Whole exome sequencing

Presso la Fondazione Pisana per la Scienza – ONLUS è stato condotto il sequenziamento di nuova generazione per la valutazione del profilo esomico dei campioni tumorali delle pazienti sottoposte a chemioterapia neoadiuvante e trastuzumab.

Il sequenziamento è stato condotto tramite sequenziatore Ion Proton (Ion Torrent, Life Technologies, Grand Island, NY) e i dati sono stati analizzati con supporti bioinformatici.

Tale analisi preliminare è stata eseguita su un totale di 4 pazienti. Queste pazienti sono state selezionate sulla base dello stadio di malattia, dello stato dei recettori ormonali, valutato con immunoistochimica, e dell’outcome clinico, inteso in termini di risposta patologica all’intervento. Sono stati selezionati pazienti con forme localmente avanzate di malattie e risultati negativi per i recettori ormonali. Sono stati analizzati 3 pazienti con risposta patologica completa (definita come assenza di residuo invasivo su mammella e/o su linfonodi con residuo non invasivo ammesso, cioè ypT0/is ypN0) (full responder, FR) di cui era disponibile il campione bioptico. E’ stato inoltre analizzato 1 paziente che non ha ottenuto risposta completa (partial responder, PR), confrontando il campione bioptico ottenuto prima della terapia (before therapy, bt) con quello ottenuto durante l’intervento chirurgico al termine della terapia (after therapy, at).

Lo studio, a carattere esplorativo, si è concentrato, almeno inizialmente, sull’individuazione di mutazioni puntiformi, inserzioni/delezioni, anche se tale tipo di sequenziamento potrà consentire in futuro di ricercare anche riarrangiamenti somatici e alterazioni del numero di copie geniche.

L’intero spettro mutazionale è stato dapprima valutato all’interno di ogni campione in termini di singole varianti e poi in termini di geni coinvolti; sono stati quindi confrontati i diversi esomi fra loro per individuare mutazioni comuni e mutazioni esclusive di singoli campioni. In particolare i 3 campioni full responder sono stati analizzati contemporaneamente e 2 di essi (quelli con maggiori somiglianze del profilo genomico)

85 sono stati messi in confronto con il campione del partial responder before therapy. Il campione del paziente partial responder before therapy è stato quindi confrontato con quello after therapy: dal momento che si tratta di un paziente non responsivo, nel caso le mutazioni aumentino di frequenza dopo la terapia, queste potrebbero ragionevolmente rappresentare un meccanismo di resistenza, nel caso invece che diminuiscano di frequenza, potrebbero essere predittive di risposta alla terapia. In questa seconda ipotesi, è ragionevole pensare che tali mutazioni possano ritrovarsi anche nei campioni full responder, i quali si sono rivelati appunto completamente sensibili al trattamento.

Dal momento che ogni tumore presenta decine di migliaia di mutazioni somatiche, i risultati ottenuti nei diversi campioni sono stati filtrati sulla base del coverage, cioè del numero di letture (reads) effettuate dal sequenziatore, e sulla base della qualità del processo. Inoltre si è scelto di mettere in luce soltanto le mutazioni missenso predette deleterie da Sift, quelle frameshit e quelle non-senso, escludendo ad esempio le mutazioni sinonime oltre che tutte quelle introniche. L’analisi bioinformatica ha permesso anche di verificare quali mutazioni fossero in realtà dei polimorfismi presenti nella popolazione. I dati grezzi sono stati di nuovo filtrati attingendo da database presenti in letteratura, come il Cosmic Database (catalogo online delle mutazioni somatiche presenti nei tumori) (134) e si è ulteriormente ristretto il campo andando a ricercare le cosiddette mutazioni driver del DriverDB (135), cioè quelle maggiormente coinvolte nella carcinogenesi. Infine, basandosi su un lavoro di Ahmad e coll. (136) che hanno elaborato l’Herceptin Resistance Database, si è deciso di valutare lo stato di alcuni biomarkers genici già identificati in pregressi studi come predittivi di resistenza a trastuzumab (es. PIK3CA, PTEN, TP53, MAP2K4, MAP3K e al.).

