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Esperienza triennale di utilizzo del microscopio automatizzato a fluorescenza EUROpattern Suitenel settore di Allergologia e Autoimmunità del Laboratorio Unico Area Vasta Romagna

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Dipartimento di RICERCA TRASLAZIONALE E DELLE NUOVE TECNOLOGIE IN MEDICINA E CHIRURGIA

SCUOLA DI SPECIALIZZAZIONE IN PATOLOGIA CLINICA E BIOCHIMICA CLINICA

ESPERIENZA TRIENNALE DI UTILIZZO DEL MICROSCOPIO

AUTOMATIZZATO A FLUORESCENZA EUROPATTERN SUITE

NEL SETTORE DI ALLERGOLOGIA E AUTOIMMUNITA’

DEL LABORATORIO UNICO AUSL ROMAGNA

Candidato: Relatori: Dott.ssa Elisa Benedettini Dott. Carlo Conti Prof. Aldo Paolicchi Anno Accademico: 2015/2016

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INDICE SOMMARIO 2 1. Test ANA 3 1.1 Test ANA: Linee guida internazionali 4 1.2 Nomenclatura degli anticorpi contro antigeni cellulari comunemente indicati 5 come anticorpi anti-nucleari (ANA) 5 1.2.1. Pattern nucleari 6 1.2.2. Pattern citoplasmatici 6 1.3 Significato del test ANA 8 1.4 Gli ANA in differenti condizioni patologiche 8 1.5 L’iniziativa “Choosing Wisely” 9 1.6 ANA REFLEX 11 2. SCOPO DELLA TESI 14 3. MICROSCOPIO AUTOMATIZZATO A FLUORESCENZA EUROPATTERN SUITE 15 3.1 Caratteristiche tecniche EUROPattern-Suite 15 3.2 Software per l'interpretazione automatizzata IFI 17 3.3 Interfaccia grafica utente del software EUROPattern Suite 19 3.4 Gestione e memorizzazione dei dati in EUROPattern Suite con EUROLabOffice 20 4. UTILIZZO NEL LABORATORIO UNICO AUSL ROMAGNA 22 4.1 Laboratorio Unico AUSL Romagna 22 4.2 Settore di Allergologia e Autoimmunità del Laboratorio Unico AUSL ROMAGNA 22 4.2.1 Controlli di calibrazione e di qualità 23 5. RISULTATI 25 6. CONCLUSIONI 29

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SOMMARIO

Il test ANA è uno dei criteri diagnostici per il Lupus Eritematoso Sistemico, inoltre rappresenta un esame di primo livello per le malattie autoimmuni sistemiche. Il metodo golden standard per la determinazione degli anticorpi anti-nucleo (ANA) è l’ immunofluorescenza indiretta su cellule Hep-2, procedura che risulta tutt’oggi laboriosa e costosa.

Negli ultimi anni la sua esecuzione è stata concentrata a livelli provinciali o inter-provinciali per diminuire la variabilità inter-laboratoristica caratteristica di quest’analisi, e favorire la formazione di personale sempre più specializzato.

Recentemente sono stati sviluppati sistemi automatizzati di lettura del test ANA che offrono il vantaggio di prestazioni più rapide, semplici e standardizzate. In tale ambito si colloca il microscopio automatizzato EUROPatter Suite che offre valutazione software-assistita delle immagini di fluorescenza per aiutare il personale dirigente del laboratorio nel primo inquadramento di patologia autoimmune (reumatica e non). In questo manoscritto si riporta l’esperienza triennale del Settore di Allergologia e Autoimmunità del Laboratorio Unico AUSL Romagna di Pievesestina di Cesena di utilizzo della tecnologia EUROPattern Suite per la lettura automatizzata del test ANA in immunofluorescenza indiretta su un’ampia casistica di casi, nonché prima esperienza italiana di utilizzo di tale microscopio nella routine di un laboratorio centralizzato.

Sono stati riportati i principi di funzionamento della tecnologia EUROPattern Suite, e l’analisi dei dati ricavati nell’arco dei tre anni di utilizzo, con particolare attenzione a: l’interfaccia utente, i vantaggi e i limiti dello strumento, i risultati dell’attività diagnostica-laboratoristica, il flusso parallelo di dati e di campioni all’interno del laboratorio, e gli sviluppi futuri più prossimi.

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1. Test ANA

1.1 Test ANA: Linee guida internazionali

Gli anticorpi antinucleari (ANA) sono autoanticorpi diretti contro molteplici antigeni nucleari. Sono stati rilevati nel siero di pazienti con malattie reumatiche e non reumatiche, nonché in pazienti senza una sindrome clinica definita. Questi anticorpi possono essere rilevati utilizzando una varietà di substrati e di tecniche di colorazione.

