Studi del meccanismo d’azione della RBV e dell’EICAR 1 Prova della carica virale

La prova della carica virale è stata eseguita sulle cellule VERO valutando l’effetto di diverse concentrazioni di RBV e di EICAR nei confronti del ceppo Bussel del cimurro. In particolare le concentrazioni testate sono state: 80, 40, 20 e 10 ȝg/ml di RBV e 20, 10, 5 e 2 ȝg/ml di EICAR. I tempi post-infezione ai quali si è provveduto alla raccolta del surnatante e delle cellule infette sono stati dopo 24, 48 e 72 ore. L’infezione delle piastre è stata eseguita con il ceppo Bussel ad una MOI di 0.05. Le modalità di esecuzione della prova sono state precedentemente descritte. La carica virale è stata valutata in seguito a titolazione virale e a PCR quantitativa.

7.1.1 Titolazione virale

La titolazione del virus presente nel surnatante e nelle cellule infette della prova di carica virale, è stata eseguita come indicato nel paragrafo 3 di questo capitolo. I titoli virali dei diversi campioni testati sono stati espressi in TCDI50/ml.

7.1.2 Quantificazione RNA virale

La quantificazione dell’RNA virale presente nei campioni della prova della carica virale è stata eseguita previa estrazione dell’RNA tramite Tri ReagentTM (Sigma, Missouri) contenente guanidina tiocianato e fenolo in grado di lisare le membrane cellulari. Partendo da 300 ȝl di campione è stato aggiunto 1 ml di Tri ReagentTM. Dopo centrifugazione a 12000 g per 10 minuti a 4°C, al surnatante sono stati aggiunti 200 ȝl di cloroformio e l’RNA è stato quindi separato in una fase acquosa soprastante dal DNA e dalle proteine. Successivamente, l’RNA è stato purificato con l’aggiunta di 500 ȝl di isopropanolo e, dopo centrifugazione a 12000 g per 10 minuti a 4°C, l’RNA è precipitato sotto forma di un pellet bianco. Il pellet di RNA è stato quindi ulteriormente lavato con l’aggiunta di 1 ml di etanolo 75% in seguito a centrifugazione a 7500 g per 5 minuti a 4°C, per poi essere infine risospeso in acqua Dnasi ed Rnasi-free. L’RNA virale è stato così conservato a –80°C.

Ai fini della quantificazione del RNA virale, è stata utilizzata una Real Time One-Step RT-PCR nella quale avvengono due reazioni, quella di retrotrascrizione e quella di quantificazione del cDNA, in una unica provetta. La coppia di primers e la sonda

utilizzate nella PCR quantitativa sono state disegnate nell’ambito del gene P del virus del cimurro al fine di amplificare una regione target di 119 nucleotidi. Le sequenze nucleotidiche del primer forward e reverse sono rispettivamente 5’- GTCGGTAATCGAGGATTCGAGAGAG-3’ e 5’-GCCGAAAGAATATCCCCAGTT- AG-3’, mentre la sequenza della sonda è 3’-AGCACTGAGGATTCTGGCGAAGAT- 5’. La sonda utilizzata era marcata all’estremità 5’ ad un fluoroforo FAM (FAM, 6- carboxy-fluorescein) e all’estremità 3' con una molecola detta Minor Groove Binder (MGB) che ha la proprietà di legarsi specificamente al solco minore dell'elica aumentando la specificità del legame con il templato. La Real Time è stata eseguita con lo strumento RotorGene (Corbett). La reazione di PCR è stata eseguita in un volume finale di 25 µl, utilizzando 12.5 µl di 2x QuantiTect Probe RT-PCR Master Mix (Qiagen), 900 nmol di ciascun primer, 200 nmol di sonda, 0.5 µl di QuantiTect RT Mix (Qiagen) e 2.5 µl di RNA. Nell’ambito di ciascuna Real Time One-Step RT-PCR è stato incluso uno standard interno rappresentato da RNA virale, quantificato mediante spettrofotometro, al fine di costruire una curva standard di riferimento. Lo standard RNA, costituito da RNA del ceppo Bussel estratto da una coltura cellulare infetta, è stato diluito in base dieci e ciascuna diluizione è stata conservata a –80°C per essere scongelata una sola volta al momento della preparazione della Real Time. L’amplificazione è stata eseguita con una prima fase di retrotrascrizione a 50°C per 30 minuti e 95°C per 15 minuti, seguita da 45 cicli di amplificazione costituiti da una denaturazione a 94°C per 15 secondi e da un’unica fase di annealing and elongation a 60°C per 60 secondi.

