1 UNIVERSITA' DI PISA
DIPARTIMENTO DI SCIENZE VETERINARIE
Corso di Laurea Magistrale in
SCIENZE E TECNOLOGIE DELLE PRODUZIONI ANIMALI
TESI DI LAUREA
Isolamento e tipizzazione di Salmonella spp. da prodotti alimentari
ready-to-cook a base di carne di avicoli
Candidato: Relatore:
Priami Veronica Prof. Cerri Domenico
Correlatore:
Dott. Fabrizio Bertelloni
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“Non smettere mai di correre verso un traguardo,
non smettere di essere te stesso,
lotta sempre per ciò che desideri.
Vivi per la tua vita,
ama chi ti ama e aiuta quando puoi,
sogna sempre mete impossibili,
regalati in ogni istante attimi di vita eterna
e in tutto questo immenso vivere racchiudi la magia dell’amore.”
Madre Teresa di Calcutta
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INDICE
RIASSUNTO………5 ABSTRACT………..5 1. INTRODUZIONE………....……..6 2. IL MICRORGANISMO: SALMONELLA SPP………..72.1 ALCUNE OSSERVAZIONI SULL’ECOLOGIA E SULL’EZIOLOGIA DELLE SALMONELLE………7
2.2 TASSONOMIA: CLASSIFICAZIONE DELLE SALMONELLE……….…….10
2.2.1 Classificazione secondo Kauffmann-White………12
2.2.2 Classificazione secondo Le Minor……….12
2.3 CARATTERISTICHE MICROBIOLOGICHE……….13
2.3.1 Caratteristiche colturali………13
2.3.2 Caratteristiche biochimiche………..17
2.3.3 Caratteristiche antigeniche………18
2.4 MECCANISMO DI INFEZIONE E PATOGENESI………..……..19
2.4.1 Meccanismo patogenetico……….………22
2.4.2 Adesione e invasività……….……….23
2.4.3 Resistenza alla fagocitosi……….………24
2.5 CARATTERI DELLA MALATTIA NELL’UOMO……….25
2.6 CARATTERI DELLA MALATTIA NEGLI ANIMALI………..………26
2.7 EPIDEMIOLOGIA……….33
2.7.1 Serbatoi animali……….34
2.7.2 Alimenti………34
2.7.3 Ambiente………...37
2.8 DIAGNOSI………..……….38
2.8.1 Ricerca di Salmonella a partire da alimenti………..………..……..38
2.8.2 Ricerca di Salmonella in allevamento……….………39
2.9 PROFILASSI……….44
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3. SCOPO DELLA TESI……….……….48
4. MATERIALI E METODI………..50
4.1 CAMPIONAMENTO………..50
4.2 ISOLAMENTO………51
4.3 PROVE BIOCHIMICHE DI CONFERMA………..………54
4.4 TIPIZZAZIONE SIEROLOGICA………..…56
4.5 TIPIZZAZIONE BIOMOLECOLARE MEDIANTE PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis)………..58
5. RISULTATI E DISCUSSIONE………..……….60
6. CONCLUSIONI……….66
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RIASSUNTO
Lo scopo di questa tesi è stato quello di ricercare microrganismi appartenenti al genere Salmonella in prodotti alimentari a base di carni avicole ready-to-cook acquistati presso la Grande Distribuzione in Toscana. Sugli isolati sono stati effettuati test biochimici e test sierologici. Da 4 (5,19%) dei 77 campioni analizzati sono stati isolati 7 ceppi di Salmonella. Su questi è stata eseguita la tipizzazione biomolecolare con PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis). L’utilizzo della PFGE ha consentito di differenziare ceppi appartenenti allo stesso sierotipo. Questa tecnica ha fornito importanti informazioni epidemiologiche. Per quanto riguarda i risultati, gli isolati sono riconducibili a: S. ser. Newport, S. ser. Typhimurium e S. ser. Infantis. Dalle analisi genomiche è risultato che due ceppi di S. ser. Newport, isolati da campioni diversi provenienti però dallo stesso punto vendita, erano identici. Inoltre, confrontando gli isolati ottenuti in questo studio con salmonelle isolate in anni precedenti da simili matrici alimentari, è stato possibile individuare alcuni ceppi tipici della filiera avicola.
ABSTRACT
The aim of this thesis was to detect microorganisms belonging to the genus
Salmonella in ready-to-cook poultry meat products purchased at large retailers in
Tuscany. Biochemical tests and serological tests were performed on the isolates. From 4 out of 77 (5.19%) samples analyzed, 7 isolates of Salmonella have been recovered. Molecular typing was performed by Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE). The use of PFGE allowed to differentiate isolates belonging to the same serotype. This technique provided important epidemiological information. As for the results, the isolates belonged to S. ser. Newport, S. ser. Typhimurium and S. ser. Infantis. From the genomic analysis, we found that two isolates of S. ser. Newport, from different samples from the same retailer, were clonal. Furthermore, comparing the isolates obtained in this study with other isolated in previous years from similar food matrices, it was possible to identify some serotypes typical of the poultry industry.
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1. INTRODUZIONE
Nel 1884 Georg Theodor August Gaffky isolò per la prima volta l’agente eziologico del tifo sospettando che appartenesse ad un gruppo di batteri in grado di causare forme enteriche sia nell’uomo che negli animali. Un paio di anni più tardi Daniel E. Salmon e Theobald Smith confermarono quell’ipotesi isolando dai suini un microrganismo oggi noto come S. ser. Choleraesuis.
Le salmonelle sono microrganismi patogeni di origine zoonosica che riconoscono uno specifico ospite (sierotipo specie-specifici) o ospiti diversi (sierotipo adattati o ubiquitari). I sierotipi specie-specifici causano in genere forme sistemiche di malattia nella specie bersaglio; i sierotipi ospite-adattati sono così definiti poichè prediligono un particolare ospite animale ma possono infettare più specie animali e l’uomo e indurre malattia e infine i sierotipi ubiquitari provocano spesso infezioni inapparenti negli animali mentre nell’uomo sono responsabili di infezioni gastroenteriche, di solito acquisite attraverso l’ingestione di alimenti contaminati. Per i sierotipi di
Salmonella spp. a diffusione ubiquitaria il serbatoio di infezione è rappresentato da
animali di varie specie; l’uomo acquisisce l’infezione attraverso alimenti come carne, prodotti caseari e uova, che possono essere contaminati fin dall’origine oppure in seguito, nel corso delle diverse fasi di preparazione e conservazione. Le salmonelle sono, con i Campylobacter, i principali agenti di malattia a trasmissione alimentare nell’uomo, e il loro impatto sulla salute pubblica si mantiene costante nonostante interventi e politica di sicurezza alimentare volti a ridurre il rischio di infezione (Rapporti ISTISAN 05/27).
In questo lavoro verranno descritti i principali caratteri biochimici e microbiologici, la tassonomia delle salmonelle, le principali caratteristiche della malattia nell’uomo e negli animali e la loro epidemiologia, ma soprattutto le metodiche di isolamento e tipizzazione da prodotti alimentari ready-to-cook a base di carne di avicoli.
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2. IL MICRORGANISMO: SALMONELLA SPP.
2.1 ALCUNE OSSERVAZIONI SULL’ECOLOGIA E SULL’EZIOLOGIA
DELLE SALMONELLE
Da anni è universalmente accettato che le salmonelle (Fig. 1) sono ubiquitarie.
Alcune pubblicazioni, divenute storiche, come quella di Drager intitolata “Salmonellosen” del 1971, hanno ampiamente convalidato, con abbondanza di dati, questa affermazione.
Negli Stati Uniti, nel periodo 1971-78 le salmonelle sono state ritenute responsabili del 40% dei casi di tossinfezione alimentare. Secondo vari autori, il numero di persone colpite annualmente negli Stati Uniti è stimabile in circa 2.000 soggetti su 100.000 abitanti e si giudica che l’1% degli
americani sia portatore sano di salmonelle. In Europa la situazione sarebbe migliore, se si considerano reali le statistiche pubblicate in alcuni stati, dove figurano le seguenti proporzioni di persone affette da salmonellosi ogni 100.000 abitanti: Danimarca 10, Finlandia 44, Svezia 43, Gran Bretagna 46, Germania 83, Svizzera 4, Italia 20.
La notevole incidenza di casi è comunque aggravata dal fatto che gli individui possono eliminare saltuariamente le salmonelle con le feci, da poche settimane fino a due-tre mesi dopo la risoluzione della malattia clinica, in concentrazioni variabili fra poche unità e alcuni milioni di cellule batteriche per grammo di materiale fecale (Zavanella M., 2001).
