V ALUTAZIONE DELLE MUTAZIONI DI EGFR

Screening mediante PCR-SSCP (PolymeraseChainReaction Single StrandConformationPolymorphism) delle mutazioni di EGFR

La PCR (PolymeraseChainReaction) è una tecnica enzimatica che permette di amplificare in vitro specifiche regioni di DNA mediante ripetuti cicli di replicazione.

Il materiale di partenza è, generalmente, DNA a doppia elica contenente la sequenza in esame e la reazione viene catalizzata da un DNA-polimerasi I di E.Coli. Per la reazione di amplificazione sononecessari:

 il DNA in esame  la DNA-polimerasi

 frammenti di oligonucleotidi sintetici (“primers”) in grado di ibridarsi ai

filamenti complementari

 una miscela dei quattro desossinucleotidi (dNTP)

 un tampone di reazione contenente sali, per mantenere costante il pH  ioni magnesio (MgCl2) per stabilizzare i nucleotidi

I componenti della reazione vengono miscelati in una micro-provetta.

Il saggio è poi sottoposto a ripetuti cicli di amplificazione, ciascuno dei quali è composto da 3 fasi:

 Denaturazione a 94-95º C per 1-2 min, che consente di separare la doppia elica

di DNA.

 Ibridazione a 37-65º C per 1-2 min, per favorire la formazione dei legami tra i

“primer” e le rispettive sequenze complementari.

 Estensione a 37º C per 1-3 min con la DNA-polimerasi I, per allungare i

“primer” ibridati (in direzione 5'-3') mediante polimerizzazione dei dNTP, usando come stampo la catena singola del bersaglio.

In teoria ogni ciclo di PCR dovrebbe raddoppiare il numero di molecole di partenza del frammento bersaglio di DNA. In pratica l'efficienza dell' amplificazione esponenziale è minore del 100% anche in condizioni di enzima e substrato non limitanti, a causa dell' attività subottimale della DNA-polimerasi, della comparsa di sotto-prodotti della reazione con effetto inibitore (pirofosfati), di una incompleta denaturazione dei campioni, della dimerizzazione dei “primer” e della competizione tra i “primer” ed i frammenti di DNA amplificati che possono ibridarsi tra loro piuttosto che con i “primer”. La resa della reazione è attendibile solo se calcolata nella fase esponenziale; dopo un certo numero di cicli l'amplificazione, difatti, raggiunge un plateau, come risultato di un'attività decrescente dell' enzima in seguitoa a ripetute esposizioni a 95º C e delle limitazioni stechiometriche dei componenti di reazione.

La PCR è una tecnica molto semplice da realizzare in quanto richiede solamente variazioni di temperatura effettuate in modo automatico e programmato da apparecchi noti come termociclizzatori. Nonostante questa semplicità, sia nel principio che nella realizzazione, possono verificarsi alcuni problemi: il più frequente è la possibile contaminazione da prodotti di amplificazione precedenti. È necessario pertanto lavorare in un ambiente il più possibile separato dagli altri ed inserire sempre un controllo negativo. Un altro accorgimento è quello di utilizzare un DNA perfettamente purificato, non contaminato da proteine o RNA. Si devono inoltre realizzare alcune condizioni:

 le condizioni iniziali di reazione dei primi cicli devono ridurre al minimo la

possibilità che i “primer” comincino una reazione di estensione a partire da sequenze di DNA diverse da quello bersaglio

 le condizioni dei cicli successivi devono permettere che tutte le molecole

appena sintetizzate siano perfettamente replicate con grande efficienza in modo da essere raddoppiate di numero alla fine di ogni ciclo

 le sequenze dei “primer” devono essere esattamente complementari, o il più

nessun altra sequenza presente nel DNA campione.

La procedura di amplificazione degli esoni 18-21 di EGFR prevede: denaturazione iniziale a 94º C per 7 min, 35 cicli di amplificazione con denaturazione a 94º C per 1 min, appaiamento a 58º C per 1 min e sintesi a 72º C per 1 min seguiti da un' estensione finale di 7 min.

Come controllo negativo viene omesso il DNA stampo nella reazione.

I prodotti di amplificazione sono controllati mediante analisi elettroforetica su gel orizzontale di agarosio al 2% colorato con bromuro di etidio.

Visualizzazione del prodotto di amplificazione

La visualizzazione del prodotto di amplificazione viene realizzata mediante corsa elettroforetica in una matrice di gel di agarosio che consente di separare, identificare ed eventualmente purificare gli acidi nucleici.