Nell’ambito della stessa reazione sono stati amplificati in doppio sia i campioni da quantificare che le diluizioni dello standard a RNA.

7.2 Prova del time of addition

Il time of addition è una prova antivirale nella quale le diluizioni della RBV e dell’EICAR vengono a tempi diversi dopo l’infezione del monostrato cellulare con il virus del cimurro. I risultati di questa prova forniscono un’indicazione del momento in cui le due molecole agiscono durante il ciclo replicativo del virus del cimurro. Sono state allestite piastre da 96 pozzetti con cellule VERO che sono state incubate a 37°C e 5% di CO2 fino al raggiungimento della confluenza. L’infezione è stata eseguita con il

ceppo Bussel ad una MOI di 0.1. Le piastre sono state suddivise in modo da identificare 11 parti che corrispondono ai tempi post-infezione nei quali sono stati aggiunti i composti antivirali: tempo 0 (che corrisponde all’aggiunta dei composti nello stesso momento dell’infezione), dopo 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24 e 48 ore. In ciascuna delle 11 parti, sono state incluse le diluizioni in doppio della RBV (da 100 a 3.12 ȝg/ml, diluizioni per raddoppio), le diluizioni in doppio dell’EICAR (da 20 a 0.62 ȝg/ml, diluizioni per raddoppio), e i pozzetti di controllo cellule e di controllo virus. Le piastre sono state incubate a 37°C e 5% di CO2 fino al raggiungimento del 100% di effetto

citopatico nei pozzetti di controllo virus. La lettura della prova è stata eseguita come una prova antivirale standard ed in seguito è stata calcolata la IC50 in corrispondenza di

ciascun tempo post-infezione in cui la RBV e l’EICAR sono stati aggiunti. Dal confronto dei valori di IC50 ottenuti per uno stesso composto, al variare del tempo,

vengono ottenuti i dati relativi all’efficacia del composto al progredire dell’infezione in coltura.

7.3 Prova antivirale in presenza dei nucleosidi

Uno dei meccanismi d’azione più noti della RBV e dell’EICAR è l’inibizione dell’enzima IMPDH cellulare con conseguente riduzione del pool intracellulare di GMP, GDP e GTP. E’ noto che la presenza di guanosina nel terreno di coltura riduca ed in alcuni casi inibisca, l’attività antivirale della RBV e dell’EICAR (De Clercq et al., 1991, Leyssen et al., 2005). Per dimostrare questo meccanismo d’azione anche nei confronti del virus del cimurro, sono state eseguite prove antivirali in presenza di guanosina e degli altri nucleosidi, in particolare citidina, adenosina e uridina (Sigma, Missouri). Ciascun nucleoside è stato testato nei confronti dei ceppi Bussel e Ondestepoort, da solo e in presenza di RBV e EICAR,. Sono state allestite piastre da 96 pozzetti con cellule VERO che sono state incubate a 37°C e 5% di CO2 fino al

raggiungimento della confluenza. L’infezione è stata eseguita con 100 ȝl di virus che è stato rimosso dopo 2 ore di incubazione a contatto con le cellule. Sono state allestite diluizioni per raddoppio dei vari nucleosidi ed in seguito sono state aggiunte in doppio alla piastra, sia in presenza che in assenza della RBV e dell’EICAR. Le piastre sono state incubate a 37°C e 5% di CO2 fino al raggiungimento del 100% di effetto citopatico

prova antivirale standard con il calcolo di valori di IC50. La IC50 della RBV e

dell’EICAR in presenza dei vari nucleosidi è stata calcolata come la media dei risultati di numerose prove indipendenti sia nei confronti del ceppo Bussel che Ondestepoort.