Il test di ricerca degli anticorpi anti-nucleo (ANA) tramite l’analisi di immunofluorescenza indiretta (IFI) è il test di screening di prima scelta per la diagnosi di quasi tutte le malattie reumatiche autoimmuni sistemiche (SARD), in virtù della sua maggiore sensibilità rispetto ad altri dosaggi in fase solida, quali ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), saggi in chemiluminescenza e microarray, anche a fronte di una specificità più bassa (Solomon, Kavanaugh, and Schur 2002).

Il test ANA in Immunofluorescenza Indiretta inizialmente si basava sui substrati dei tessuti di roditore, ma successivamente si sono usate le cellule HEp-2, una linea cellulare stabilita nel 1952 da Moore e dai suoi colleghi da tumori prodotti in ratti esposti a irradiazione e corticosteroidi ed iniettati con tessuto epidermoideo di carcinoma laringeo di un uomo di 56 anni (Mahler and Fritzler 2012). Nei decenni successivi i test ANA con cellule HEp-2 hanno rivoluzionato la diagnosi di malattie reumatiche associate agli anticorpi ANA, tra cui il Lupus Eritematoso Sistemico (LES), la Sclerosi Sistemica (SSc), la Sindrome di Sjögren (SjS), la Malattia del tessuto connettivo misto (MCTD), e le miopatie infiammatori idiopatiche (IIM) (Mahler and Fritzler 2010).

Negli anni ’90 in molti laboratori il test IFI sulle cellule HEp-2 è stato sostituito a favore di test di screening ANA basati su tecnica ELISA con lettura laser multicanale automatizzata (Fritzler and Fritzler 2006).

L’entusiasmo negli ambienti clinico-laboratoristici, però, ha ben presto registrato un calo a seguito della constatazione di una significativa prevalenza di risultati ANA "falsi negativi" (Wiik et al. 2004).

A fronte di ciò è stata istituita una Commissione dell’ American College of Reumatology (ACR) che ha elaborato specifiche raccomandazioni per la standardizzazione dei test diagnostici per le malattie autoimmuni, prima fra tutte l'uso della piattaforma convenzionale IIF HEp-2 per la rilevazione degli ANA (P. L. Meroni and Schur 2010).

Prove di laboratorio, infatti, avevano mostrato che i substrati di cellule HEp-2 sono in grado di legare più di 100 autoanticorpi specifici, mentre la maggior parte degli array di screening era molto più limitata nella gamma autoanticorpale, principalmente perché il numero di antigeni purificati o ricombinanti è limitato o, quando si utilizzano omogenati nucleari come substrato, i relativi epitopi possono essere alterati o persi durante il processo di rivestimento a fase solida (Nifli et al. 2006).

A tutt’oggi il metodo gold standard per il rilevamento degli ANA è l’ immunofluorescenza indiretta (IFI) su monostrato di cellule epiteliali umane (HEp-2).

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1.2 Nomenclatura degli anticorpi contro antigeni cellulari comunemente indicati come anticorpi anti-nucleari (ANA)

Storicamente, solo gli anticorpi destinati agli antigeni presenti all’interno del nucleo delle cellule (antigeni nucleari) sono stati chiamati ANA. Allo stesso modo, il termine antigene nucleare estraibile (ENA), descritto nel 1959 da Holman e Robbins, è stato utilizzato per un gruppo di antigeni nucleari estraibili da soluzioni saline. Oggi, in seguito all'identificazione di una varietà di nuovi autoantigeni all'interno dei vari compartimenti cellulari, la nomenclatura è diventata più complessa ed imprecisa (Agmon-Levin et al. 2014).

Le matrici di autoanticorpi su varie piattaforme tecnologiche, infatti, sono spesso definite come profili ANA o ENA anche se contengono antigeni nucleari relativamente insolubili come dsDNA e / o obiettivi citoplasmatici come gli antigeni P o Jo-1 ribosomiali.

Il termine ANA, quindi, è stato mantenuto per ragioni storiche ma il test ANA risulta positivo anche in presenza di autoanticorpi diretti contro comparti cellulari diversi dal nucleo.

I pattern principali sono riportati in Fig. 1, distinti prevalentemente tra pattern nucleari e citoplasmatici (Chan et al. 2015).

Fig.1 Nomenclatura e classificazione dei pattern di IFI.

Pattern nucleare, nucleoplasmatica, citoplasmatica e mitotica, su substrati di cellule HEp-2.

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1.2.1. Pattern nucleari

I pattern nucleari sono definiti come qualsiasi colorazione dei nuclei delle cellule HEp-2 in interfase, indipendentemente dalla colorazione positiva o negativa delle cellule mitotiche. In totale, vengono riconosciuti sei gruppi di pattern principali (in arancione, Figura1) e 11 pattern minori definiti in base alla colorazione di compartimenti nucleari specifici in cellule in interfase (in verde, Fig.1) (Chan et al. 2015).