Le molecole di DNA e RNA sono cariche negativamente per la presenza di gruppi fosfato ionizzati, in un campo elettrico uniforme, quindi, migrano verso il polo positivo. I frammenti di DNA vengono separati in base alla loro lunghezza (velocità di corsa inversamente proporzionale al logaritmo in base 10 del peso molecolare). Il gel di agarosio standard è utilizzato per separare sequenze nucleotidiche di 0.2-10Kb e viene ottenuto aggiungendo agarosio in polvere ad una specifica quantità di tampone elettroforetico. Da questa soluzione, dopo ebollizione e successivo raffreddamento, si ottiene un gel semisolido orizzontale contenente ad una estremità i pozzetti per il caricamento dei campioni. In ogni campione viene aggiunto un colorante-tracciante (blu di bromofenolo allo 0.25%, xilene-cianolo allo 0.25% e glicerolo) con il duplice scopo di facilitare il caricamento nel gel e di monitorare la corsa elettroforetica. Dopo la colorazione dei campioni vengono applicati due elettrodi alle estremità della vaschetta collegati ad un alimentatore con induzione del campo elettrico. Gli acidi nucleici vengono visualizzati mediante colorazione con

Al termine della corsa viene osservato il gel al transilluminatore e lo si fotografa con fotocamera digitale.

In ogni pozzetto sono stati caricati 10 μl di amplificato con 2 μl di colorante; 1 μl di “marker” a peso molecolare noto (100 bp di DNA) viene caricato con 2 μl di colorante e 9 μl di acqua. Il confronto con le bande generate dal “marker” permette la verifica delle dimensioni in paia basi (bp) dei prodotti di amplificazione.

La tecnica di SSCP (Single StrandConformationPolymorphism) è uno dei metodi più utilizzati per la ricerca di mutazioni di singole paia basi nel DNA genomico: il principio su cui si basa è che due molecole di DNA a singola elica, di lunghezza uguale ma di sequenza diversa (anche per un solo nucleotide) migrano in modo differente in un gel di acrilamide per reazioni di ripiegamento intramolecolare sequenza-dipendenti. Una mutazione, anche puntiforme, si può manifestare con una differenza di conformazione e quindi con un “pattern” di corsa elettroforetico differente.

Nella pratica la tecnica di SSCP è eseguita in combinazione con la tecnica di PCR. L’utilizzo di “primer”specifici, infatti, consente l'amplificazione della regione genica di interesse partendo dal DNA estratto dal campione tissutale: nel nostra analisi si utilizzano “primer” specifici per gli esoni 18-21 di EGFR. I prodotti di amplificazione della PCR, relativi ai differenti esoni, vengono poi caricati su gel di acrilamide (tecnica SSCP) per individuare eventuali alterazioni elettroforetiche indicative di possibile mutazione.I prodotti di amplificazione dei campioni vengono infine purificati con “ConceptRapid PCR Purification System” e quindi sottoposti a sequenziamentoautomatico allo scopo di confermare e caratterizzare biologicamente la mutazione evidenziata.

Sequenziamento automatico

Nella nostra casistica la valutazione della presenza di mutazioni di EGFR è stata completata dall’analisi delle specifiche mutazioni mediante l’utilizzo del

sequenziamento automatico.

I prodotti di amplificazione dei campioni probabilmente mutati sono stati purificati con Exo SAP-IT (USB, AmershamBiosciences, Milano), un tampone contenente due enzimi idrolitici in grado di degradare residui di “primers” e dNTPs.

I campioni cosi’ purificati sono stati sottoposti al sequenziamento diretto utilizzando il ThermoSequenase Cy5 Dye Terminator Kit, lo strumento ALFexpressIIcon i gel Reprogel Long Read (AmershamBiosciences, Milano) in accordo alle istruzioni della ditta produttrice.

Il sequenziamento del DNA si basa sull’incorporazione casuale nella sequenza del campione in esame di-deossinucleotidi (ddNTPs) che, a differenza dei deossinucleotidi, mancano di un gruppo ossidrile in posizione 3’ e bloccano la reazione di amplificazione impedendo la formazione del legame fosfodiesterico. Si ottengono, in questo modo, filamenti di DNA di lunghezza variabile da un singolo nucleotide ad una lunghezza pari a quella della sequenza amplificata. É possibile separare la miscela di filamenti di DNA in base al loro peso molecolare su un gel di acrilammide in condizioni denaturanti. Il sequenziatore automatico utilizzati prevede l’utilizzo di un unico fluorocromo comune a tutti e quattro o ddNTPs; è necessario perciò effettuare quattro reazioni di PCR separate per ogni campione da analizzare.

Il prodotto di reazione deve essere purificato per eliminare qualunque traccia di ddNTPs che non siano stati incorporati nella sequenza; si esegue una semplice precipitazione etanolica, seguendo il protocollo consigliato nelle istruzioni del kit. A questo punto il prodotto di sequenza purificato viene denaturato in presenza di un tampone contenente formammide a 70º per 2 min e fatto correre su gel di acrilammide in tampone TBE 0.5X.