Valutazione della risposta immunitaria cellulare

L’argomento è stato in parte già affrontato nel paragrafo dell’immunologia99. Sulla base di quanto asserito in quella sede - riassumendo: i soggetti infetti con malattia clinicamente manifesta mostrano una risposta immunitaria prevalentemente umorale e non protettiva (simil-Th2), mentre i soggetti infetti che non sviluppano la malattia mostrano una risposta immunitaria prevalentemente cellulare e protettiva (simil-Th1) (Ferrer et al., 2000) - nella pratica clinica sarebbe molto utile disporre di tecniche semplici, veloci e di basso costo, che permettano di determinare l’intensità 96 _Brasile. 97 Iran. 98 _Italia. 99 _2.3.1

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immunitaria cellulare

della risposta immunitaria cellulare nei cani leishmaniotici, al fine di stabilire la prognosi e di valutare la risposta alla terapia. Il test cutaneo alla leishmanina (LST, reazione di Montenegro) è certamente il metodo più facilmente applicabile in condizioni pratiche, anche se la necessità del follow-up a 72 ore dall’inoculo, la variabilità intrinseca comune ad ogni test in vivo e la possibilità di indurre falsi positivi iatrogeni in seguito a test ripetuti, ne minano la fruibilità (Fernández-Bellon et

al., 2005). Una tecnica alternativa potrebbe essere la determinazione della variazione

delle diverse sottopopolazioni linfocitarie ematiche in corso di terapia: ci sono diverse pubblicazioni sull’utilizzo in questo senso della citometria di flusso100. In base a queste, risulta che nei cani malati si assiste ad una riduzione della percentuale dei linfociti T CD4+ e del rapporto CD4/CD8+, che si normalizzano in seguito alla terapia ed alla guarigione clinica (Bourdoiseau et al., 1997[1]; Moreno et al., 1999; Guarga et

al., 2000, 2002). Molti di questi studi, però, sono stati condotti su un numero di casi

esiguo e con follow-up brevi od assenti. Ci sono però anche segnalazioni di difetti di affidabilità dello studio delle sottopopolazioni linfocitarie, a fini prognostici e di monitoraggio terapeutico. Pertanto, attualmente, mancando univocità, tali metodiche non rappresentano delle buone rappresentazioni della risposta cellulomediata. Dal momento che la risposta immunologica al parassita dipende eminentemente dalla componente cellulare del sistema immunitario, e che nella specie canina è stato dimostrato che gli animali infetti che non sviluppano la malattia o che rispondono bene al trattamento, presentano una risposta immunitaria eminentemente cellulare, l’indicatore di prima scelta per lo studio dell’evoluzione della malattia e dello stato immunologico individuale, molto probabilmente è rappresentato dal profilo delle citochine espresse dalle cellule mononucleate del sangue periferico, in particolare IL- 4, IFN-γ ed IL-2 (Miranda et al., 2007). de Lima e coll. (2007) hanno dimostrato che nel sangue dei cani con malattia attiva, aumentano i livelli di IL-6, non correlati direttamente con il titolo anticorpale. Moreno e Alvar (2002) hanno dimostrato che nell’infezione sperimentale da L. infantum l’immunità protettiva è associata alla produzione di IL-2, IFN-γ e TNF-α da parte delle cellule mononucleate del sangue periferico. Manna e coll. (2006) hanno dimostrato che i soggetti infetti asintomatici che esprimono alti livelli di IL-2 e IFN-γ, tendono anche a restare asintomatici durante

100 _{Nonostante la trattazione in questa sede per ragioni logiche, non si tratterebbe di metodi}

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il follow-up di 2 anni; invece altri soggetti infetti asintomatici, il cui sangue periferico non esprime le dette citochine, nel corso del follow-up diventano sintomatici, con la comparsa delle stesse: gli Autori suggeriscono che la rilevazione di IL-2 e IFN-γ, in assenza di sintomi, può essere associata con la protezione nei confronti della progressione dell’infezione verso la malattia conclamata, e quindi affermano che le due citochine possono rappresentare dei buoni marker per predire l’evoluzione dell’infezione in soggetti asintomatici.