Immagini rappresentative dei principali pattern sono mostrate in Fig. 2 (A-D).

1.2.2. Pattern citoplasmatici

I pattern citoplasmatici sono definiti come qualsiasi colorazione del citoplasma delle cellule HEp-2, indipendentemente dalla colorazione positiva o negativa dei nuclei o delle cellule mitotiche. In Fig.1 si osserva la loro classificazione, mentre immagini rappresentative sono mostrate in Fig. 2 (E-H).

I cinque sottogruppi principali sono: fibrillari, speckled, reticolari / mitocondrio-like, polari/ Golgi-like, e Rods and Rings (RR).

La nomenclatura si basa principalmente sulla tipologia di colorazione osservata nel citoplasma (e.g. fibrillare o speckled) e la struttura citoplasmatica evidenziata (e.g. rods and rings). Se esiste una correlazione molto forte con la struttura intracellulare riconosciuta, viene utilizzato il nome della struttura intracellulare in oggetto con l'aggiunta di "like" (e.g. Golgi-like) (Chan et al. 2015).

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Fig.2 Immagini rappresentative di alcuni principali pattern fluoroscopici su HEp-2.

(A) nucleare omogeneo; (B) nucleare denso e fine speckled; (C) centromerico; (D) nucleolare omogeneo; (E) citoplasmatico fibrillare lineare; (F) citoplasmatico con dots; (G) polare/Golgi-like; (H) rods and rings. (Chan et al. 2015)

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1.3 Significato del test ANA

Per molti decenni, gli autoanticorpi sono stati riconosciuti come biomarcatori diagnostici per molteplici condizioni tradizionalmente classificate come malattie autoimmuni organo-specifiche e/o organo- non specifiche.

Negli ultimi due decenni sono stati scoperti alcuni nuovi autoanticorpi e probabilmente molti altri sono ancora da scoprire. E’ interessante constatare che talvolta sono stati descritti nuovi autoanticorpi in malattie che solo successivamente sono state considerate autoimmuni, come gli anticorpi anti-PLA2R nella nefropatia membranosa primaria e quelli anti- recettore NMDA (NR2) nella encefalite limbica (Salant 2010), (Lancaster and Dalma 2013), (Vincent 2013). Altre volte, invece, la gamma degli autoanticorpi coinvolti in varie malattie autoimmuni si è ampliata proprio grazie ai continui progressi scientifici che hanno determinato una maggior conoscenza delle stesse: sclerosi sistemica, miosite, sindrome da antifosfolipidi, e miastenia gravis.

In queste malattie oggi sono disponibili test per individuare molteplici autoanticorpi clinicamente rilevanti (Mehra 2013), (Lega et al. 2014), (Iaccarino et al. 2014), (Roggenbuck et al. 2012), (Verschuuren et al. 2013).

In certe condizioni, i profili autoanticorpali possono portare all'identificazione di sub-fenotipi di malattia, oppure posso essere di aiuto nella loro prognosi o nella prevenzione delle manifestazioni. La ricerca di anticorpi antinucleari totali (che, come detto precedentemente, comprendono anche autoanticorpi anti-citoplasmatici) è diventata oggi uno strumento prezioso sia a livello clinico che a livello diagnostico, in quanto primo step di eventuali ulteriori indagini laboratoristiche. La positività al test ANA, infatti, attiva studi di follow-up diagnostici per specifici disturbi autoimmuni nel campo di svariate discipline: neurologia, reumatologia, oncologia e nelle malattie infettive, polmonari e renali (Konstantinov and Rubin 2017).

In molte di queste condizioni patologiche il test ANA costituisce parte dei criteri di classificazione e di monitoraggio delle stesse: ne facilita la diagnosi differenziale, ne prevede la manifestazione, ne indica la gravità e le probabili evoluzioni di un ulteriore coinvolgimento dell'organo (Cozzani et al. 2014). Può rappresentare inoltre un indicatore di efficacia della terapia.

E’ importante però sottolineare che circa il 13% degli individui sani è positivo al test ANA IFI, quindi, oltre alla positività o meno al test, è necessario determinare con precisione il pattern e il titolo anticorpale, in modo tale da poter discriminare con un certo margine di sicurezza gli individui sani da quelli affetti da malattie autoimmuni.