La salmonellosi è una malattia contagiosa, a decorso acuto, subacuto o cronico, propria di svariate specie animali domestiche e selvatiche, per lo più caratterizzata da processi infiammatori a carico dell’apparato digerente, ma non raramente causa di quadri anatomo-clinici diversi (aborti, forme setticemiche, broncopolmoniti, meningoencefaliti, mastiti, linfadeniti, ecc.) (Andreani E. et all., 2002).
8 La salmonellosi è una tipica zoonosi e nonostante i vari sierotipi di Salmonella possano infettare ospiti diversi, attualmente si ritiene che alcuni sierotipi abbiano una particolare predilezione per ospiti specifici.
Vengono chiamate “ospite-ristrette” le salmonelle S. ser. Typhi, S. ser. Paratyphi A,
S. ser. Paratyphi C, S. ser. Sendai per l’uomo, S. ser. Abortus ovis per gli ovini, S. ser.
Typhi suis per i suini, S. ser. Abortus equi per gli equini, S. ser. Gallinarum e S. ser. Pullorum per i volatili.
Altre salmonelle vengono definite “ospite-adattate” (S. ser. Choleraesuis per suini ed uomo, S. ser. Dublin per bovini, ovini ed uomo).
Contrariamente a quanto si crede comunemente, da ogni categoria di ospiti viene isolato puntualmente un numero ristretto di sierotipi di salmonella, di gran lunga inferiore all’impressionante varietà esistente in natura (circa 2500 sierotipi) (Zavanella M., 2001).
Ad esempio, da una statistica riguardante i ceppi umani isolati in un anno in Italia (PHLS, 1999) si osserva la situazione seguente tabella (Tab. 1):
Tabella 1 Sierotipi più frequenti nell'uomo (Zavanella M., 2001)
Analogamente, una statistica pubblicata nel Minnesota (Carlson A. R., et all., 2001) relativa alle salmonelle nei suini, mostra il quadro qui riportato (Tab. 2):
9 Tabella 2 Sierotipi più frequenti nei suini (Zavanella M., 2001)
Si ritiene inoltre che la maggior parte dei sierotipi sia in grado di adattarsi all’intestino di più ospiti. Tuttavia si ritiene che i sierotipi appartenenti alle sottospecie II, IIIa, IIIb e IV sono frequenti soprattutto in animali a sangue freddo. Nell’ambiente esterno, le salmonelle possono non solo resistere per parecchio tempo, ma anche moltiplicarsi, quando le condizioni ambientali (essenzialmente temperatura, umidità, presenza di proteine) sono favorevoli.
In questo modo si spiega l’instaurarsi di un vero e proprio ciclo di diffusione (Fig. 2), che porta alla contaminazione delle fonti alimentari principali per l’uomo (carni, latte, uova, vegetali, acqua).
Figura 2 Vie di trasmissione delle salmonelle (Zavanella M., 2001)
Con il termine “salmonellosi” si intende un insieme di manifestazioni morbose causate da Salmonella spp., batteri normalmente presenti nell'apparato
10 gastrointestinale dell’uomo e di molti animali. Sono oltre duemila le specie di
Salmonella che possono ritrovarsi nel tratto intestinale sia come commensali sia
come patogeni. Alcune salmonelle (per es. S. ser. Typhi, S. ser. Paratyphi, responsabili della febbre tifoide e delle febbri enteriche in genere) sono a circolazione esclusivamente umana, mentre altre (S. ser. Typhimurium) responsabili delle salmonellosi a prevalente manifestazione gastroenteritica, hanno uno spettro di ospiti più largo, che include numerose specie animali oltre all’uomo (Zavanella M., 2001).
2.2 TASSONOMIA: CLASSIFICAZIONE DELLE SALMONELLE
Il genere Salmonella appartiene alla famiglia delle Enterobatteriaceae, microrganismi bastoncellari, Gram negativi, asporigeni, generalmente mobili per la presenza di flagelli peritrichi, aerobi-anaerobi facoltativi, catalasi positivi, ossidasi negativi, prevalentemente lattosio non fermentanti e indolo negativi che crescono sui comuni terreni anche in presenza di sali biliari.
La famiglia delle Enterobatteriaceae comprende numerosi generi di interesse sanitario come Escherichia, Shigella, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter e molti altri. La loro identificazione, come evidenziato nella tabella in Tab. 3, è possibile in base ad una serie di caratteri biochimici come la capacità di utilizzare particolari substrati, presenza di particolari enzimi, produzione di specifici prodotti metabolici e la loro capacità di fermentare particolari zuccheri.
11 All’interno del genere Salmonella esiste un gran numero di sierotipi, distinti sulla base della diversa composizione degli antigeni somatici e flagellari e talvolta anche in base ad alcuni caratteri biochimici.
Dai primi isolamenti ad oggi la classificazione del genere Salmonella è stata più volte profondamente rimaneggiata. Se inizialmente i ceppi di Salmonella isolati da diverse forme cliniche o da diversi ospiti venivano considerati come specie distinte, lo studio degli antigeni somatici (O) e flagellari (H), iniziato da White e portato avanti da Kauffmann, portò alla descrizione di un enorme numero di sierotipi che sostituirono, nella nomenclatura, le specie precedentemente identificate.
Le classificazioni delle salmonelle sono tante ma tra queste quelle più conosciute e utilizzate sono quella di Kauffmann-White, per quanto riguarda la tipizzazione in base al sierotipo e quella di Le Minor per quanto riguarda la suddivisione in sottospecie.
Il genere Salmonella è distinto in due sole specie, S. enterica e S. bongori. La specie
enterica è a sua volta suddivisa in sei sottospecie: enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae, indica. Oggi si conoscono più di 2500 sierotipi della specie enterica, e il sierotipo non è più identificativo di specie pertanto la nomenclatura
non la riporta più in corsivo; peraltro i nomi sono mantenuti solamente per i sierotipi appartenenti a S. enterica sub. enterica (es S. ser. Typhimurium), mentre quelli ascrivibili alle altre sottospecie vengono identificati attraverso le relative formule antigeniche.
L’attuale classificazione che deriva da quelle di Kauffmann-White e quella di Le Minor, riflette la presente tassonomia delle salmonelle ed è soggetta ad aggiornamenti annuali curati dal “WHO Collaborating Centre for Reference and
Research on Salmonella” con cui collaborano vari laboratori di riferimento
internazionali (Graziani C. et all., 2005).
2.2.1 Classificazione secondo Kauffmann-White
Kauffmann nel 1931 presentò lo schema di classificazione delle salmonelle, in uso fino ai nostri giorni e universalmente accettato, in base al mosaico di antigeni. In realtà egli riscrisse, ampliandolo, uno schema precedente elaborato da Schultze, White e Scott. Lo schema si basa sul fatto che:
– il genere è rappresentato da bastoncelli gram-negativi, aerobi, non sporigeni, per lo più mobili (provvisti cioè di flagelli peritrichi, di composizione proteica), che crescono bene sui comuni terreni, fermentano il glucosio e riducono i nitrati e non l’indolo, non idrolizzano l’urea, l’adonite, e non fermentano il saccarosio; con alcune eccezioni, non fermentano il lattosio;
– esistono 4 sottogeneri (denominati I, II, III, IV) differenziabili in base a poche prove biochimiche (Tab. 4), come indicato dallo schema di Kauffmann del 1966; al genere I appartengono tutte le salmonelle con le classiche caratteristiche; al
sub-12 genere II appartengono le salmonelle gelatinasi +, malonato +, dulcitolo +; al sub-genere III appartengono le salmonelle dulcitolo + e con ß-galattosidasi; infine nel IV gruppo troviamo le salmonelle dulcitolo -;
– i ceppi con la medesima formula antigenica, anche se con differenze biochimiche (ad esempio, fermentare o meno un certo zucchero oppure produrre e non produrre H2S) appartengono allo stesso sierotipo (Kauffmann, 1967).