Nel primo campione full responder 7780, sono state individuate (con uno score di qualità >30) 28 mutazioni missenso predette deleterie all’interno di sequenze codificanti, selezionate in base al Cosmic Database. Tra queste sono rintracciabili varianti geniche di regolatori della trascrizione (ZNF717), del regolatore della conduttanza trans membrana

86 della fibrosi cistica (CFTR) e di un componente del complesso promotore dell’anafase APC/C (CDC27). Sono state inoltre rintracciate 2 mutazioni frameshit e 4 non-senso.

Sempre attingendo dallo stesso database e mantendo uno score di qualità del sequenziamento maggiore >30, nel secondo campione full responder 3434, sono state ritrovate 12 mutazioni missenso con alta probabilità di risultare deleterie, 1 mutazione frameshit e 2 non-senso.

Nel terzo campione full responder 6795 si è rivelata invece la presenza di 24 mutazioni missenso predette deleterie da Sift, 2 mutazioni frameshit e 5 non-senso (TABELLA 9).

Passando ai campioni del paziente parzialmente responsivo, 31 (24 missenso deleterie, 2 frameshit e 5 non-senso) e 33 mutazioni (27 missenso, 3 frameshit e 3 deleterie) sono state individuate nel campione before therapy 1466 e in quello after therapy 7090 rispettivamente (TABELLA 10).

Per confrontare i vari campioni tra loro, è stato utilizzato il software IonReporter™ (Life Technologies), utilizzabile via browser.

Le singole mutazioni riportate dai software di ricerca, sono state poi verificate sui dati grezzi per limitare eventuali errori del software di identificazione delle varianti geniche.

In merito al confronto tra i campioni dei pazienti full responder, complessivamente sono state raccolte 1488 varianti in comune ma considerando che tali varianti molto spesso si ritrovano all’interno dello stesso gene, si è verificato che le mutazioni condivise dai 3 campioni riguardano ben 4287 geni. Oltre a queste, il campione 7780 e quello 6795 condividono 2643 mutazioni, mentre il campione 3434 presenta 204 e 963 geni mutati in comune con il campione 7780 e 6795 rispettivamente (FIGURA 6). Da questi dati, il software ha estrapolato una maggior vicinanza del profilo esomico nei campioni 7780 e 6795, rispetto al campione 3434.

87 Quanto ottenuto è stato di nuovo filtrato sulla base dei dati presenti nel Cosmic Database ed è stata elaborata una heat-map contenente 5 geni in comune (in almeno 2 campioni su 3) contenenti mutazioni missenso (SENP6, ZNF106, DHDDS, PLCB4, ATAD5) e 7 geni con mutazioni frameshit o non-senso (ZNF717, LAMA2, MUC16, BIRC6, JAK2, KIF2A, APC) (FIGURA 7,8). Ad esempio, APC è un noto gene oncosopressore che agisce peraltro come mediatore della stabilizzazione ERBB2-dipendente dei microtubuli alla superficie cellulare, mentre JAK2 codifica per un recettore coinvolto in molti processi come lo sviluppo, la differenziazione e la crescita cellulare. In futuro sarà necessario, effettuando un confronto con i pazienti partial responder capire se queste mutazioni rappresentino dei comuni meccanismi di cancerogenesi oppure se possano indurre una maggiore sensibilità alla terapia.

Il profilo mutazionale del paziente partial responder before therapy è stato quindi confrontato con quello after therapy per verificare le eventuali variazioni avvenute durante la terapia e verificare, una volta esteso lo studio ad un numero più ampio di campioni, il ruolo dei singoli geni nella risposta alla terapia neoadiuvante con trastuzumab. Dal confronto con il Cosmic Database e con il Cancer Driver Database, è stato osservato per alcuni segmenti genici (esclusi i polimorfismi presenti nella popolazione con frequenza >10%) un incremento della frequenza dell’allele raro (SPTA1, HLA-DRB1, MTO, BIRC8). Per quanto riguarda i geni NOTCH2NL, TPTE, EYS e FUCA2 la mutazione è stata riscontrata in entrambi i campioni indifferentemente. Queste mutazioni potrebbero quindi rappresentare nuovi fattori di resistenza alla terapia, dal momento che sono assenti nei pazienti full responder. In particolare, NOTCH2NL sembra codificare per una componente della via del segnale di Notch, chiamato in causa in alcuni studi in vitro ipotizzando un suo ruolo nella mancata risposta a trastuzumab (137).