3.2.2.1. Test cutaneo alla leishmanina (LST, reazione di Montenegro)

L’LST101 - tecnica che rileva l’ipersensibilità ritardata (Pearson et al., 2001) - consiste nell’inoculazione intradermica di antigeni di Leishmania (3 x 108 promastigoti inattivati) ed in sospensione in una soluzione salina sterile102 (0,1 ml), solitamente a livello addominale; a 48 e/o 72 ore viene valutato il diametro dell’eventuale reazione cutanea (diametro orizzontale e/o verticale), sotto forma di un’area indurita, allargata e rilevata e/o arrossata; il test è considerato positivo - espressione di un’efficace immunità cellulare - se l’area ha diametro ≥ a 5 mm (Pinelli

et al, 1994; Cardoso et al., 1998). In genere l’LST, pur essendo un buon metodo103, da solo non è considerato sufficientemente indicativo della risposta cellulare efficace, per cui dovrebbe essere associato con altre rilevazioni immunologiche e/o cliniche (Paranhos-Silva et al., 2001), come il biotest di inibizione dell’effetto citopatico dell’IFN-γ (IFNB) (Fernández-Bellon et al., 2005). Abbinando i risultati della sierologia e dell’LST, Solano-Gallego e coll. (2005) hanno dimostrato che nelle aree altamente endemiche, cani infetti ma asintomatici, soprattutto se vivono all’aperto, mostrano un aumento della risposta immunitaria specifica nel corso del tempo, non solo di quella umorale ma anche di quella cellulare; inoltre, alcuni soggetti LST- positivi, vanno incontro anche a sieroconversione, probabilmente un anno dopo

101 _{Un ruolo fondamentale nello sviluppo della reazione è rivestito dalle cellule dendritiche (DCs), che}

vanno incontro a modificazioni ultrastrutturali, in seguito alla stimolazione antigenica, con up- regulation della sintesi e dell’espressione degli antigeni MHC-II (Sacchi et al., 2006).

102

PBS o soluzione salina di mertiolato. L’utilizzo di soluzioni contenenti thimerosal è rischioso, in quanto è stato dimostrato che, anche senza l’antigene, possono determinare delle reazioni sovrapponibili a quelle che si hanno in presenza di antigene (infiltrazioni infiammatorie costituite prevalentemente da macrofagi con grande citoplasma granulare, alcuni linfociti e neutrofili, associati a cellule necrotiche) (Paranhos-Silva et al., 2001).

103

Per quanto riguarda la leishmaniosi cutanea americana umana (L. braziliensis), è stato dimostrato che pazienti con LST negativo hanno un rischio 3,4 volte superiore di andare incontro a recidiva (Passos et al., 2000).

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l’infezione (nell’infezione sperimentale risulta invece che essa si realizza 2-3 mesi dopo). Questo può essere spiegato in vari modi, come la persistenza di una certa carica parassitaria che può determinare una continua stimolazione delle cellule T della memoria e quindi una protezione dalle reinfezioni. I soggetti asintomatici, comunque, rappresentano un insieme caratterizzato da un’ampia variabilità individuale, per quanto riguarda la risposta immunitaria, per cui appare difficile standardizzare i metodi diagnostici per valutarne il grado di protezione e la resistenza alla progressione della malattia nel tempo: Rodríguez-Cortés e coll. (2007) non hanno riscontrato alcuna correlazione tra i risultati dei test cellulari (LST, IFNB ed LPA104) ed i livelli di specifici isotipi anticorpali (IgG ed IgM), con l’esclusione della correlazione inversa tra i livelli di IgA e la risposta all’LPA. In generale, questa mancanza di correlazione o comunque un basso grado di correlazione, indica che nella maggior parte dei cani asintomatici non si realizza una netta polarizzazione della risposta immunitaria. Questi dati possono far ipotizzare che nei soggetti in cui si sviluppa una forte risposta cellulare, viene impedita la disseminazione del parassita.