1.4 Gli ANA in differenti condizioni patologiche

La rilevazione degli autoanticorpi diretti contro gli antigeni SS-A / Ro, SS-B / La, Sm, RNP, Scl-70, PM-Scl e Jo-1 è clinicamente utile nelle patologie autoimmuni sistemiche (Salamunić 2010). Di seguito alcuni autoanticorpi delle più diffuse malattie reumatoidi autoimmuni: anticorpi dsDNA, Sm e P ribosomiale nel Lupus Eritematoso Sistemico (LES);

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anti-topoisomerasi-I (Scl-70) nella Sclerodermia; autoanticorpi contro le proteine modificate della citrulina (anti-CCP) nell'artrite reumatoide; anti-SS-A/Ro e anti-SS-B/La nella sindrome di Sjögren (SjS); anti-U1-RNP e anti-PM-Scl nella malattia del tessuto connettivo misto (MCTD), anti-Jo-1 in polimiositi o dermatomiositi.

In Tabella 1 un elenco dei principali pattern fluoroscopici e la loro relazione con specifici autoanticorpi e malattie sistemiche.

Le malattie organo-specifiche, invece, sono associate ad autoanticorpi specifici per l'organo interessato, come la tireoglobulina (TGA) e l'enzima perossidasi della tiroide (TPO) nella tiroidite, gli autoanticorpi contro la decarbossilasi dell'insulina e del glutammato nel diabete mellito di tipo 1, e l'autoanticorpo anti-mitocondriale nella cirrosi biliare primaria.

Tabella 1. Pattern fluoroscopici e la loro relazione con specifici autoanticorpi e malattie. (Salamunić 2010)

Oltre a quelli sopra riportati, molti altri antigeni vengono oggi utilizzati in dosaggi per la rilevazione di autoanticorpi specifici. Nella complessità di quest’analisi è importante sottolineare che l'utilità clinica dei risultati ottenuti dipende anche dalla qualità dei test di laboratorio.

1.5 L’iniziativa “Choosing Wisely”

Nel 2012, la American Board of Internal Medicine Foundation ha lanciato la campagna “Choosing Wisely” ("Scegliere in modo saggio"), volta a promuovere un dialogo su come evitare test laboratoristici e trattamenti medici inutili (Fritzler 2016).

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L’American College of Reumatology (Società Americana di Reumatologia) e l'Associazione Canadese di Reumatologia hanno elaborato delle linee guida per un utilizzo appropriato del test ANA (Tab.2).

Raccomandazioni “Choosing Wisely” della Società Americana di Reumatologia e dell'Associazione Canadese di Reumatologia

Raccomandazioni della Società Americana di Reumatologia (ACR):

• Non ricercare auto-anticorpi specifici senza un test ANA positivo e/o un sospetto clinico di malattia immunitaria.

Ciò consegue a due considerazioni:

1- Anche se potenzialmente efficaci per il medico, i test di indagine delle sotto-categorie degli auto-anticorpi ANA (inclusi dsDNA, Sm, RNP, SSA, SSB, Scl-70 e centromero) possono essere costosi perchè generalmente negativi se il test ANA è negativo;

2- Esistono importanti eccezioni in cui è utile investigare alcune sotto-categorie degli auto-anticorpi ANA anche nel contesto di un test ANA negativo. Questi includono anti-Jo-1, che può essere positivo in un unico sottogruppo clinico di miosite o, talvolta, anti-SSA nell'ambito del LES o nella sindrome di Sjögren. Nonostante queste eccezioni, nella maggior parte delle situazioni cliniche è appropriato un approccio graduale che prevede la determinazione delle sotto-categorie ANA solo dopo un esito positivo del test ANA. Va notato che le raccomandazioni si riferiscono principalmente al test ANA IFI, considerato il gold standard da ACR.

Raccomandazioni dell'Associazione Canadese di Reumatologia (CRA):

• Non richiedere anticorpi antinucleari (ANA) come test di screening in pazienti senza sintomi specifici di LES o di un'altra malattia del tessuto connettivo (CTD).

Il test ANA non deve essere prescritto a soggetti senza sintomi specifici (ad es., fotosensibilità, rash malarica, poliartrite simmetrica, ecc.), o senza una valutazione clinica che può portare a una diagnosi presunta di LES o di altri CTD, in quanto si osserva positività in molte condizioni non reumatiche e persino nei soggetti di controllo "sani" (fino al 20%). In un paziente con probabilità minima pre-test di malattia reumatica associata agli ANA, una positività al test ANA può essere fuorviante e portare ad ulteriori test inutili, diagnosi errata o addirittura terapia inappropriata.

