RIASSUNTO
Acinetobacter baumannii è un importante patogeno opportunista responsabile di gravi
infezioni correlate all’assistenza sanitaria. La resistenza agli antimicrobici rappresenta il principale vantaggio selettivo che consente al microrganismo di diffondere in ambiente ospedaliero, specie quando le misure di contenimento della trasmissione risultano inefficaci.
La diffusione clonale a livello europeo di batteri multi-resistenti, genotipicamente e fenotipicamente molto simili, è un fattore che contribuisce ad aggravare il problema della resistenza agli antibiotici.
In considerazione di ciò è stato intrapreso uno studio di epidemiologia molecolare, che ha previsto la genotipizzazione di ceppi endemo-epidemici di Acinetobacter baumannii isolati all’interno dell’Azienda Ospedaliero-Universitaria Pisana, per i quali è stata determinata la relazione filogenetica tra genotipi distinti, la loro appartenenza ai gruppi clonali europei e sono stati identificati i tratti fenotipici e genici associati alla maggiore diffusione dei cloni epidemici all’interno dell’ambiente ospedaliero, andando a verificare infine l’efficacia delle misure di contenimento.
Nel periodo marzo 2007–marzo 2010, 83 ceppi isolati da campioni clinici e 24 dal setting ospedaliero sono stati sottoposti a genotipizzazione, mediante le tecniche di Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE), Multilocus sequence typing (MLST) e Repetitive Extragenic Palindromic-PCR. I profili molecolari sono stati utilizzati per l’analisi cladistica.
L’assegnazione dei ceppi ai cloni epidemici Europei è stata condotta mediante Multiplex-PCR per l’individuazione dei polimorfismi dei geni ompA, csuE e bla OXA-51like.
Per la valutazione della suscettibilità agli antibiotici è stato utilizzato il metodo Agar dilution NCCLS. In tutti gli isolati è stata indagata, mediante PCR, la presenza dei geni blaOXA-like.
L'attività battericida del cloro è stata valutata in accordo alla norma BS EN 1040:1997, mentre la sua azione modulante l’espressione dei geni coinvolti nell’efflusso è stata analizzata con il metodo 2- ∆∆CT.
La tipizzazione molecolare mediante PFGE ha rilevato la presenza di 7 pulsotipi (PT) differenti, di cui due sono risultati varianti strettamente correlate di un stesso clone
epidemico, prevalente su tutta la rete ospedaliera (prevalenza: 58% PT1, 37% PT6), mentre gli altri 5 pulsotipi erano sporadici e genotipicamente più eterogenei.
La sequence type (ST) delle varianti clonali prevalenti è risultata ST4 le altre ST erano ST81, ST92 e ST197, mentre a due profili (denominati arbitrariamente newTlv92, new) non è stato possibile assegnare alcuna ST, rilevandosi genotipi non ancora archiviati in data-base (www.pubmlst.org).
La rep-PCR ha consentito di discriminare 9 patterns, di cui 6 appartenenti a tre gruppi filogeneticamente simili (gruppo RP 1-2-3) e 3 sono risultati outliner.
L’analisi dei ompA, csuE e blaOXA-51likeha permesso di collocare gli isolati all’interno di
gruppi genomici e, dall’analisi crociata dei dati della genotipizzazione, è stato possibile assegnare gli isolati a quattro gruppi clonali: il clone A (genotipo 1: pulsotipo PT1, sequence type ST4, gruppo rep-PCR 2; genotipo 2: PT6, ST4, RP2; genotipo 3: PT4, newTlvst92, RP3; genotipo 4: PT7, ST92, RP3) appartenente al gruppo genomico 1 complesso clonale Europeo II, il clone B (genotipo 1: PT3, ST197, RP outliner 1) al gruppo genomico 2 complesso clonale Europeo I, mentre il clone C (genotipo 1: PT5, ST new, RP outliner 2 e il clone D (genotipo 1: PT2, ST81, RP outliner 3) non sono risultati appartenere ai complessi clonali europei.
Solo le due varianti predominanti del clone A hanno presentavano un fenotipo Multi Drug Resistance e sono risultati produttori di carbapenemasi OXA-58 plasmide-mediata, i cloni sporadici fenotipicamente sensibili agli antibiotici saggiati sono risultati OXA-likenegativi.
Le prove di cloro-sensibilità hanno mostrato una diversa suscettibilità dei cloni al disinfettante. I cloni A genotipo 1, genotipo 3, genotipo 4, B e C cono risultati sensibili con una riduzione significativa delle cariche già ai primi minuti di esposizione al cloro (1,1 ppm). Mentre il cloni A genotipo 2 e il clone D sono risultati più tolleranti all’azione del cloro. Queste differenze non sono risultate associate ad un incremento dell’espressione dei geni di efflusso.
A livello epidemiologico il clone A ha mostrato tendenze temporali distinte, con il genotipo 1 che ha predominato per molti mesi tra il 2007 e il 2008, prima di essere quasi completamente sostituito dal genotipo 2, comparso nel novembre 2008 e presente fino al 2010.
In conclusione, le tecniche di genotipizzazione applicate hanno mostrato un diverso potere discriminante, in particolare la MLST, pur essendo il gold standard, non si è rilevata in grado di evidenziare differenze tra il genotipo 1 e il 2 del clone A, entrambe
favoriti dall’acquisizione di multifarmaco-resistenza, ma solo il genotipo 2 dotato di una ridotta suscettibilità ai disinfettanti. Pertanto, per limitare la diffusione e la persistenza in ambiente ospedaliero di A. baumannii MDR, sono assolutamente necessarie azioni specifiche per promuovere un utilizzo appropriato degli antibiotici e l’applicazione costante e sistematica di procedure di sanificazione di verificata efficacia; inoltre un approccio proattivo al controllo delle infezioni, attraverso lo screening molecolare degli alert organisms, potrebbe ridurre l’insorgenza di epidemie.