Tabella 4 Test biochimici per la suddivisione del genere Salmonella (Rapporti ISTISAN 05/27)
2.2.2 Classificazione secondo Le Minor
Studiando il genoma, Le Minor stabilì che esistevano due specie di salmonella, con circa 2500 sierotipi: S. enterica e S. bongori. La S. enterica comprendeva 6 subspecie, come visto in precedenza. Le sei sottospecie di S. enterica sono distinguibili in base alle prove biochimiche, sotto elencate (Tabella 3) e che consentono anche di differenziare S. enterica da S. bongori. I sierotipi di S. enterica sub. enterica sono spesso indicati con un nome che usualmente è correlato al luogo geografico nel quale il sierotipo è stato per la prima volta isolato. Il nome viene scritto in lettere romane e la prima lettera è maiuscola. I sierotipi appartenenti alle altre sottospecie sono designati dalle loro formule antigeniche, seguite dal nome della sottospecie (Tab. 5) come indicato da Le Minor (Le Minor L. et all., 1987).
13 Tabella 5 Classificazione delle salmonelle (Rapporti ISTISAN 05/27)
2.3 CARATTERISTICHE MICROBIOLOGICHE
2.3.1 Caratteristiche colturali
Numerose tecniche sono state messe a punto per il rilievo di salmonella negli alimenti. Viene, però, indicato come unico metodo validato il protocollo d’analisi riportato nella procedura ISO 6579:2002+Co1:2004, che descrive un metodo orizzontale per la ricerca di Salmonella spp. in alimenti destinati al consumo umano e zootecnico. Il metodo colturale classico per la determinazione di Salmonella negli alimenti necessita, però, di tempi piuttosto lunghi ed è quindi sempre più sentita l’esigenza di avere a disposizione dei metodi rapidi e sensibili, al fine di realizzare programmi di monitoraggio più tempestivi ed efficaci.
Per soddisfare queste esigenze, in questi ultimi anni è stato sviluppato un grande numero di metodi diagnostici alternativi, quali:
• Agglutinazione al lattice
• Immunofluorescenza (FA)
• Conduttanza/Impedenza
14 • Isolamento in terreno semi-solido (MSRV)
• Enzyme Linked Fluorescent Assay (ELFA)
• Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA)
• Polymerase Chain Reaction (PCR)
• Real time-PCR
Queste sono tecniche che consentono di riconoscere la presenza di salmonelle direttamente nel campione in esame o dopo semina del campione in un terreno liquido (fase di pre-arricchimento o di arricchimento). Il riconoscimento di
Salmonella avviene a livello di genere, per cui si arriva all’identificazione del
microrganismo ricercato.
Per quanto riguarda la metodologia di coltivazione classica, le salmonelle crescono facilmente su terreni sintetici. Nei terreni liquidi
(Brodo nutritivo, Trypticase Soy Broth, Brain
Heart Infusion, ecc.) (Fig. 3) sviluppano con
intorbidamento uniforme, raggiungendo dopo 18-24 ore d’incubazione a +37 °C una concentrazione di circa 10 9 batteri per ml.
Anche nei terreni liquidi d’arricchimento (Brodo selenito, Rappaport Vassiliadis, Muller Kauffmann, ecc.) il grado di sviluppo è buono,
seppure leggermente inferiore o uguale a quello ottenibile in brodi non selettivi (108/109
germi per ml dopo 24 ore a +37 °C).
Figura 3 Trypticase soy broth (www.fishersci.com)
15 Su terreni solidi non selettivi, seminati in piastre Petri, si osservano, dopo incubazione a +37 °C per 24 ore, colonie rotonde, del diametro di 2-3 mm, a margine netto, convesse, incolori, generalmente a superficie liscia, lucente (fase S) e raramente a superficie opaca e ruvida (fase R). Questi aspetti corrispondono a una variazione reversibile chiamata liscia/ruvida o smooth/rough. In provetta, sui medesimi terreni “a becco di clarino” seminati sulla parte inclinata (slant), la crescita si presenta sotto forma di una patina omogenea,
translucida, di consistenza cremosa e raramente con tendenza ad assumere un aspetto “filante”, se prelevata con l’ansa. In quest’ultimo caso è difficile allestire sospensioni acquose (ad es. in soluzione fisiologica) o nei sieri diagnostici agglutinanti. Questo aspetto corrisponde ad una variazione reversibile chiamata mucoide/non mucoide.
Fra i terreni selettivi, dove le colonie vengono coltivate dopo i terreni di arricchimento, ricordiamo i più utilizzati:
XLD (= Xylose-Lysine-Desoxycholate Agar), terreno di colore rosso dove le colonie di salmonelle crescono di colore nero (Fig. 4);
BGA (= Brillant Green Agar) è un terreno di colore verde sporco che può virare a seconda della crescita dei microrganismi: vira al fucsia se vi è presenza di salmonelle e Proteus, dove le salmonelle crescono con colonie bianche e grandi, mentre il Proteus cresce con colonie piccole e fucsia;
SS (= Salmonella Shigella Agar) è un terreno di colore rosa in cui la salmonella può crescere in due differenti modi: con colonie piccole, brillanti, traslucide, ben definite e gialle oppure con colonie piccole, brillanti con un punto nero al centro per la produzione di idrogeno solforato;
Hektoen Enteric Agar è un terreno nel quale le colonie di salmonella crescono di color salmone.
I terreni differenziali, successivi ai precedenti, contengono sostanze indicatrici di particolari reazioni biochimiche che avvengono nel terreno stesso. Tra questi ricordiamo: TSI (=Triple Sugar Iron Agar), un terreno contenente tre zuccheri (lattosio, glucosio, saccarosio) e Kligler Iron Agar, contenente solo lattosio e glucosio. Entrambi i terreni contengono al loro interno ferro e sono rossi.
Figura 4 Salmonella spp. su XLD (pinterest.com)
16 Dalla piastra del terreno selettivo prelevo la colonia con l’ago e la vado a seminare per striscio e per infissione su uno di questi terreni fatti a becco di clarino. In provette di Triple Sugar Iron Agar (TSI) le salmonelle crescono in genere abbondantemente, mostrando uno slant alcalino (rosso) e un fondo acido (giallo), mascherato dalla formazione di solfuro di ferro (reazione H2S positiva),
accompagnato spesso dalla formazione di bolle di gas, originate dalla fermentazione del glucosio (Fig. 5) (Kauffmann F., 1966).
Figura 5 semina per infissione e striscio e crescita delle salmonelle su TSI (http://learn.chm.msu.edu)
Con l’Urea Broth Base (terreno di Christensen) si può evidenziare l’attivita' ureasica delle Enterobacteriaceae mediante viraggio di un indicatore di pH (rosso fenolo). In particolare questo terreno viene utilizzato per discriminare Salmonella spp. da
Proteus spp.: se il terreno resta del suo colore originario è possibile che vi sia
presenza di salmonelle, se vira al fucsia vuol dire che l’urea è stata metabolizzata da un enzima ed ha rilasciato ammoniaca. Il Proteus infatti produce ureasi, la salmonella no (Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Centre for Infections, 2008) (Fig. 6).
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2.3.2 Caratteristiche biochimiche
Il tipico profilo biochimico del genere Salmonella è evidenziato nella Tab. 6:
Tabella 6 Profilobiochimico del genere Salmonella (Rapporti ISTISAN 05/27)
È importante ricordare che esistono a livello di specie e di ceppo numerose varianti al profilo biochimico sopra riportato (Barbour E.K. et all., 1984) (Tab. 7):
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2.3.3 Caratteristiche antigeniche
La cellula batterica di una salmonella possiede numerosi antigeni (Fig. 7) e tra questi quelli più conosciuti sono gli antigeni somatici (O), termostabili e resistenti all’azione di acidi e alcool, gli antigeni flagellari (H) termolabili e l’antigene Vi (da virulenza).
L’antigene O è presente sulla membrana esterna della cellula batterica, associato a molecole di lipopolisaccaride (LPS) ed è formato da due parti: la prima, più interna, è composta da cinque carboidrati ed è comune
a tutti gli enterobatteri; la seconda, più esterna, è formata da catene saccaridiche, ciascuna delle quali contiene una sequenza di alcuni oligosaccaridi. Dal differente posizionamento degli oligosaccaridi nelle catene dipende la diversità degli antigeni somatici. Attualmente si conoscono 65 diversi antigeni O identificati con numeri arabi. Le salmonelle che presentano analogie nella struttura dell’antigene O vengono comunemente e per convenzione riunite in sierogruppi (A, B, C) (Pontello M., 1991).
