Ultrafiltrazione

L’Eluato 1 della prima colonna viene filtrato con due filtri Optiscale da 0,22 μm, quindi è dializzato con due cassette da ultrafiltrazione da 100 KDa, contro tampone Sodio Citrato 20 mM, EDTA 5 mM, pH 7,0 e portato ad una concentrazione proteica compresa tra 2,5 e 3,5 mg/ml.

Il campione recuperato dall’ultrafiltro è sottoposto ad un altro step di filtrazione con due filtri Optiscale da 0,22μm.

4.7 Step di polishing: cromatografia per affinità.

La seconda cromatografia viene eseguita con resina Toyopearl AF-Heparin HC-650M, impaccata su colonna XK16 di 1,6 cm di diametro per un’altezza di 13cm.

Le condizioni di corsa applicate sono elencate di seguito:

1) condizionamento della colonna con il tampone Sodio Citrato 20 mM, EDTA 5 mM, pH 7,0; 2) caricamento del campione ultrafiltrato;

3) raccolta della frazione non adsorbita fin tanto che l’assorbanza, alla lunghezza d’onda di 280 nm, non sia tornata sulla linea di base;

4) lavaggio con il tampone Sodio Citrato 20 mM, EDTA 5 mM, pH 7,0; 5) lavaggio con il tampone Sodio Citrato 20 mM, EDTA 5 mM, NaCl 80 mM;

6) eluizione con il tampone Sodio Citrato 20 mM, EDTA 5 mM, NaCl 160 mM: il campion 7) raccolto è denominato Eluato 2;

8) lavaggio con NaCl 1M.

4.8 Nanofiltrazione

L’Eluato 2 è filtrato con filtro Optiscale 0,1 μm e quindi nanofiltrato con filtro di grado virale, Planova 20N, di 20 nanometri di porosità e una superficie totale di 10 cm2, che assicura la rimozione per esclusione molecolare dei virus evelope e non envelope.

Il filtro da 0,1 μm e il nanofiltro sono condizionati con il tampone Sodio Citrato 20 mM, EDTA 5 mM, NaCl 160 mM e in entrambi i casi con lo stesso tampone è effettuato un lavaggio che viene unito ai rispettivi filtrati.

5. SDS-PAGE

5.1 Condizioni della corsa elettroforetica

L’elettroforesi su gel di poliacrilammide è condotta utilizzando la cella elettroforetica della ditta Invitrogen.

Si utilizzano gel precast NuPAGE® Bis-Tris Mini Gels. La corsa viene effettuata in tampone NuPAGE® MOPS SDS Running Buffer, diluito 1:20 e contenente MOPS 50 mM, Tris Base 50 mM, SDS 0,1%, EDTA 1mM pH 7.7.

Se l’elettroforesi è condotta in condizioni riducenti, nella camera interna della cella elettroforetica

vengono aggiunti 500 µl di agente antiossidante (NuPAGE® Antioxidant), costituito da N,N-Dimetilformamide, in modo da mantenere i campioni nello stato ridotto.

La camera elettroforetica viene connessa ad un alimentatore e la corsa è condotta a 200 Volts per circa 45 minuti.

5.2 Preparazione dei campioni

I campioni per l’elettroforesi vengono preparati secondo quanto riportato in tabella 3:

I campioni vengono diluiti direttamente nel NuPAGE® LDS Sample Buffer alla concentrazione desiderata. Per i campioni ad alta concentrazione si effettua un pre-diluizione in acqua deionizzata.

Reagente Capione ridotto Campione non

ridotto Campione X µl X µl Sample buffer (4x) 12.5µl 12.5 µl Agente riducente (10x) 5µl - H2O deionizzata 32.5- X µl 37.5 µ l - X µl Volume totale 50 µl 50 µl

Se la corsa viene effettuata in condizioni riducenti, è incluso nella miscela l’agente riducente NuPAGE® Sample Reducing Agent, diluito 1:10, contenente Ditiotritolo (DTT) 500 mM, capace di ridurre i ponti disolfuro delle proteine presenti nel campione.

I campioni ottenuti vengono incubati a 70°C per 10 minuti, nel termoblocco.

5.3 Colorazione del gel e acquisizione

Al termine dell’elettroforesi il gel viene immerso in un adeguato volume del colorante SimplyBlueTM SafeStain e mantenuto in agitazione per 1 ora.

Il gel viene decolorato con acqua deionizzata per il tempo necessario ad evidenziare le bande e a ridurre il più possibile il rumore di fondo.

Dopo aver essiccato il gel, esso viene acquisito con lo strumento Chemidoc BioRad, per mezzo del software LabImage.

6. Western Blot

6.1 Preparazione dei campioni

I campioni analizzati sono prediluiti in modo da ottenere una concentrazione finale di fH pari a 100 ng/µl. Quindi si procede alla preparazione dei campioni per SDS-PAGE come descritto al paragrafo 5.2.

