi clinici, si può pensare alla possibilità di una valutazione di tipo clinico.

HER 2

Nel trattamento del cancro al polmone HER-2 positivo con terapie con anticorpi, è stato riscontrato un parallelismo con la resistenza agli inibitori iniziali di ALK attraverso le metastasi cerebrali. Tra i pazienti trattati con Trastuzamab (Herceptib), le metastasi del SNC si manifestano in circa il 30% dei pazienti.(46) _{Lapatinib (68,} Tabella 12) è stato approvato come piccola molecola inibitrice di HER2/EGFR, ma gli studi preclinici hanno mostrato che nelle metastasi cerebrali non vengono raggiunte le concentrazioni terapeutiche, suggerendo che lapatinib non attraversa efficacemente la barriera ematoencefalica e che quindi non risulti efficace in quella regione.

Inoltre, uno studio di rapporti di concentrazione di farmaco cervello-plasma nei topi ha mostrato che lapatinib è un substrato di P-gp e Bcrp. In realtà, nello studio clinico lapatinib ha mostrato una penetrazione variabile e limitata nelle metastasi cerebrali HER2 positive. Oltre a lapatinib, sono state descritte almeno altre dodici piccole molecole inibitrici di HER2 in fase avanzata di studi clinici (Tabella 14). (47)

77 Tabella 14. Strutture e proprietà chiave degli inibitori di HER2 avanzati a studi clinici

78 Tra gli inibitori di HER2 che sono stati avviati a studi clinici, neratinib (69), inibitore di pan-HER, e tucatinib (70) sono stati introdotti in studi clinici su pazienti con cancro al polmone e metastasi cerebrali. Sfortunatamente, uno studio di fase II di neratinib in pazienti con metastasi cerebrali HER2 positive non ha avuto successo. La mancanza di efficacia riscontrata nello studio può essere in parte dovuta alla riconosciuta mancanza di penetrazione del SNC da parte di neratinib, determinata in studi preclinici e in accordo con il fatto che si tratta di un substrato di P-gp. Per quanto riguarda tucatinib, un metabolita attivo, esso ha mostrato di raggiungere rapporti di concentrazione cervello-plasma che variano da 0.5 a 2.1 lungo diversi intervalli di tempo dopo una dose orale di 75 mg/kg nei topi. Mentre sono stati riportati solo i rapporti di concentrazioni totali e dunque non è disponibile una vera indicazione della penetrazione di farmaco libero nel cervello, in altri studi tucatinib è stato capace di inibire p-HER2 nel tessuto cerebrale dei topi, dimostrando un certo grado di esposizione di farmaco libero. Oltre a ciò, tucatinib ha ottenuto un certo grado di sopravvivenza nei topi in uno studio di xenotrapianto intracranico HER2 positivo.(48)

TAC-285 (71) è un inibitore clinico di HER2 ed EGFR che ha dimostrato di essere capace di penetrare la BEE in studi preclinici. Nei ratti, il rapporto di concentrazione plasma–cervello (AUC) era 0.24 dopo una dose orale di 75 mg/kg. Inoltre, 71 ha mostrato di non essere un substrato di P-gp e di conferire efficacia in un modello di topo con metastasi cerebrali HER2-positive. Presi insieme i dati supportano la valutazione di 71 nel trattamento clinico di pazienti con metastasi cerebrali HER2 positive.

79 tirosine chinasi. È in atto uno studio clinico sulla sicurezza ed efficacia dell’impiego di dacomitinib per trattare pazienti con cancro ai polmoni HER2 positivo e con metastasi cerebrali progressive (NCT02047747). Sfortunatamente pare che non ci siano dati disponibili sulla possibilità che dacomitinib sia un substrato di trasportatori di efflusso che sono espressi a livello del BEE.

L’inibitore di pan-HER, AC480 (73) è stato utilizzato in uno studio di pazienti con GBM nei quali il tumore era stato reciso chirurgicamente dopo una somministrazione di farmaco. Questo studio ha dimostrato che 73 aveva concentrazioni nel tumore e nel cervello maggiori di quelle nel plasma, anche se non sia stata riportata nessuna concentrazione di farmaco libero che aiutasse a interpretarne un’eventuale efficacia. (49)

AEE788 (74), inibitore di HER2/EGFR/VEGFR, è risultato interessante per il trattamento del cancro al cervello. In studi preclinici, 74 aveva mostrato attività verso le linee cellulari del meduloblastoma e su uno xenotrapianto. Mentre è stato riportato che 74 conferisce sopravvivenza in un modello ortotopico di glioblastoma nei topi, non è stato possibile trovare documenti che riportano se 74 sia un substrato del trasportatore di efflusso o se sia capace di penetrare liberamente nel cervello. Sfortunatamente, non è stato possibile proseguire uno studio clinico di fase I di 74 che includeva pazienti con GBM a causa della tossicità della molecola senza benefici sui pazienti.