Nelle specie mobili di Salmonella (Fig. 8) (sono eccezioni S. ser. Gallinarum e S. ser. Pullorum che non sono mobili) sono presenti gli antigeni flagellari o ciliari, meglio conosciuti come antigeni H, indicati con lettere minuscole dell’alfabeto o con numeri. Oggi se ne conoscono circa 35, sono di natura proteica, vengono distrutti dal calore e possono presentarsi in due fasi, chiamate fase 1 e fase 2 (Duguid J. P. et
all., 1966). Gli antigeni di fase 1 e 2 possono presentarsi contemporaneamente al
momento delle prove di agglutinazione. Spesso però una salmonella bifasica sviluppa solo una delle due fasi e per completare la tipizzazione è necessario indurre l’inversione di fase (inibizione della fase identificata), in modo da far esprimere al germe anche la fase latente. Alcuni sierotipi di salmonella, chiamati monofasici, possiedono generalmente antigeni di fase, come nel caso di S. ser. Enteritidis. Pochissime specie hanno 3 fasi sierologiche H e sono dette “trifasiche” (Heather C. e Coll, 1965). Raramente le salmonelle possono perdere la struttura antigenica H, diventando immobili (Grunenwald R. et all., 1990).
Alcune salmonelle presentano anche un terzo tipo di antigene, chiamato Vi (da virulenza), e gli stipiti che lo possiedono risultano essere più virulenti (S. ser. Typhi,
S. ser. Paratyphi C, S. ser. Dublin). Esso ha la caratteristica di mascherare gli antigeni
O, rendendoli inagglutinabili dai sieri somatici, per cui è necessario in questi casi riscaldare a 100 °C per 1 ora la sospensione batterica per renderla nuovamente agglutinabile. L’antigene Vi delle salmonelle corrisponde agli antigeni K (capsulari) degli altri enterobatteri (Le Minor, 1964).
19 Figura 7 antigeni della salmonella (www.medicina360.com)
2.4 MECCANISMO DI INFEZIONE E PATOGENESI
La patogenesi delle infezioni da
Salmonella è un fenomeno
complesso e multifattoriale. Le cellule batteriche ingerite subiscono nello stomaco una prima riduzione a causa del PH acido che non consente la loro moltiplicazione. Tuttavia, i plasmidi che codificano per la resistenza all’acidità permettono il passaggio delle salmonelle verso l’intestino. Dopo aver superato lo stomaco, le salmonelle arrivano nel duodeno dove dimostrano la
loro capacità di resistere sia alla presenza della bile, che ha attività batteriostatica, sia ai succhi pancreatici.
All’interno del digiuno e dell’ileo avviene la prima fase d’azione: la colonizzazione. Attraverso i loro flagelli invadono i villi e penetrano nelle cellule per contiguità fino ad arrivare nell’intima (capillari).
A questo punto inizia la seconda fase d’azione: la moltiplicazione.
20 Le salmonelle si moltiplicano e stimolano la migrazione transepiteliale dei leucociti polimorfonucleati (PMN), con induzione di diarrea, e possono invadere gli organi (fegato, colecisti, linfonodi meseraici, milza, intestino) attraverso il torrente entero-epatico, provocando fenomeni generalizzati accompagnati da alterazioni patologiche (Alford J. A. et all., 1969).
La loro entrata in circolo è inoltre favorita dalla vasodilatazione che scatenano le endotossine rilasciate al momento della morte di alcune salmonelle stesse.
In soggetti molto giovani o immunocompromessi l’infezione può propagarsi dall’intestino e divenire sistemica, dove le salmonelle, fagocitate dai macrofagi, vengono trasportate a livello di cervello, polmoni, cuore, meningi, articolazioni e utero. La patogenesi della setticemia è strettamente correlata agli effetti indotti dall’endotossina, identificabile nella componente lipidica del polisaccaride di parete. Tale componente è responsabile di febbre, emorragie associate a carenza di fattori della coagulazione, leucopenia e leucocitosi, ipotensione e shock spesso fatale, diminuzione del glicogeno epatico e quindi ipoglicemia (Andreani E. et all., 2002). Il processo flogistico generato sfocia nella liberazione di prostaglandine che inibiscono la trasformazione dell’adenilato ciclasi in ATP. L’eccesso di adenilato ciclasi provoca un eccesso di ioni cloruri e ioni carbonato a livello intestinale che richiamano acqua.
Il risultato è la manifestazione di diarrea profusa, maleodorante e tal volta con tracce di sangue.
Negli animali le salmonelle difficilmente oltrepassano la barriera dei linfonodi meseraici e solo in conseguenza di errori durante la macellazione (ad esempio, la rottura dell’intestino) possono contaminare la superficie delle carni.
Le salmonelle possiedono diversi fattori di virulenza, necessari ad attuare tutte le varie fasi dell’infezione: sistemi di difesa che permettono la sopravvivenza in ambienti a pH acido, utili per superare la barriera gastrica; fattori che intervengono al momento della colonizzazione dell’intestino, permettendo al batterio di aderire efficacemente alle cellule del lume intestinale; fattori che consentono di attraversare l’epitelio intestinale a livello delle placche di Peyer o di sopravvivere nei macrofagi (enzimi PhoP e PhoQ) (Fig. 9) essendo intracellulari-facoltative. (Andreoni O. et all., 1993).
Le salmonelle sono in grado di elaborare: una tossina termolabile di natura proteica, simile alla enterotossina CT del colera e alla tossina tremolabile LT di E. coli, un fattore proteico termolabile prodotto dalla membrana batterica, capace di alterare la morfologia delle cellule epiteliali della mucosa intestinale; un lipopolisaccaride (LPS), costituente la membrana batterica, dotato di proprietà endotossica e di resistenza alla lisi (Jiwa S. F. H. et all., 1993).
Lo sviluppo di un’infezione sintomatica (Fig. 10) dipende dal numero di batteri ingeriti (la dose minima infettante è ipotizzata tra 102 e 103 cellule), ma può variare
21 I fattori ambientali giocano un ruolo non trascurabile, essendo comprovato l’effetto nocivo della temperatura elevata, del grado di umidità, del sovraffollamento e dell’inquinamento chimico.
Figura 10 Meccanismo patogenetico (http://www.med.unipg.it)
Alcune salmonelle definite “ospite-ristrette” producono infezioni sistemiche gravi, mentre l’enterite è di scarsa entità o assente. Questi sierotipi (S. ser. Typhi, S. ser. Abortus ovis, S. ser. Typhi suis, S. ser. Gallinarum) sembra migrino rapidamente dall’intestino verso le cellule del sistema reticolo-endoteliale, dove si instaurano, inducendo lo stato di portatore (Zavanella M., 2001).
22
2.4.1 Meccanismo patogenetico
Come è stato precedentemente detto, è nota una correlazione tra l’azione patogena della Salmonella ed il suo corredo genetico. Solo i ceppi che possiedono determinati geni sono in grado di indurre la malattia, mentre altri che ne sono privi, pur appartenendo allo stesso sierotipo, non sembrano essere patogeni.
Un ruolo importante è svolto dai cosiddetti “plasmidi di virulenza” che codificano vari fattori.
I plasmidi sono presenti in tutti gli isolati di S. ser. Enteritidis, S. ser. Typhimurium, S. ser. Dublin, S. ser. Choleraesuis, S. ser. Infantis, S. ser. Panama, S. ser. Heidelberg provenienti da infezioni sistemiche umane e animali, mentre spesso risultano assenti in isolati da feci, da alimenti e da tamponi ambientali.
Ceppi di S. ser. Typhimurium che non presentano questo plasmide sono ancora capaci di invadere la mucosa intestinale e di colonizzare il fegato e la milza del topo, ma mostrano una ridotta capacità di causare infezioni sistemiche. La perdita del plasmide di virulenza in S. ser. Typhimurium non comporta una riduzione delle lesioni intestinali e della diarrea nel modello bovino per cui questa osservazione suggerisce che il plasmide di virulenza codifichi per fattori importanti dell’infezione sistemica ma secondari per la patogenesi della diarrea. Queste proprietà di virulenza sono ritenute da molti autori frutto di acquisizione da parte delle salmonelle di frammenti di DNA mediante trasmissione genetica orizzontale da altre specie batteriche (Benson C. E. et all., 1997).