6.2 Elettroforesi in gel di poliacrilamide

L’SDS-PAGE viene condotta sia in condizioni riducenti che non riducenti come descritto al paragrafo 5.2. Come standard di peso molecolare sono impiegati gli standard Magic Mark XP, costituiti da una miscela di proteine ricombinanti caratterizzate da un sito di legame per le IgG, che ne permette il riconoscimento da parte dell’anticorpo secondario. Di conseguenza la visualizzazione degli standard avviene utilizzando gli stessi reagenti e lo stesso protocollo della proteina di interesse.

6.3 Trasferimento su nitrocellulosa

Il trasferimento del gel su nitrocellulosa è condotto utilizzando il sistema Western Blot Trans Blot SD Semi Dry Transfer Cell per 20minuti ad un voltaggio di Prima di procedere al trasferimento il gel, le membrane di nitrocellulosa e la carta da filtro, sono equilibrate in tampone di trasferimento Tris 0,025 mM, Glicina 0,19 M , Metanolo al 20 %, pH 8,3.

L’avvenuto trasferimento è verificato colorando le membrane di nitrocellulosa con rosso Ponceau, seguito da un lavaggio con acqua che permette la visualizzazione delle bande. Per allontanare il rosso Ponceau sono effettuate lavaggi con PBS-T 0,1 %.

6.4 Rivelazione colorimetrica

La membrana di nitrocellulosa viene sviluppata con substrato cromogenico CN/DAB secondo il seguente protocollo:

1) incubazione con la soluzione di saturazione per un’ora a temperatura ambiente o overnight a 4 °C, per limitare la formazione di legami aspecifici tra anticorpo e membrana;

2) due lavaggi di 5 minuti con PBS–T 0,1%;

3) incubazione con anticorpo primario anti-fH diluito 1:5000 con la soluzione di saturazione, per un’ora a temperatura ambiente;

4) due lavaggi di 5 minuti con PBS–T 0,1%;

5) incubazione con anticorpo secondario di capra anti-IgG, diluito 1:10000 nella soluzione di saturazione, per un’ora a temperatura ambiente;

6) due lavaggi da cinque minuti con PBS-T 0,1 %;

7) incubazione con subtrato CN/DAB diluito 1:10 con buffer substrato; 8) stop della reazione lavando con acqua deionizzata.

7. Valutazione dell’attività di cofattore del fH

Il fI, in presenza del fH, effettua due tagli sequenziali nella catena α’ del C3b, il primo taglio dà origine ai frammenti α-68 e α-43 e il secondo taglio divide ulteriormente la catena α-68 in α-27 e C3dg (Figura 1).

Per la determinazione dell’attività di cofattore i prodotti di degradazione del C3b vengono visualizzati mediante SDS-PAGE o mediante Western blot.

7.1.1 Valutazione dell’attività di cofattore nel surnatante III

Il test di attività di cofattore è eseguito incubando 500 ng di C3b e 250 ng di fI con quantità variabili di fH presente nei campioni in esame (1-2,5-5-10 ng), in tampone PBS.

Questo test è stato eseguito sulla frazione III solubilizzata in tampone Tris 50 mM, EDTA 5 mM, pH 8,5, dopo allontanamento della celite e perlite mediante centrifugazione (surnatante III). A questo scopo il fH presente in questi campioni è purificato su colonna di immuno-affinità 5H5. Come controllo è utilizzato fH purificato da plasma mediante colonna di immuno-affinità 5H5. Le miscele di reazione vengono incubate a 37 °C per 30 minuti e la reazione è bloccata mediante l’aggiunta del sample buffer per elettroforesi. I campioni sono quindi analizzati mediante SDS- PAGE su gel NuPAGE Novex 4-12 % in condizioni riducenti e successivo western blot con anticorpo policlonale anti-C3.

Sulla membrana di nitrocellulosa sono visualizzate le seguenti bande: α’ (104 kDa), β (70 kDa), α-68, α-47 e α-27. La membrana viene acquisita ed analizzata per densitometria con il programma

TotalLab. L’attività cofattoriale del fH è determinata valutando la diminuzione dell’intensità della catena α’ rispetto a β.

7.1.2 Valutazione dell’attività di cofattore nell’ eluato 2

Il test di attività di cofattore sugli eluati 2 è eseguito incubando 500 ng di C3b e 250 ng di fI con quantità variabili di fH presente nei campioni in esame (0,5-1-2,5-5 ng), in tampone PBS.

A questo scopo il fH presente in questi campioni è purificato mediante immunoprecipitazione con biglie di sefarosio coniugate con l’anticorpo 5H5.

Come controllo è utilizzato fH purificato da plasma mediante colonna di immuno-affinità 5H5. Le miscele di reazione vengono incubate a 37 °C per 30 minuti e la reazione è bloccata mediante

l’aggiunta del sample buffer per elettroforesi. I campioni sono quindi analizzati mediante SDS-PAGE su gel NuPAGE Novex 4-12 % in condizioni riducenti.

Sul gel di nitrocellulosa sono visualizzate le seguenti bande: α’ (104 kDa), β (70 kDa), α-68, e α-47. Il gel viene acquisito ed analizzato per densitometria con il programma TotalLab. L’attività cofattoriale del fH è determinata valutando la diminuzione dell’intensità della catena α’ rispetto a β.