Viceversa, per altri geni è stato riscontrata una diminuzione della frequenza dell’allele raro (CEP350, KMT2C). In certi casi l’allele mutato è proprio scomparso nell’after therapy (es. FLG, SF3B1, FLNB, COL14A1, PLCE1, CDH1, NCOR1, MAP3K4, AHNAK, TLN1 e

88 EPS15, PRKDC, NBPF10, CACNA1E, NEB, RIMS1, SYNE1, AKAP9, NID1, PRKDC, RP1, KCNB2, GAD2, PLCE1, RRM1, CDH1, ZNF266, BCAS1). Per questi geni è quindi ipotizzabile un ruolo nella sensibilità a trastuzumab. Per confermare tale ipotesi si è andati a ricercare la presenza di queste varianti mutate anche nei full responder. Ad esempio è emersa dall’analisi una mutazione in comune sul gene NID-1, il quale codifica per una glicoproteina della membrana basale coinvolta nelle interazioni della cellula con la matrice extracellulare. Altre mutazioni interessanti in tal senso, cioè condivise dai campioni full e da quello partial ma assenti dopo la terapia, sono state ritrovate sui geni NBPF10, NEB, AHNAK e NCOR1. Il ruolo di tali varianti andrà pertanto rivalutato una volta ampliata la casistica a disposizione.

Analizzando infine solo le mutazioni ricavate dall’Herceptin Resistance Database, abbassando il quality score per aumentare la sensibilità della “detection” ed escludendo i polimorfismi, per due geni (MAP3K1, che codifica per una MAP-chinasi implicata nella cascata del segnale innescata da HER-2, e CD44) si è osservato un aumento della frequenza dell’allele raro dopo la terapia. E’ quindi ipotizzabile un loro ruolo nella resistenza alla terapia, anche se questi risultati potrebbero essere inficiati dalla numerosità del campione e dalla qualità di qualche processo di sequenziamento. Ad ogni modo, nel campione partial responder before therapy sono state evidenziate diverse mutazioni predette deleterie nei geni coinvolti nella resistenza alla terapia tra cui PIK3CA, MAP3K1, MET, CD44, RB1. La mutazione presente suPIK3CA peraltro permane anche dopo aver aumentato il quality score (>30) e il suo ruolo di fattore predittivo può essere ulterioremente avvalorato dal fatto che tale mutazione è invece assenti nei 2 campioni full responder analizzati (FIGURA 9).

89 gene tipo mutazione cambio aa global Allele Freq gene tipo mutazione cambio aa global Allele Freq gene tipo mutazione cambio aa global Allele Freq PDE4DIP MISSENSE D-13-G;D-84-G 0.70 FLVCR1 MISSENSE T-544-M 38.54 PDE4DIP MISSENSE D-13-G;D-84-G 0.70 OR14I1 MISSENSE Y-216-C 12.88 OR14I1 MISSENSE Y-216-C 12.88 ASPM MISSENSE L-1282-P 0.00 DFNB59 MISSENSE R-265-C 6.31 OR14I1 MISSENSE L-84-M 12.64 PREPL MISSENSE

R-226-C;R-137- C 0.01 ZNF717 MISSENSE L-829-P 0.00 ZNF717 MISSENSE G-587-S 0.00 ZNF717 MISSENSE Q-716-E 1.92 ZNF717 MISSENSE G-587-S 0.00 ZNF717 MISSENSE C-453-Y 0.00 ZNF717 MISSENSE G-587-S 0.00

ZNF717 MISSENSE C-453-Y 0.00 ZNF717 MISSENSE G-335-E 0.00

TMPRSS11 F;LOC5501

13 MISSENSE A-375-V 0.00 ZNF717 MISSENSE G-335-E 0.00 ATP13A5 MISSENSE S-96-Y 37.56 KIAA1109 MISSENSE R-3589-C 0.00 ZNF717 MISSENSE G-215-V 0.00 TLR3 MISSENSE L-412-F 22.10 FRG1 MISSENSE R-128-H 0.00 FRG1 MISSENSE R-128-H 0.00 GPR98 MISSENSE N-2345-S 30.04 KIF5B MISSENSE G-85-E 0.00 GPR98 MISSENSE N-2345-S 30.04 GIN1 MISSENSE T-239-M 25.70