23
2.4.2 Adesione e invasività
Quando interagiscono con cellule in coltura, le salmonelle producono un’alterazione caratteristica della membrana cellulare (ruffling) accompagnata da estesi riarrangiamenti dei filamenti di actina nelle zone immediatamente adiacenti al sito di adesione del batterio alla membrana. Una volta fagocitato il batterio, la superficie della membrana cellulare e l’organizzazione dell’actina
ritornano normali. L’invasività e il fenomeno del ruffling (Fig. 11) sono mediati da un gran numero di geni batterici, molti dei quali soggetti a regolazione dell’espressione durante le varie fasi del processo di invasione. Nello specifico Salmonella Pathogenicity Island 1 (SPI-1) è una porzione del genoma batterico che codifica fattori essenziali per l’invasività della mucosa intestinale, mentre SPI-2 influenza la virulenza sistemica, favorisce la crescita intracellulare del germe e la sua sopravvivenza nei macrofagi.
Nelle prime fasi dell’infezione la salmonella interagisce con gli enterociti e trasloca nel loro cytosol quattro proteine effettrici denominate Sop (“Salmonella outer
proteins”, dette anche Sig, “Salmonella invasion gene”). La proteina effettrice più
importante è SopB, una tossina batterica enterotossica (detta anche SigD) codificata da un’altra isola di patogenicità denominata SPI-5. SopB è una inositolo-fosfato fosfatasi che induce infiammazione intestinale e secrezione di fluidi. È noto che l’infezione da Salmonella induce l’innalzamento dei livelli cellulari di inositolo 1,4,5,6-tetrafosfato con il risultato di stimolare la perdita di ioni cloro dalla cellula eucariotica e la secrezione di fluidi nel lume intestinale (Graziani C. et all., 2005).
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2.4.3 Resistenza alla fagocitosi
Nel genoma di Salmonella spp. sono presenti regioni cromosomiche che codificano per i fattori legati alla
sopravvivenza intercellulare: il
locus oxyR (da “oxydase”) che contiene le informazioni per sintetizzare le proteine che proteggono dai radicali dell’ossigeno generati all’interno dei macrofagi; il sistema regolatore phoP/phoQ (da “phagocytosis”) che consente la sopravvivenza all’interno dei fagociti.
Pertanto la risposta immunitaria viene evasa grazie alla resistenza di Salmonella spp. all’interno del fagosoma (Fig. 12), grazie al regolatore trascrizionale phoP e il sensore phoQ.
PhoP controlla la trascrizione di più di 40 geni, che vengono attivati (geni pag,
phoP-activated gene) o repressi (geni prg, phoP-repressed gene).
Molti dei geni repressi da phoP sono espressi nell’ambiente extracellulare, durante le fasi di invasione dell’epitelio intestinale. Tra i geni soggetti alla regolazione phoPQ ci sono quelli indispensabili per la modificazione del lipopolisaccaride, quelli che mediano il trasporto del magnesio, la resistenza all’azione della bile, la secrezione delle proteine effettrici del sistema TTSS-1.
La phoQ è una chinasi transmembranaria con un dominio periplasmatico che lega ioni Mg++, capta i segnali esterni e fosforila la proteina phoP, attivandone la capacità di legarsi al DNA. La phoP fosforilata è un fattore trascrizionale in grado di legare i promotori dei geni pho-regolati (Bassi L., Bonardi S., 2008)
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2.5 CARATTERI DELLA MALATTIA NELL’UOMO
Nell'uomo la salmonellosi ha un tempo di incubazione che varia fra le 12 e le 72 ore; la gravità dei sintomi è variabile. Si va da semplici disturbi intestinali (crampi, alcune scariche diarroiche) che si risolvono nell'arco di 24 ore, sino a forme gravi di diarrea con disidratazione, insufficienza renale, febbre elevata, con esito fatale in alcuni casi.
Le fonti di contagio sono rappresentate dall'ingestione di alimenti contaminati (soprattutto carne, uova, cibi precotti), dal contatto con portatori e dalla permanenza in ambiente ospedaliero. La via più comune d'infezione è quella orale (ingestione di cibi o liquidi contaminati), ma l'infezione si può verificare anche attraverso ferite, tagli o ulcere, per contatto di materiale contaminato con le congiuntive, od altre mucose (inalazione). Anche i rettili possono trasmettere l’infezione; infatti si calcola che circa il 90% dei rettili sia portatore di salmonelle. In ogni caso, per un adulto sano, le possibilità di contrarre l’infezione a seguito di un contatto con tali microrganismi sono piuttosto basse. Sono invece a maggior rischio tutti i soggetti più recettivi, come i neonati ed i bambini con meno di 6 anni, le donne in gravidanza (per i rischi al feto), gli anziani, gli ammalati ed i soggetti immunodepressi.
La diffusione delle salmonellosi cosiddette “minori”, che riconoscono negli animali il loro serbatoio, è in continuo aumento; sono state descritte epidemie da ingestione di uova, latte non pastorizzato, o anche da frutta o ortaggi (meloni, pomodori, patate) preparati su piani di lavoro contaminati da prodotti di origine animale.
Le salmonelle non tifoidee inducono una sintomatologia gastroenterica caratterizzata da un breve periodo d’incubazione, scariche di feci non molto voluminose senza sangue e muco.
A tale sintomatologia si accompagna talora febbre con brividi, nausea, cefalea e mialgie. La sintomatologia può regredire spontaneamente in circa 10 giorni ma in casi particolari può provocare disidratazione o dare localizzazioni extraintestinali (endocardio, sistema nervoso centrale, polmoni, ossa, articolazioni), specie in neonati, anziani o soggetti defedati. L’eliminazione dei germi con le feci può persistere per 1-6 mesi (www.antropozoonosi.it).
26 Figura 13 sintomi dell'infezione da salmonella (www.medicina360.com)
2.6 CARATTERI DELLA MALATTIA NEGLI ANIMALI
Le infezioni da Salmonella possono interessare sia gli animali a sangue caldo che a sangue freddo.
Spesso sono asintomatiche, ma talvolta possono indurre malattia, principalmente a carico dell’apparato digerente. Alcuni sierotipi possono dare forme sistemiche come setticemia, aborto, o localizzarsi in vari organi.
Come per l’uomo, la via principale di trasmissione è quella oro-fecale e le fonti più frequenti di contaminazione sono gli alimenti, le acque, l’ambiente.
Per alcuni sierotipi, in particolare S. ser. Enteritidis e S. ser. Typhimurium, risulta particolarmente importante la trasmissione verticale che comporta, ad esempio nelle specie avicole, il passaggio dell’infezione dai riproduttori alla progenie.
I soggetti asintomatici svolgono un ruolo importante nel mantenere l’infezione in allevamento.
La diffusione di Salmonella spp. è inoltre agevolata da fattori come le condizioni igieniche e il sovraffollamento dell’allevamento, condizioni di stress, il parto, infezioni virali concomitanti. In genere, gli animali giovani sono più sensibili degli adulti.
27
BOVINI. S. ser. Dublin, S. ser. Typhimurium e S. ser. Enteritidis rappresentano i
sierotipi di maggiore importanza nella patologia del bovino. Le condizioni che favoriscono la diffusione e il contagio sono molteplici e coinvolgono: dimensioni e struttura dell’allevamento, tipo della lettiera, alimentazione, cicli di produzione, condizioni igieniche, impiego di farmaci a scopo terapeutico, profilattico e, più semplicemente, auxinico. I portatori sani costituiscono il serbatoio più importante di
S. ser. Dublin e i bovini adulti, escretori anche per lungo periodo, sono da
considerare la principale fonte di contagio per i vitelli. Molto frequenti sono anche i portatori non escretori, che possono però divenire escretori in seguito a fenomeni di stress, parto o malattie intercorrenti. L’abbandono in corsi d’acqua di feti abortiti determina il trasporto a distanza delle salmonelle con conseguente contaminazione di pascoli e delle acque di abbeverata. S. ser. Dublin può rimanere attiva oltre 4 mesi nei liquami e riesce a sopravvivere per anni nell’ambiente. Le enteriti da S. ser. Dublin si osservano normalmente nei vitelli di 3-6 settimane e sono caratterizzate da febbre, anoressia, depressione e diarrea, seguite da morte in 1-2 giorni (tasso di mortalità 75%) (Fig. 15). Le feci, maleodoranti, possono contenere sangue e brandelli di mucosa intestinale. Negli adulti la malattia può essere grave e manifestarsi all’improvviso con febbre, abbattimento, anoressia, agalassia, seguiti da diarrea emorragica (Fig. 14) con tracce di muco nelle feci. Se non si interviene prontamente con la terapia la mortalità è elevata e i soggetti che sopravvivono possono andare incontro a
recidive.