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La predittività del test ANA è infatti influenzata da diversi fattori, quali:

- contesto clinico (età, sesso, patologie, farmaci): la positività in una signora di 80 anni ha un significato diverso rispetto alla positività in una bimba di 2 anni, oppure in un maschio rispetto ad una femmina, infine vi è la possibilità di forme iatrogene per cui occorre verificare l’uso di determinati farmaci nella scheda clinico anamnestica;

- metodica analitica utilizzata: l’immunofluorescenza è una metodica laboriosa, ma più predittiva di altre;

- pattern fluoroscopico: alcuni sono patognomonici, marcatori della malattia;

- titolo della positività: ovviamente una positività 1:2480 è ben più significativa di una positività 1:80; una positività ANA (a basso titolo) si può facilmente trovare nelle seguenti condizioni patologiche e parafisiologiche: neoplasie, leucemie, insufficienza renale acuta e cronica, malattie renali, infezioni virali (EBV, HIV), soggetti sani (gravidanza, femmine > 40 anni, anziani)

- persistenza nel tempo: certe infezioni virali (Cytomegalovirus, Hepstein-Barr virus), farmaci o attivazioni policlonali miste possono determinare un aumento transitorio di autoanticorpi (Bassetti 2016).

D’altro canto, anche se la probabilità pre-test di patologia correlata ad una positività ANA può essere bassa, il test ANA talvolta permette di individuare pazienti con malattia autoimmune precoce o non ancora attiva, offrendo così la possibilità di intervenire precocemente e prevenire il danneggiamento dell'organo (Konstantinov and Rubin 2017).

1.6 ANA REFLEX

Il termine ‘reflex’ viene utilizzato per indicare un approccio diagnostico “a cascata” che, partendo da un risultato positivo di un test di primo livello, prosegue con l’aggiunta di nuovi test in un percorso di approfondimento sulla base di precise regole applicate ai sistemi informatici di laboratorio.

Il test ANA-reflex può essere quindi particolarmente utile al medico di medicina generale o comunque non specialista che delega il laboratorio all’inquadramento sieroimmunologico di un paziente con potenziale malattia reumatica autoimmune sistemica. L’obiettivo è di razionalizzare il percorso del paziente: una sola visita all’ambulatorio del proprio medico, un solo accesso al laboratorio, ed eventualmente, un più rapido inquadramento clinico-diagnostico (Tonutti et al. 2015).

Anche le ricadute economiche del test ANA-reflex sono di grande interesse, in quanto riduce le richieste in prima battuta di esami di secondo livello come gli anticorpi anti-ENA e anti-dsDNA. Attualmente, infatti, i laboratori sono “obbligati” ad eseguire test di secondo livello indipendentemente dal risultato degli ANA, con il risultato di una spesa aggiuntiva senza alcuna giustificazione clinico/diagnostica (Tonutti et al. 2015).

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Di seguito si riporta la proposta degli algoritmi per l’esecuzione del test ANA-reflex del Gruppo di Studio di Autoimmunologia della SIPMel (Tozzoli, Bizzaro, Villalta, Tonutti, 2016).

Procedure del test ANA-reflex con titolo ≥ 1:160 e pattern omogeneo, granulare, granulare omogeneo e nucleolare (tipo Scl70), nucleolare, centromerico o citoplasmatico granulare.

- Pattern omogeneo ≥ 1:160 – test per anti-ENA e anti-dsDNA/anti-nucleosomi;

- Pattern granulare ≥ 1:160 – test per anti-ENA e anti-dsDNA ( ed eventualmente anti-polimerasi III);

- Pattern citoplasmatico granulare ≥ 1:160 – test per anti-ENA (o anti-tRNA sintetasi) e anti-P ribosomi;

- Pattern pleomorfo (tipo PCNA) (qualsiasi titolo) – conferma con test per specificità anti-PCNA; - Pattern centromerico: non necessita conferma se evidente; da eseguire conferma con test per specificità anti-CENP B nei casi dibbi (per il basso titolo) o se associato ad altro pattern.

L’indicazione per anti-ENA è da intendersi come test di screening per i 6 ENA ‘classici’ (SS-A/Ro, La, Sm, RNP, Jo1 e Scl70).

La Regione Emilia-Romagna, e nello specifico la Sezione di Allergologia e Autoimmunità del Laboratorio Unico AUSL Romagna, è stata la prima in Italia, nell’Ottobre 2012, ad inserire l’ ANA-reflex nell’elenco dei test disponibili. In prima battuta l’introduzione dell’ANA-reflex avvenne come sperimentazione diagnostica, solo per pazienti interni. A metà del 2013 l’ANA-reflex è stato reso disponibile a tutti, e approvato come algoritmo semplificato secondo le Linee Guida regionali.

A tutt’oggi, in Emilia-Romagna, il test ANA-reflex viene eseguito secondo un algoritmo semplificato concordato con i reumatologi referenti regionali: esecuzione di ANA su HEp-2 come test di primo livello; nessun ulteriore esame se il test ANA è negativo; se il test ANA è positivo con titolo 1:80 non si eseguono esami di 2° livello ma eventualmente si programma un ricontrollo; se invece il test ANA è positivo ad un titolo ≥1:160 si procede con l’esecuzione dei test per anticorpi anti-ENA e anti-dsDNA; se il test ANA è positivo con pattern citoplasmatico (mitocondriale) ad un titolo >1:320 si esegue test di conferma per anticorpi anti-mitocondri e per anti-ENA (SS-A/Ro e Jo1) (Tonutti et al. 2015), come rappresentato in Fig.3.