8.Valutazione dell’integrità strutturale del fH

Il fH, durante la purificazione, è suscettibile a un taglio proteolitico ad opera di proteasi che danno origine ad una forma troncata, in cui due catene di 130 kDa e 35 kDa sono unite da un ponte S-S; ne deriva che la forma troncata e la forma integra sono distinguibili solo mediante SDS-PAGE condotta in condizioni riducenti.

In campioni puri o parzialmente purificati l’integrità strutturale del fH viene valutata mediante SDS-PAGE in condizioni riducenti, mentre per campioni grezzi è necessario procedere con l’analisi mediante western-blotting o in alternativa tali campioni vengono purificati mediante una colonna di immuno-affinità funzionalizzata con l’anticorpo 5H5, altamente specifico per il fH, o mediante immunoprecipitazione con biglie in sefarosio coniugate con l’anticorpo 5H5.

8.1 Purificazione del fH con colonna di immunoaffinità e per immunoprecipitazione

La purificazione del fH dagli intermedi di interesse è ottenuta mediante colonna di immunoaffinità (colonna 5H5) o mediante immunoprecipitazione (biglie di sefarosio 5H5). In entrambi i casi il binding del fH avviene in tampone PBS mentre l’eluizione è condotta mediante tampone di eluizione Glicina 0,1 M pH 3,0.

8.2 Digestione dei campioni di fH e dello standard con tripsina

Per mimare l’azione delle proteasi a serina i campioni di fH, purificati come descritto sopra, e lo standard commerciale sono digeriti con tripsina in tampone TBS ad una concentrazione proteica di 0,25 ug/ul.

Viene aggiunta tripsina in un rapporto di 1:100 enzima/fH, e il tutto è incubato a 37°C per 5 minuti. La reazione viene stoppata con l’aggiunta dell’inibitore di tripsina (trypsin inhibitor), diluito 1:2.

9. Analisi proteomica del concentrato di fH

L’analisi proteomica del concentrato di fH è stata condotta in collaborazione con l’Istituto di Fisiologia Clinica del Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR) di Pisa.

Il campione da analizzare viene desalificato utilizzando cartucce PIERCE, quindi vengono presi 150 µl di eluato, a cui sono aggiunti 50 µl di ammonio bicarbonato 25 mM, a pH 8. Le proteine presenti nella miscela vengono ridotte con DTT alla concentrazione finale 5 mM e mantenute in contatto per 20 minuti alla temperatura di 80°C. Successivamente si effettua l’alchilazione del campione al buio, mediante l’aggiunta di iodoacetamide 10 mM, per un tempo di incubazione di 30 minuti alla temperatura di 37 °C. Si procede con la digestione con 0,25 µg/ml di tripsina, in rapporto di 1:100 enzima/substrato, facendo avvenire la reazione a 37 °C overnight. Il campione peptidico viene purificato mediante eluizione con una cartuccia C18 e l’eluato viene filtrato con filtri da 0,45 µm per eliminare l’eventuale particolato.

9.2 Analisi nano-LC-ESI-MS/MS e processamento dei dati

Due µg totali di campione vengono iniettati in pre-colonna (C18 PepMap 100, 5 µm, 100 Å LC Packings) e successivamente vengono sottoposti a cromatografia liquida in fase inversa a nano flusso (nano-HPLC) per favorire la separazione dei peptidi, in colonna a fase inversa (fused silica capillary PM 100 C18, 3 µm, 75 µm x 150mm), eluendo al flusso costante di 300 nL/min ed applicando un gradiente lineare dal 95% al 40 %, per 60 minuti, di soluzione A (H2O con acido

formico allo 0,1 %) su soluzione B (acetonitrile con acido formico allo 0,1 %), seguito da una eluizione isocratica per 10 minuti, al 95 % di B.

I peptidi in uscita dalla colonna vengono convogliati allo spettrometro di massa Triple TOF e l’analisi di massa viene effettuata in modalità di ionizzazione in positivo con un potenziale di voltaggio dello Spray di 2500V, il range m/z è impostato su 350–1250 per l’analisi in massa e 100–

1500 per l’analisi MS/MS. Gli spettri vengono acquisiti utilizzando una calibrazione esterna. I dati vengono raccolti dal software di controllo Analyst TF (AbSciex). Il sistema Triple TOF opera in modalità IDA (acquisizione informazione-dipendente) nel quale ogni scan MS è seguito da 100 scan MS/MS dove i 25 ioni molecolari più abbondanti vengono dinamicamente selezionati e frammentati dalla dissociazione indotta dalla collisione utilizzando una energia di collisione oscillante.

Gli spettri di massa vengono processati utilizzando l’algoritmo Paragon e l’algoritmo MASCOT incorporati nel software ProteinPilot (AB SCIEX) che utilizzano Uniprot 2012 human protein come banca di dati. La tolleranza per gli ioni precursori in massa è di 50 ppm e per gli ioni frammenti è 0.3 Da.

Capitolo III

RISULTATI