L’epidemiologia e la patogenesi di S. ser. Typhimurium e S. ser. Enteritidis differiscono per alcuni importanti aspetti dalle infezioni di
S. ser. Dublin. S. ser. Typhimurium è la specie
più comune in corso di salmonellosi bovina. E’ largamente diffusa in ambiente e in numerosi animali selvatici, ma la fonte principale di
contagio per gli adulti è rappresentata dagli stessi bovini. Il commercio dei vitelli e la pratica di raggrupparli, anche se di provenienza diversa, facilita la diffusione nelle varie aree geografiche di cloni specifici così come la pressione esercitata dagli antibiotici, somministrati per ridurre le perdite economiche, provoca la persistenza di cloni endemici di S. ser. Typhimurium. La frequenza di portatori sani rimane
Figura 14 Diarrea emorragica di un vitello di pochi giorni (www.nadis.org.uk)
Figura 15 Vitello di pochi giorni morto per setticemia (www.nadis.org.uk)
28 bassa, per cui la malattia tende ad esaurirsi sia nei giovani che negli adulti. Nel vitello si osserva enterite e/o setticemia, con alta morbilità e un tasso di mortalità che può superare il 50%. Le fonti di contagio si identificano nei mangimi e foraggi contaminati, nei roditori e volatili selvatici, nella fertirrigazione, nella lettiera e nei corsi d’acqua. L’aborto è raro.
Per quanto riguarda il latte bovino, non è facilmente contaminabile da Salmonella, ma se si riscontrasse la sua presenza sarebbe per lo più dovuta a contaminazione secondaria per imbrattamento (Andreani E. et all., 2002).
OVI-CAPRINI. La salmonellosi ovi-caprina è assai
diffusa e, nelle diverse aree geografiche, presenta un’incidenza proporzionale alla consistenza del patrimonio animale. In rapporto all’età dei soggetti colpiti si riconoscono una forma di tipo generalizzato negli agnelli e una forma nella pecora, caratterizzata da aborto.
La salmonellosi degli agnelli è una malattia sporadica, che raramente si manifesta con sintomi e lesioni confinati all’apparato gastro-enterico, più spesso assumendo le connotazioni di malattia sistemica. Responsabili delle forme più gravi sono S. ser. Dublin e S. ser. Typhimurium, che provengono da bovini infetti o malati. I singoli focolai possono esordire con casi di morte fulminante non preceduta da sintomi. In seguito compaiono astenia, diarrea con emissione di feci giallo-verdastre con tracce di sangue, sete intensa. Il decorso è rapido e la morte sopravviene entro 24h dall’esordio della malattia.
La forma più comune di salmonellosi nella pecora è quella sostenuta da S. ser. Abortus ovis (Fig. 16), ospite adattata e responsabile di aborto, sepsi acuta ed enterite. S. ser. Abortus ovis perviene in allevamento in seguito all’introduzione di animali infetti.
L’aborto si manifesta solitamente nelle ultime sei settimane di gravidanza e costituisce l’unica manifestazione patologica alla quale segue metrite.
In presenza di S. ser. Dublin e S. ser. Typhimurium prevalgono la forma setticemica ed enterica caratterizzate da febbre (41°C), anoressia, diarrea profusa. La morte per setticemia può avvenire prima dell’aborto (Martin W. B., 1983).
Figura 16 Salmonella ser. Abortus Ovis (www.spvet.it)
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SUINI. La salmonellosi suina è quasi sempre sostenuta da S. ser. Choleraesuis var.
Kunzendorf e da S. ser. Typhimurium. Possono provocare enteriti e setticemie e, occasionalmente, anche meningiti, encefaliti, polmoniti, linfadenite caseosa. Le fonti di contagio sono rappresentate da: roditori, volatili, acqua e alimenti, suini con malattia in atto e portatori-eliminatori. Inoltre, l’affollamento degli animali, lo stress dovuto al trasporto, stati patologici,
incrementano l’escrezione delle salmonelle da parte di portatori sani.
Le manifestazioni cliniche sono riconducibili a diarrea ed estremità (grugno, orecchie, coda, zampe) violacee a causa della vasodilatazione dell’endotossina prodotta da S. ser. Choleraesuis (Fig. 17).
La forma setticemica è tipica dei suinetti svezzati di circa 4 mesi e si
manifesta con morte fulminante. La forma enterocolitica è caratterizzata dall’emissione di feci liquide, giallastre, prive di sangue e muco (Wilcock B. P., 1986).
EQUINI. L’infezione da Salmonella spp. nel cavallo costituisce un’importante causa
di patologie dell’apparato gastro-enterico, di setticemie e di decessi. Alcuni soggetti, senza sviluppare segni clinici, possono diffondere la salmonella ad altri animali sia della stessa specie sia di specie diverse, costituendo una vera e propria fonte di contaminazione ambientale potenzialmente pericolosa anche per l’uomo. Fattori stressanti associati alla progressione dell’infezione, fino a farla sfociare in manifestazioni cliniche, includono: trasporto, trattamenti terapeutici con agenti antimicrobici, interventi chirurgici, ecc. Per quanto riguarda i portatori sani, alcuni ricercatori hanno messo in evidenza che ne possono esistere due tipi: uno rappresentato da “portatori attivi” che diffondono minime concentrazioni di microrganismi tramite materiale fecale, l’altro rappresentato da “portatori silenti” che albergano le salmonelle nei linfonodi mesenterici o nella mucosa del cieco e del colon ascendente (Van Duijkeren, 1995). Numerosi sono i sierotipi di Salmonella isolati nella specie equina; tralasciando la S. ser. Abortus equi che ne rappresenta uno dei più significativi, che non possiede importanza da un punto di vista “rischio alimentare” in quanto ha come organi bersaglio quelli dell’apparato uro-genitale, tra quelle di più frequente isolamento vanno mensionate: S. ser. Typhimurium, S. ser. Enteritidis, S. ser. Dublin, S. ser. Newport, S. ser. Arizona, S. ser. Anatum, S. ser. Meleagridis, S. ser. Thompson, S. ser. Derby. (Soncini G. et all., 1997). A parte l’aborto nelle giumente, le salmonellosi si riscontrano in prevalenza nel puledro, che
30 si può infettare in utero oppure per via digerente, nasale e ombelicale. L’incubazione varia da alcune ore a qualche giorno e l’azione patogena si esprime inizialmente attraverso l’elaborazione di endotossine che favoriscono la generalizzazione del processo morboso. S. ser. Abortus equi, S. ser. Typhimurium e
S. ser. Enteritidis colpiscono prevalentemente puledri di 2-3 settimane, nei quali
provocano forme enteriche o setticemiche. Nelle prime si osservano febbre, anoressia, diarrea persistente con emissioni di feci color grigio-verdastro spesso contenenti sangue, nonché poliartriti, tenovaginiti, ascessi sottocutanei e polmonari. Nei puledri giovani l’infezione generalizza facilmente e, dopo poche ore dalla comparsa dei primi sintomi, si ha morte per collasso cardiocircolatorio. Nei soggetti meno giovani o più robusti il decorso è più lungo ma si conclude spesso con la morte dopo 2-3 settimane di malattia. S. ser. Abortus equi è responsabile di aborto ed è anche causa di infertilità nella giumenta. La trasmissione si verifica sia per via venerea che per contatto con i prodotti
dell’aborto. L’aborto (Fig. 18) si manifesta dopo 2-4 settimane dall’avvenuto contagio, senza sintomi premonitori, ma può anche essere preceduto da febbre, tumefazione della vulva, scolo vaginale, dolori colici. Con parto a termine i nati sono poco vitali per l’infezione acquisita in utero o al momento della nascita. In questo caso, l’esordio è improvviso con febbre elevata, anoressia, diarrea emorragica profusa; il rapido esito letale (48-72h) vanifica ogni tentativo di terapia.
Nelle rare occasioni in cui i puledri sopravvivono, la malattia cronicizza (Biesinger C., 1983).