Gli esami di approfondimento, quindi, sono eseguiti in modo automatico, senza la necessità di ulteriori richieste e di un ulteriore campione di sangue, e senza allungamento dei tempi di risposta. Ciò risulta di grande aiuto soprattutto per i medici non specialisti e i clinici non reumatologi. L’introduzione dell’ANA-reflex diventa parte del percorso di appropriatezza per la diagnosi delle patologie autoimmuni: gli esami risultano più mirati e utili all’inquadramento della patologia, e certamente non ridondanti.

L’esecuzione aspecifica di una batteria di test, infatti, depista talvolta dal vero obiettivo diagnostico, e risulta in un costo- beneficio negativo sia per l’utente che per il laboratorio.

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Fig.3 Algoritmo semplificato dell’ANA Reflex su Linee Guida regionali dell’Emilia-Romagna

La ricerca di anticorpi ANA specifici e l’interpretazione dei risultati corrispondenti, inoltre, dovrebbe sempre essere accompagnata da indicazione di patologia, in quanto la peculiarità di tali esami è proprio quella di sottendere a gruppi di malattie differenti tra loro.

Infine, la determinazione del titolo autoanticorpale non necessita di un monitoraggio stretto come per altre patologie: essendo infatti gli autoanticorpi della classe IgG, il titolo anticorpale viene mantenuto per mesi, e sono quindi da evitare le richieste mensili, a meno di variazioni cliniche evidenti nel soggetto in esame.

ANA REFLEX

NUCLEO Con titolo = 1:80 positivo basso titolo eventuale controllo dopo 3-6 mesi NUCLEO Con titolo ≥ 1:160 ds-DNA (ELISA) e ENA CITOPLASMA Con titolo ≥ 1:320

AMA (SSA e Jo-1) ENA

positivo pattern e titolo

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2. SCOPO DELLA TESI

Il test ANA risulta tutt’oggi una procedura laboriosa e costosa.

Negli ultimi anni la sua esecuzione è stata via via concentrata a livelli provinciali o inter-provinciali per diminuire la variabilità inter-laboratoristica caratteristica di quest’analisi, e favorire la formazione di personale sempre più specializzato.

Recentemente sono stati sviluppati sistemi automatizzati di lettura del test ANA, che offrono il vantaggio di prestazioni più rapide e standardizzate, e una migliore armonizzazione nell'interpretazione dei risultati, che spetta comunque, in ultima analisi, al personale dirigente del laboratorio.

In questo manoscritto si riporta l’analisi dei dati derivanti dall’uso della tecnologia EUROPattern Suite, per la lettura automatizzata del test ANA in IFI, su un’ampia casistica di casi clinici, nonché la prima esperienza italiana di utilizzo di tale microscopio in routine.

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3. MICROSCOPIO AUTOMATIZZATO A FLUORESCENZA EUROPATTERN SUITE

3.1 Caratteristiche tecniche di EUROPattern-Suite

EUROPattern-Suite è un sistema per l’acquisizione e l’interpretazione automatica delle immagini del test ANA in Immunofluorescenza Indiretta/IFI, sviluppato da EUROIMMUN AG (Lubecca, Germania) in collaborazione con l'Istituto di Neurologia e Bioinformatica dell'Università di Lubecca.

Il sistema è stato progettato per standardizzare e agevolare la lettura del test in IFI tramite una valutazione software-assistita delle immagini in fluorescenza. Oltre alla visualizzazione delle immagini, esso consente al personale dirigente del laboratorio di visionare i risultati generati dal software, consultare –se disponibili- gli altri dati laboratoristici dell’utente, per poi elaborare un’ interpretazionedirettamente sullo schermo del computer.

EUROPattern-Suite è composto da una parte di software, per l’interpretazione automatica delle immagini fluoroscopiche, e da una parte di hardware, costituita da un microscopio robotizzato con autofocusing ( Fig. 4).

Nello specifico comprende:

· Software di ultima generazione con l’utilizzo di algoritmo per l’interpretazione automatica delle immagini (EUROPattern)

· Software gestionale EurolabOffice

· Microscopio EUROPattern Suite robotizzato con autofocusing

Il microscopio EUROPattern Suite è dotato dell'unità ottica Axio Scope A1 (Zeiss, Jena, Germania) che comprende due obiettivi (20x /40x), un terzo obiettivo 10x è facoltativo; una sorgente di luce calibrata a diodi luminosi a LED che consente più di 50.000 ore di luce di eccitazione costante (460-490nm); e una lampada a LED durevole per la messa a fuoco automatica nella luce di trasmissione.