LOC727924

;OR4M2 MISSENSE R-284-H 51.40 TMEM14B MISSENSE R-74-C;R-108-C 0.00 RAMP3 MISSENSE W-56-R 5.08 ATAD5 MISSENSE N-699-H 9.77 KIF13A MISSENSE S-186-F 0.00 MUC6 MISSENSE T-1911-M 0.00 CDC27 MISSENSE

S-378-N;S-384- N 0.00 FUCA2 MISSENSE H-371-Y 19.80 OR4C3 MISSENSE T-217-M 0.00 ZNF717 FRAMESHIFT L-578-ISN 0.00 SEMA3E MISSENSE

R-60-W;R-120-

W 0.00 GALNT8 MISSENSE V-515-F 37.71 VPS13C NONSENSE

R-3709-*;R- 3666-* 0.00 CFTR MISSENSE S-422-F 0.00 TAS2R7 MISSENSE M-304-I 8.67 GSDMB DISRUPT 33.93 OR56B4 MISSENSE A-269-V 0.00 TSPAN8 MISSENSE G-73-A 30.28 PIEZO2 NONSENSE R-2718-* 0.00 BEST3 MISSENSE Y-43-H 6.42 STRN3 MISSENSE

N-387-S;N-471- S 42.39 CAPS2 MISSENSE L-125-F 18.04 LOC727924 ;OR4M2 MISSENSE R-284-H 51.40 TTC8 MISSENSE A-391-T;A-431- T;A-421-T 0.00 WDR76 MISSENSE R-126-C;R-190- C 0.01 LOC727924

;OR4M2 MISSENSE M-239-V 25.92 HYDIN MISSENSE H-4270-Y 0.00 LOC727924

;OR4M2 MISSENSE R-284-H 51.40 CDC27 MISSENSE

Y-496-C;Y-502- C 0.00 CDC27 MISSENSE S-378-N;S-384- N 0.00 CDC27 MISSENSE S-378-N;S-384- N 0.00 EFCAB13 MISSENSE D-445-V;D-541- V 6.06 OR10H3 MISSENSE V-224-M 20.74 ANKRD62 MISSENSE A-188-S 52.93 RPS6KA6 MISSENSE E-66-K 0.00 CNDP2 MISSENSE Y-126-H 18.93 DNAH7 NONSENSE R-1289-* 0.00 ZNF99 MISSENSE E-673-K 8.14 ZNF717 FRAMESHIFT L-578-ISN 0.00 RFPL3;RF PL3S MISSENSE S-234-G;S-263- G 0.00 ZNF717;MIR4273NONSENSE C-428-* 0.00 RFPL3;RF PL3S MISSENSE R-251-C;R-280- C 0.00 ZNF717 FRAMESHIFT S-321-KL 0.00 ZNF717 FRAMESHIFT L-578-ISN 0.00 ZNF717 NONSENSE S-249-* 0.00 ZNF717 NONSENSE S-249-* 0.00 CPE DISRUPT 0.00 KMT2C FRAMESHIFT Y-816-*H 0.00 OR6C74 NONSENSE R-62-* 26.54 EFCAB13 NONSENSE Y-450-*;Y-546-* 4.21 TP53 DISRUPT 0.00 TXNL1 NONSENSE R-83-* 0.00 GSDMB DISRUPT 33.93 TPTE NONSENSE

R-191-*;R-211-

*;R-229-* 0.00 TPTE NONSENSE R-191-*;R-211-*;R-229-*0.00 Full responder 7780 Full responder 6795

TABELLA 9. Geni mutati nei pazienti full responder (Database Cosmic)

90 gene tipo mutazione cambio aa global Allele Freq gene tipo mutazione cambio aa global Allele Freq IPP MISSENSE K-264-R 28.20 OR10J1 MISSENSE I-103-M 57.18