CANE E GATTO. In questi animali la salmonellosi è assai più frequente di quanto non
lascino supporre i casi di malattia conclamata. Tra i molti sierotipi riconosciuti responsabili, il più comune è certamente S. ser. Typhimurium. Gli alimenti contaminati (mangimi, carne fresca e congelata) sono ritenuti la fonte principale di infezione. Soggetti al di sotto dell’anno di età denotano una maggiore sensibilità e presentano più spesso sintomi evidenti di malattia. Possono accrescere la recettività stress vari, terapie mediche (glicocorticoidi, antibiotici), interventi chirurgici, carenze alimentari. Sul piano clinico si riconoscono una forma gastro-enterica e una batteriemica-endotossiemica. La forma gastro-enterica si manifesta con febbre elevata (40-41°C), anoressia, depressione, vomito, dolori addominali, pallore delle mucose, diarrea mucoide o muco emorragica, con conseguente disidratazione e perdita di peso. La mortalità non supera il 10% e gli animali, nella maggior parte dei
31 casi, guariscono in 3-4 settimane. Invece, batteriemia e endotossiemia costituiscono reperti di forme transitorie e a volte subcliniche di gastroenterite, riscontrabili in cani e gatti molto giovani o immunodepressi. Sono caratterizzate da profondo abbattimento, debolezza, ipotermia, collasso cardiocircolatorio. Tra gli altri eventi morbosi ricordiamo aborto, parti prematuri, nascita di cuccioli deboli o gracili. Va ricordato anche che l’eliminazione di salmonelle con la saliva e le feci da parte di cani e gatti, anche apparentemente sani, può comportare contaminazione del pelo e costituire un pericolo per i proprietari e per coloro che si accostano agli animali (Greene C. E., 1990).
AVICOLI. I volatili domestici rappresentano uno dei principali serbatoi di salmonelle. Negli avicoli sono coinvolte salmonelle ospite-specifiche (S. ser. Pullorum, S. ser. Gallinarum) e salmonelle non adattate all’ospite (S. ser. Typhimurium, S. ser. Arizona). S. ser. Pullorum e S. ser. Gallinarum sono le due uniche specie immobili del genere Salmonella.
S. ser. Pullorum è l’agente eziologico della
“pullurosi aviare” o “diarrea bianca bacillare”, causa di ingenti perdite di avicoli. Colpisce prevalentemente il pollo, ma è stata ritrovata anche in tacchini,
anatre, piccioni, faraone, fagiani e altri uccelli selvatici. Le galline sono portatrici e depongono uova infette a causa della localizzazione ovarica del microrganismo. Il pulcino può andare incontro al contagio nei primi giorni di vita per contatto diretto o per via inalatoria. I soggetti che sopravvivono rimangono portatori ed eliminatori e possono diffondere il contagio all’interno dell’allevamento per mezzo delle feci. I pulcini che muoiono al momento della schiusa non presentano sintomi, ma quelli di età superiore si mostrano sonnolenti, con occhi chiusi, tendono ad ammassarsi, pigolano continuamente, hanno diarrea e muoiono entro poche ore (Fig. 19).
Nei broiler la malattia può essere cronica con sintomi riconducibili a: zoppie, tumefazioni delle articolazioni tibiotarsiche e tarsometatarsiche, piumaggio arruffato e opaco e scarso incremento ponderale.
S. ser. Gallinarum è l’agente eziologico della “tifosi” del pollo e del tacchino. Colpisce
prevalentemente le pollastre dal terzo mese di età fino al momento della deposizione. Raramente si riscontra nel pulcino. Provoca una forma setticemica, che si manifesta con apatia, debolezza, sonnolenza e diarrea. Porta alla morte entro 48h dall’esordio. L’infezione provocata da questo sierotipo può essere trasmessa anche attraverso le manipolazioni del personale, con vestiti contaminati e scarpe.
Figura 19 Sintomatologia nel pollo da S. ser. Pullorum (http://fmvz.uat.edu.mx/aves)
32 Le “paratifosi aviarie”, sostenute da S. ser. Enteritidis e S. ser. Paratyphi, invece, sono caratterizzate da enteriti e, nei casi gravi, da setticemie. Colpiscono i pulcini entro le prime due settimane di vita e si manifestano con gli stessi sintomi della pullurosi. Il tasso di mortalità può sfiorare l’80-90%.
Ad eccezione di S. ser. Typhimurium, che si localizza a livello delle ovaie, nelle altre forme l’infezione si stabilisce per contaminazione esterna del guscio dell’uovo e non per via trans ovarica. Le salmonelle penetrano nell’uovo attraverso le porosità del guscio imbrattato da feci contaminate. (Gordon R. F., 1984).
ACQUACOLTURA. L’intensa attività filtrante rende i molluschi bivalvi (Fig. 20) degli accumulatori biologici in grado di concentrare al loro interno vari agenti più o meno nocivi per l’uomo (batteri, virus, biotossine algali, metalli pesanti). Poiché il principale serbatoio di diffusione nell'ambiente è sempre costituito dalle feci
d'animali da allevamento e uomo, è verosimile che i prodotti della pesca possano inquinarsi con Salmonella spp. in due modi essenziali: per contatto con acque costiere, dolci o salmastre, in prossimità di foci di fiume o scarichi fognari; per inquinamento da manipolazione secondaria in fase di lavorazione (decapitazione, sfilettatura, ecc.), per inquinamento d'attrezzi di lavoro, superfici, ecc. Non va dimenticato che a volte anche l'uomo può fungere da portatore asintomatico del microrganismo. La variante riscontrata di più frequente è S. ser. Typhimurium. La presenza della salmonella nei prodotti ittici è aumentata da quando si è sviluppata l'importazione da paesi terzi, dove l'igiene di lavorazione è abbastanza scarsa. I molluschi bivalvi vivi sono i prodotti della pesca più a rischio, seguiti da filetti di pesce e crostacei cotti sgusciati. La prevenzione delle salmonellosi da consumo di prodotti ittici si basa sul controllo della lavorazione nei paesi terzi e dei prodotti importati. A rischio sono i bivalvi allevati in prossimità delle foci di fiumi di provenienza da zone altamente urbanizzate e a vocazione zootecnica, per cui è molto importante il controllo delle acque di produzione. Dal punto di vista microbiologico un mollusco è considerato idoneo al consumo umano quando:
Salmonella spp. è assente in 25 g di polpa e liquido intervalvare (ISO
6579:2002/Cor.1:2004) (www.izsum.it).
33
2.7 EPIDEMIOLOGIA
I casi di infezione da salmonella, nell’uomo e negli animali, sono in continuo aumento ovunque. E’ interessante notare che il crescente estendersi della casistica non è legato alle specie di salmonelle autoctone, in rapporto alle varie aree geografiche, ma è invece in diretta relazione con la comparsa di un gran numero di nuove specie del germe. La pressione contaminante ed infettante esercitata dalle salmonelle è in continuo aumento, in relazione a condizioni di inquinamento specifico generale che non risparmiano neanche l’ambiente della cucina familiare, le istituzioni sanitarie (ospedali), la ristorazione collettiva più attentamente organizzata.
La via di trasmissione classica è orofecale e le fonti principali di contaminazione sono costituite da: soggetto infetto e portatore sano, che garantiscono una costante microbizzazione ambientale; alimenti, soprattutto quelli a base di farine proteiche; dall’ambiente, soprattutto dalle acque, che favoriscono la disseminazione a distanza, e dai liquami zootecnici impiegati per la fertirrigazione (Fig 21).
Figura 21 Ciclo epidemiologico delle salmonelle (Zavanella M., 2001)
La trasmissione di Salmonella all’uomo avviene principalmente attraverso l’ingestione di alimenti di origine animale contaminati, anche se possono verificarsi casi di trasmissione interumana o per contatto diretto con gli animali. Ancora da chiarire il ruolo degli alimenti d’origine vegetale, che possono essere contaminati da
34 La contaminazione ambientale di suolo, acque superficiali, ambienti di lavoro, può favorire la diffusione e il contatto delle salmonelle con le specie animali recettive e con l’uomo (Zavanella M., 2001).
2.7.1 Serbatoi animali
Gli animali fungono da principali serbatoi di mantenimento. Il ruolo di serbatoio viene svolto da numerose specie animali sia da reddito che da compagnia.
Come spiegato nel capitolo 2.4.5, i bovini sono spesso colonizzati da S. ser. Dublin e
S. ser. Typhimurium, con infezioni di diversa durata e tipo di manifestazione clinica. S. ser. Dublin può persistere nell’ospite molto a lungo, in alcuni casi anche tutta la
vita, e spesso induce forme gravi di malattia. L’infezione da S. ser. Typhimurium ha una durata generalmente inferiore ed è abitualmente associata ad enterite cronica. Nelle specie aviarie sono presenti sierotipi specie-specifici, come S. ser. Gallinarum nel pollo, sierotipi ospite-adattati e ubiquitari. In Italia (dati ENTER-VET, 2002) i principali sierotipi ospite-adattati nel pollo sono S. ser. Hadar e S. ser. Enteritidis, mentre nel tacchino si ritrova principalmente S. ser. Blockley.