L'identificazione precisa e automatizzata dei campioni è abilitata dal lettore di codici a barre integrato, mentre le immagini digitali dei diversi canali sono catturate da due telecamere ad alta risoluzione distinte. Una sola immagine è sufficiente a fornire un numero adeguato di cellule per la classificazione del campione.

Anticorpi di capra anti-(Ig)G umane coniugati con fluoresceina isotiocianato (FITC) sono utilizzati per marcare gli autoanticorpi legati, mentre il propidio ioduro (PI) agisce come marcatore del DNA. Il microscopio scatta quattro immagini, tre nel verde e una nel rosso, e quella risultante dalla sovrapposizione delle quattro viene visualizzata sullo schermo.

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Fig.4 . Composizione hardware del microscopio EUROPattern Suite.

Il microscopio EUROPattern suite (a) è dotato di obiettivi 20x e 40x, luce cLED e due telecamere per l'acquisizione di immagini di alta qualità. Il controller tridimensionale (b) consente la gestione manuale della fase microscopica. Cinquanta diapositive, contenenti 10 campi di reazione ciascuno (c), possono essere immagazzinati nel rack (d) al fine di caricare il microscopio con un elevato numero di campioni e consentire lunghi periodi di camminamento. CLED: diodo a luce calibrata (Krause et al. 2015).

Nel caricatore per vetrini del microscopio EUROPattern possono essere adagiati fino a 50 vetrini, ognuno dei quali contiene 10 pozzetti in cui vengono testati altrettanti sieri. In un unico ciclo di caricamento, quindi, possono essere analizzati fino a 500 campioni, di ognuno dei quali vengono registrate e salvate le immagini e viene analizzato il pattern di fluorescenza (Krause et al. 2015). L’elaborazione di 500 campioni richiede circa 2,5 ore.

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SPECIFICHE TECNICHE MICROSCOPIO EUROPATTERN

Obiettivi Obiettivo Plan-Achromat 20x/0.50 M27

Obiettivo Plan-Achromat 40x/0.50 M27

Dimensioni Cm 51 x 66 x 85

Peso Circa 82 Kg

Temperatura ambientale tollerata +10°C a +40°C

Umidità relativa tollerata max. 75% a 35°C

Pressione 800 – 1060 hPa

Sicurezza elettrica conforme a DIN EN 61010-1 (IEC 1010-1)

Sorgente luminosa aLED per epi-fluorescenza 450nm-490nm

Vita della lampada 50000h

Tubo Bioculare 30° / 20 (100:0; 0:100)

Magazzino vetrini 10 portavetrini da 5 posizioni (capacità di 50 vetrini

e fino a 500 pozzetti)

Porta condensatore Centrabile e regolabile in altezza per illuminazioni

secondo il principio di Koehler.

Disposizione di Messa a Fuoco • Autofocusing (tempo di acquisizione

immagini 20 sec. Per pozzetto)

• Traslatore elettronico per movimento manuale dei portavetrini

Classe del Laser 2M

Tab.3. Specifiche tecniche del microscopio EUROpattern Suite (EUROIMMUN)

3.2 Software per l'interpretazione automatizzata IFI

Dopo aver posizionato manualmente il vetrino nel caricatore del microscopio di EUROPattern Suite, l'analisi di immunofluorescenza indiretta procede automaticamente.

A questo punto, infatti, viene attivata una procedura sequenziale che incorpora più passaggi preassegnati: posizionamento del campione, acquisizione di immagini, elaborazione delle

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immagini, classificazione delle cellule, controllo di qualità, ed infine elaborazione dei risultati relativi a singole cellule in un unico report.

Gli elementi ottici del microscopio EUROPattern, la risoluzione della fotocamera, la magnificazione ottica e la densità delle cellule sono regolati e bilanciati l'uno l'altro con alta precisione, così che una singola immagine (nello specifico 30 cellule per ogni immagine) è sufficiente per la corretta analisi di un pozzetto/ biochip.

Fig.5. Immagine rappresentativa di IFI su cellule HEp-2 elaborata da EUROPattern

Il software EUROPattern è in grado di distinguere tra i pattern di fluorescenza positivi e le immagini negative per cellule HEp-2 e HEp-20-10, granulociti fissati con etanolo, e granulociti fissati in formalina.

EUROPattern è inoltre in grado di determinare in completa automazione i principali pattern fluoroscopici: Omogeneo, Granulare, Nucleolare, Membrana nucleare, Nuclear dots, Centromerico, Citoplasmatico.

Il sistema si basa principalmente su un database ricco di immagini di riferimento (5000 immagini, più di 115.000 cellule). Il riconoscimento dei pattern avviene attraverso le ‘Image feature’,

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misurazioni individuali dei profili osservati. La scelta dei feature è alla base dell’algoritmo per l’appropriata classificazione dei pattern. Esso inoltre elabora una pre-classificazione a soglia che permette di riconoscere gli artefatti di immagine, evitando così l’inclusione di falsi positivi nel processo di analisi.