C8B MISSENSE

S-347-F;S-399-

F;S-337-F 0.00 CAPN2 MISSENSE

K-490-Q;K-568-

Q 20.57

LYST MISSENSE A-3344-T 0.00 ZNF717 MISSENSE L-829-P 0.00 ZNF717 MISSENSE T-807-S 0.00 ZNF717 MISSENSE T-807-S 0.00 ZNF717 MISSENSE C-791-S 0.00 ZNF717 MISSENSE G-587-S 0.00 ZNF717 MISSENSE L-696-H 0.00 ZNF717 MISSENSE G-335-E 0.00 ZNF717 MISSENSE G-587-S 0.00 ZNF717 MISSENSE G-215-V 0.00 ZNF717 MISSENSE G-457-R 0.00 ZNF717 MISSENSE V-50-M 25.73 ZNF717 MISSENSE C-453-Y 0.00 ZNF717 MISSENSE V-29-L 0.00 AADACL2 MISSENSE R-92-Q 0.01 OTOP1 MISSENSE P-592-A 0.00 FGF2;NUD

T6 MISSENSE

R-209-Q;R-40-

Q 14.89 EYS MISSENSE E-641-V 15.90

IQGAP2;F2

RL2 MISSENSE V-174-I;V-196-I 0.02 FUCA2 MISSENSE H-371-Y 19.80 GIN1 MISSENSE T-239-M 25.70 MACC1 MISSENSE R-804-T 53.84 EYS MISSENSE E-641-V 15.90 COL14A1 MISSENSE N-563-H 52.39 FUCA2 MISSENSE H-371-Y 19.80 CTBP2 MISSENSE

N-789-K;N-249- K 0.00 ETV1 MISSENSE Y-289-H;Y-271- H;Y-226-H;Y- 329-H;Y-306- H;Y-311-H 0.00 CTBP2 MISSENSE H-788-L;H-248- L 0.00 PSPH MISSENSE R-49-W 0.00 CTBP2 MISSENSE V-763-M;V-223- M 0.00 TMEM67 MISSENSE S-845-F;S-926- F 0.00 MAP2K3 MISSENSE R-94-L;R-65-L 50.00 EHMT1 MISSENSE P-809-L 0.00 KCNJ12 MISSENSE E-139-K 0.00 KIF20B MISSENSE R-1577-Q 0.00 KCNJ12 MISSENSE R-261-H 0.00 ZDHHC5 MISSENSE R-215-H 0.00 KCNJ12 MISSENSE I-262-S 0.00 OR4D6 MISSENSE M-59-V 18.83 KCNJ12 MISSENSE S-343-L 0.00 ATP6V0A2 MISSENSE S-177-F 0.00 NPEPPS MISSENSE F-433-C 0.00 SYNE2 MISSENSE I-574-T 8.62 ZNF30 MISSENSE S-24-F 29.97 NOTCH2NL NONSENSE R-74-* 1.03 SIRPB1 MISSENSE I-229-M 82.32 ZNF717;MI R4273 NONSENSE C-428-* 0.00 RFPL3;RF PL3S MISSENSE S-234-G;S-263- G 0.00 ZNF717 FRAMESHIFT S-321-KL 0.00 RFPL3;RF PL3S MISSENSE R-251-C;R-280- C 0.00

TRDN NONSENSE E-333-*;E-334-* 0.00 NOTCH2NL NONSENSE R-74-* 1.03 PCLO NONSENSE R-4461-* 0.00 ZNF717 FRAMESHIFT L-578-ISN 0.00 OR7G3 FRAMESHIFT S-310-YHL 39.88 ZNF717 NONSENSE S-249-* 0.00

TPTE NONSENSE R-191-*;R-211- *;R-229-* 0.00 KMT2C FRAMESHIFT Y-816-*H 0.00 MROH8;RP N2 FRAMESHIFT S-32- SAGRGALSIR V 0.00 TPTE NONSENSE R-191-*;R-211- *;R-229-* 0.00 Partial responder BT 1466 Partial responder AT 7090

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FIGURA 6. Geni mutati totali in comune nei pazienti full responder

FIGURA 7. Mutazioni missenso deleterie in comune nei pazienti full responder (Database Cosmic)

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FIGURA 8. Mutazioni frameshit e nonsenso in comune nei pazienti full responder (Database Cosmic)

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FIGURA 9. Mutazioni in comune e non fra 2 campioni full responder e il campione partial responder before therapy (Database Herceptin Resistance)

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