Pelitinib (75) è un altro inibitore di HER2/EGFR che è stato avviato a studi clinici ma risulta essere un substrato di Bcrp il che potrebbe limitare la sua esposizione al SNC. È stato riportato che CP-724,714 (76), inibitore di HER2, è un substrato sia di P-gp e Bcrp e pertanto era ipotizzabile che non fosse capace di attraversare

80 efficacemente la BEE.

CUDC-101 (77), sapitinib (78) e AST1306 (79) sono stati avviati in studi clinici ma non è stato possibile capire se queste molecole siano o meno substrati di trasportatori di efflusso, oppure se siano capaci di penetrare liberamente la BEE. I dati disponibili per Tucatinib e 71 mostrano che potrebbero essere ottenuti inibitori di HER2 che penetrano il cervello, e che sarebbero di grande interesse nel trattamento delle metastasi cerebrali HER2 positive. È quindi incoraggiante che possa essere realizzato un potenziale trattamento per le metasasi cerebrali HER2 positive.

b-Raf/MEK

Tradizionalmente, i pazienti con melanoma hanno un’alta frequenza (>90%) di sviluppo di metastasi cerebrali e, una volta manifestate, questi pazienti di solito sopravvivono per meno di 6 mesi.(50) Recentemente, sono stati approvati, per il trattamento del melanoma gli inibitori della mutazione di V600E di b-Raf (vemurafenib (80) e dabrafenib (81)) e gli inibitori della proteina chinasi attivata da mitogeni (MEK) (cobimetinib (85) e trametinib (86)), insieme alla combinazione di dabrafenib e trametinib, per il trattamento del melanoma. Poiché gli inibitori di b-Raf (incluso V600E mutato) e di MEK sono usati nel trattamento per il melanoma, è importante considerare come effettivamente questi agenti attraversano la BEE per trattare o prevenire le metastasi al SNC. Inoltre, b-Raf e MEK sono stati identificati come potenziali target per i tumori cerebrali primari. Almeno sette

81 inibitori di Raf e più di una dozzina di inibitori di MEK sono entrati a far parte di sudi clinici.

Tra gli inibitori clinici di Raf (Tabella 15), ci sono stati risultati di risposta clinica contrastanti in metastasi del SNC alla terapia con vemurafenib (80) o dabrafenib (81), che variano da inefficaci nel trattamento delle metastasi cerebrali, a casi di risposta completamente positiva. È stato riportato che entrambi vemurafenib e dabrafenib sono substrati di P-gp e di Bcrp e, tra l’altro, mostrano una scarsa penetrazione cerebrale di farmaco libero negli studi sui topi. I risultati contrastanti e le modeste percentuali di risposta clinica potrebbero essere attribuiti alla distruzione della BEE, e potrebbero essere ottenute velocità di risposta potenzialmente maggiori se un inibitore di b-Raf fosse capace di penetrare liberamente la BEE.

Raf-265 (82), apparentemente non attraversa in modo efficace la BEE, poiché questa molecola ha dimostrato efficacia in un modello di tumore di topo periferico, ma non in quello intracranico. Non è stato possibile ottenere informazioni che suggeriscano se gli inibitori clinici di Raf, encorafenib (83), XL281 (struttura non mostrata), RO5212054 (struttura non mostrata), ARQ-736 (84), o i loro metaboliti attivi, siano capaci di penetrare la BEE o se siano substrati dei trasportatori di efflusso. Insieme, i dati disponibili suggeriscono che un inibitore di Raf che penetra la BEE è irraggiungibile da ottenere, tuttavia, un inibitore di questo tipo avrebbe un grande potenziale nel trattamento dei tumori che metastatizzano al cervello.