Anche i suini rappresentano un importante serbatoio di salmonelle come S. ser. Typhimurium e S. ser. Derby.
Un ruolo di minore importanza nella diffusione delle salmonelle è rivestito dagli animali da compagnia. Particolarmente frequente la colonizzazione nelle tartarughe e altri rettili, spesso con sierotipi rari.
Uccelli selvatici e roditori in genere costituiscono una sorgente di infezione attraverso la fecalizzazione di alimento e ambiente.
Anche le specie selvatiche possono fungere da serbatoio, ma le informazioni relative sono piuttosto scarse (Graziani C. et all., 2005).
2.7.2 Alimenti
L’ubiquitarietà e la capacità di crescita delle salmonelle a temperature comprese fra 7 °C e 46 °C fa sì che qualsiasi alimento manipolato o conservato in modo non corretto possa essere fonte di infezione. Molti episodi sono causati dal tempo prolungato intercorso fra la preparazione o la cottura dell’alimento e il consumo trascorso, che rendono possibile la moltiplicazione dei batteri presenti, con
35 una maggiore probabilità di causare infezione, che può anche così presentarsi con caratteristiche di maggiore gravità (De Felip, 2001).
Anche il ruolo degli operatori della catena alimentare (Fig. 22) può essere rilevante, in quanto è stato dimostrato che una non corretta manipolazione di materie prime contaminate (carni, uova) può causare un’estesa contaminazione ambientale che, anche in conseguenza dell’elevata capacità delle salmonelle di sopravvivere nell’ambiente, può essere causa di contaminazione e cross-contaminazione di alimenti pronti per essere consumati (Synnott, 1998).
Uno dei punti critici più importanti è la catena di macellazione (Fig. 23), dove la presenza di salmonelle è generalmente causata da contaminazione fecale, ed è direttamente proporzionale all’entità dell’infezione nell’animale e alle carenze igieniche in fase di macellazione. La contaminazione a livello delle masse muscolari è di solito infrequente, ma aumenta in seguito ai processi di lavorazione per la produzione di carni macinate o insaccati freschi. Per questo motivo tali prodotti, se cotti o stagionati in modo non sufficiente, possono divenire fonti di infezione (Castellani, 1993).
Figura 23 Esempio di catena di macellazione (www.ilfattoalimentare.it)
Nelle carni avicole, la contaminazione da Salmonella dipende principalmente dalle modalità di allevamento del pollame. Ogni allevamento può contenere migliaia di capi, e questa concentrazione di potenziali ospiti fornisce alle salmonelle l’opportunità di diffondere in modo estremamente rapido tra gli animali.
36 La stessa condizione si ritrova durante il trasporto dall’allevamento al macello, che avviene sempre in condizione di sovraffollamento. Nel corso della macellazione, poi, le salmonelle possono passare da un carcassa all’altra, in seguito ai fenomeni di contaminazione crociata che si verificano durante la lavorazione.
Le uova e i prodotti derivati rappresentano un importante veicolo di Salmonella, soprattutto S. ser. Enteritidis. La contaminazione dell’uovo può avvenire nell’ovaio per trasmissione verticale, nella cloaca, e al momento della deposizione, principalmente in seguito a contaminazione fecale dei nastri di trasporto delle uova. Negli ultimi due casi le salmonelle si trovano sulla superficie del guscio e possono penetrare nell’uovo in seguito a microlesioni del guscio stesso o attraverso i pori che permettono gli scambi gassosi fra l’esterno e l’interno. La penetrazione delle salmonelle nelle uova viene facilitata dalla presenza di umidità sulla superficie delle uova stesse, che modifica la tensione superficiale. Questo fenomeno è alla base della decisione della Commissione Europea di non rendere obbligatoria la refrigerazione delle uova durante la fase di commercializzazione, al fine di evitare che eventuali interruzioni della catena del freddo possano provocare la formazione di condensa sul guscio, facilitando la penetrazione di microrganismi eventualmente presenti sulla sua superficie.
All’interno dell’uovo la contaminazione si localizza a livello della membrana vitellina e dello strato di albume che la circonda. Nelle uova fresche il numero di salmonelle presente è estremamente basso e, essendo l’albume un substrato povero di ferro, la moltiplicazione dei microrganismi avviene solamente in seguito a penetrazione degli stessi nel tuorlo, come effetto di variazioni nella permeabilità della membrana vitellina. Tali variazioni avvengono in modo direttamente proporzionale al tempo e alla temperatura di conservazione: in uova contaminate conservate a temperature inferiori a 20 °C, l’invasione del tuorlo comincia dopo circa tre settimane, mentre a temperature comprese fra 20 e 30 °C la crescita microbica avviene rapidamente, nel giro di pochi giorni. Da tali considerazioni emerge l’importanza della temperatura di conservazione delle uova come fattore critico.
La maggior parte dei casi di tossinfezione alimentare da S. ser. Enteritidis sono correlati non tanto alle uova, ma al consumo di prodotti a base d’uovo, quali maionese (Fig. 24) e dolci preparati con uova crude, in cui la moltiplicazione dei microrganismi presenti avviene in seguito al mantenimento dei prodotti a temperatura ambiente per tempi anche brevi, venendo a mancare quei fattori limitanti la crescita batterica che abbiamo descritto nelle uova in guscio.
37 Figura 24 Maionese fatta in casa (www.ilgazzettino.it)
Oltre ai più comuni alimenti, di origine animale, numerosi episodi di tossinfezione alimentare sono stati associati ad alimenti particolari. Basti ricordare l’episodio che si verificò in Inghilterra e nel Galles a causa di uno snack a base di mais contaminato da S. ser. Agona e quello causato da germogli di soia contaminati da S. ser. Saintpaul. Anche prodotti a base di cioccolata, che in genere non creano particolari preoccupazioni grazie al loro basso tenore in acqua, hanno causato episodi rilevanti di salmonellosi; un esempio si è verificato negli anni settanta in Canada e negli Stati Uniti causato da S. ser. Eastbourne, e altri legati alla presenza di S. ser. Napoli in cioccolato di origine italiana. Il dato interessante di entrambi gli episodi è la dose infettante estremamente bassa se confrontata con quella normalmente associata all’infezione da Salmonella, spiegabile dall’effetto protettivo dell’alimento, particolarmente ricco in sostanze lipidiche, nei confronti dell’acidità gastrica (www.epicentro.iss.it).
2.7.3 Ambiente
Le salmonelle si ritrovano anche nell’ambiente (acque, suolo, alimenti di origine vegetale) a causa della contaminazione attraverso le feci sia di origine umana che animale.
L’ambiente rappresenta un ottimo serbatoio di mantenimento per molti sierotipi, anche per quelli che normalmente non sono riscontrati negli animali da allevamento e nell’uomo.
Salmonella è molto comune nelle acque reflue (Fig. 25), attraverso le quali può
diffondersi in ambienti acquatici come torrenti, fiumi, laghi e rappresentare una fonte di contaminazione del suolo e di conseguenza anche dei vegetali. L’utilizzo delle acque reflue per irrigazione rappresenta una fonte diretta di contaminazione che è favorita da vegetali con denso fogliame in quanto proteggono i microrganismi
38 dall’esposizione a fattori ambientali quali radiazioni solari, temperature elevate ed essiccamento e offre loro una superficie ottimale di crescita.
Anche gli animali al pascolo inducono una contaminazione diretta del suolo che, attraverso dilavamento della pioggia può trasportare la contaminazione fino ai bacini idrici (Graziani C., et all., 2005).
2.8 DIAGNOSI
La diagnosi, ovvero la ricerca di questo microrganismo, può essere fatta a partire da alimenti oppure da elementi presenti in allevamento (feti, campioni fecali, organi, sangue, ecc.).
2.8.1 Ricerca di Salmonella a partire da alimenti
La ricerca delle salmonelle negli alimenti è una procedura prevista dalla normativa per la sicurezza degli alimenti e viene effettuata seguendo procedure operative standard (POS) che si basano su metodi validati dall’International Standard Organization (ISO).
Le metodiche applicabili possono essere: tradizionali, affidabili ma lunghe, con l’obiettivo di isolare o numerare, mediante l’impiego di terreni colturali, i microrganismi presenti nei campioni da sottoporre ad analisi; rapide, che presentano il vantaggio di poter ottenere i risultati in 24h e consentono di prendere misure tempestive.