82 Tabella 15. Strutture e proprietà chiave degli inibitori di B-Raf avanzati a studi clinici

Gli inibitori di MEK approvati, cobimetinib (85, Tabella 16) e trametinib (86, Tabella 16) hanno mostrato di avere una limitata penetrazione cerebrale nei topi, a causa dell’efflusso mediato da P-gp e da Bcrp. Oltre a questo, né cobimetinib né trametinib inibivano pERK nel normale tessuto cerebrale nei topi, dopo una somministrazione orale, nonostante mostrassero inibizione a livello periferico, ad ulteriore dimostrazione di una mancanza di penetrazione del SNC da parte di queste

83 molecole. Inoltre, anche in co-somministrazione, dabrafenib e trametinib avevano una bassa esposizione cerebrale nei topi.

Tabella 16. Strutture e proprietà chiave degli inibitori delle MEK avanzati a studi clinici

84 Tra gli altri inibitori clinici delle MEK, non è stato possibile reperire nessun dato sulla possibilità che GDC-0626 (87), binimetinib (88), selumetinib (89), CI-1040 (90), TAK-733 (91), RO5126766 (92), o WX-544 (struttura non mostrata), attraversino la BEE. Ciò nonostante, selumatinib e binimetinib sono stati studiati clinicamente per il trattamento del cancro al cervello.

L’inibitore della MEK PD0325901 (93) inibiva la crescita del tumore in uno studio su un modello di tumore di xenotrapianto murino di glioblastoma intracranico LN229.(51) Inoltre, il fatto che 93 sia capace di penetrare la BEE nei ratti è stato dimostrato da un’inibizione significativa di pERK in un normale tessuto cerebrale dopo la somministrazione orale del farmaco. Questa molecola ha mostrato tossicità neurologica in fase clinica, quindi, per evitare una simile tossicità, sono stati progettati specificamente refematinib (94) e RO4987655 (95), per non attraversare la BEE. Infatti, nonostante una considerevole esposizione periferica evidenziata negli studi sui ratti o sui topi, l’inibizione di pERK nel tessuto cerebrale da parte di queste molecole è trascurabile. Analogamente, AZD8330 (96) ha mostrato una penetrazione minima del SNC nei ratti. È stato riportato che pimasertib (97) inibisce pERK nel tessuto cerebrale nei topi, indicando un certo grado di penetrazione del SNC. In accordo con questi risultati, pimasertib non è risultato un substrato dei trasportatori di efflusso. E6201 (98), un inibitore di MEK e di altre chinasi, ha mostrato di raggiungere rapporti di concentrazione totale di farmaco cervello- plasma, di 4.8-6.4 nei roditori, nonostante non siano state riportate le concentrazioni di farmaco libero. A sostegno dell’ipotesi secondo cui 98 sia libero di raggiungere il suo target nel cervello murino, la molecola ha dimostrato beneficio di

85 sopravvivenza in un modello murino di metastasi cerebrali. Mentre in nessun caso è stato riportato che il raggiungimento della penetrazione cerebrale da parte di un inibitore di MEK sia stato preso in considerazione in fase di progettazione, in alcuni studi preclinici i due inibitori di MEK hanno raggiunto concentrazioni significative di farmaco a livello del SNC. Vale la pena notare che questi due inibitori di MEK (93 e 97) hanno entrambi una funzione diidrossi idrossammato (gli unici due tra i composti riportati in Tabella 14), e hanno quattro donatori di legami a idrogeno. È quindi curioso che le proprietà fisiche di 93 e di 97 non siano così in accordo i con i valori medi dei farmaci in commercio attivi sul SNC appartenenti alla categoria degli HBD, che è nota per avere un impatto sostanziale sull’efflusso mediato da P- gp. Comunque, sia 93 che 97 hanno il potenziale per interazioni a legame a idrogeno intramolecolare multiple, che potrebbero ridurre sia il valore totale effettivo degli HBD che la polarità di queste molecole. Mentre gli inibitori di MEK che penetrano il cervello offrono l’opportunità di studiare il loro beneficio in pazienti con cancro al cervello, 93 ha messo in risalto anche l’ulteriore rischio che la penetrazione cerebrale di piccole molecole di farmaco si aggiunga ad un percorso di sviluppo già difficile. Le attività on e off-target nel cervello hanno la possibilità di rendere un farmaco meno tollerato, limitando potenzialmente la capacità di ciascuna molecola di portare benefici a pazienti con tumore periferico.