Il tipo di pattern e la titolazione proposti dal software devono essere convalidati dal personale dirigente di laboratorio che può facilmente visionare le immagini sullo schermo del computer (Fig.6). I risultati potranno poi essere ricontrollati velocemente a distanza di anni.

3.3 Interfaccia grafica utente del software EUROPattern Suite

I risultati riguardanti un campione vengono elaborati dal software EurolabOffice in un'unica interpretazione che include: la proposta del modello, il titolo anticorpale stimato e il corrispondente valore di confidenza (Fig.6).

L’interpretazione del sistema verrà poi confermata o meno dal personale dirigente del laboratorio, che può consultare facilmente i risultati IFI precedenti dello stesso paziente, se presenti, e avere immediato accesso al suo storico clinico-laboratoristico completo per elaborare la decisione diagnostica.

Il risultato finale dell'analisi IFI viene trasmesso al software gestionale così come i risultati individuali degli altri test analitici (ad es. ELISA, immunoblot) che verranno poi incorporati in un unico report per ogni paziente.

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3.4 Gestione e memorizzazione dei dati in EUROPattern Suite con EUROLabOffice

Il software EUROLabOffice prende generalmente tutte le informazioni rilevanti dal sistema informativo di laboratorio standard collegato (LIS, Laboratory Information System).

EUROLabOffice (ELO) ha la possibilità di gestire la comunicazione completa tra qualsiasi sistema informativo di laboratorio standard e i vari strumenti che si trovano in un laboratorio diagnostico (ad es. ELISA, IFI, immunoblot): provvede all'identificazione e all'ordinamento dei campioni, crea liste di lavoro ottimizzate e le invia alle varie stazioni di lavoro (Fig. 7).

I dati generati dagli analizzatori sono integrati con il risultato finale del test di IFI nel software di gestione dove verrà formulato un report conclusivo. Tale report verrà incluso nella cronologia dei dati del paziente, accessibile dallo stesso EUROPattern, e trasmesso automaticamente al LIS, evitando così errori manuali.

ELO è dotato di una memoria dati di 2 Terabyte, sufficiente per salvare le liste di lavoro per svariati anni, così come le immagini di IFI e gli immunoblot. ELO rappresenta quindi un vero e proprio archivio di laboratorio digitale (Gerlach et al. 2015).

Fig. 7. Organizzazione standard del flusso di lavoro di laboratorio tramite software di gestione EUROLabOffice.

EUROLabOffice organizza la comunicazione automatizzata tra un sistema informativo di laboratorio (LIS) e la stazione di lavoro di laboratorio, tra cui la gestione dei campioni e la composizione dei protocolli. Tutti i risultati corrispondenti ad un campione sono fusi in un unico rapporto che viene trasferito automaticamente al sistema di informazione del laboratorio. Lo storico dei test del paziente vengono archiviati in digitale. (Krause et al. 2015)

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A fonte dell’importante volume di dati da gestire, nel settore di Allergologia e Autoimmunità del Laboratorio Unico AUSL Romagna è stato creato un programma gestionale ad hoc che si interpone tra ELO, il LIS e le varie piattaforme di analisi.

Tale programma, chiamato PPM (Patient Program Management, ENIAC), colloquia in primis con il LIS del Laboratorio, dal quale riceve le informazioni inerenti la tipologia di analisi associate ad ogni utente, e trasmette i dati allo strumento di preanalitica (COBAS p612) in cui il bar code della provetta viene associato telematicamente alle corrispondenti analisi da eseguire, e dove vengono preparate le aliquote necessarie.

Parallelamente, il programma PPM dialoga con EUROLabOffice: in uscita comunica il piano di lavoro e in entrata riceve tutte le informazioni inerenti i test ANA/ANA-reflex (Fig.4), e dialoga con i preparatori di vetrini per l’analisi IFI (IF e XL Sprinter, EUROIMMUN), solo in uscita. Di conseguenza, EUROLabOffice viene utilizzato per la gestione della fluorescenza, ossia ha in carico solo il microscopio EUROPattern Suite e i due preparatori di vetrini (Fig.8), mentre l’ archivio digitale di laboratorio è rappresentato dal programma PPM.

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4. UTILIZZO NEL LABORATORIO UNICO AUSL ROMAGNA

4.1 Laboratorio Unico AUSL Romagna

Il Laboratorio Unico AUSL Romagna, inaugurato il 31 marzo 2009, ha un bacino di utenza di oltre un milione di persone. E’ situato a Pievesestina di Cesena e opera nell’ambito territoriale dei comuni inclusi nelle ex-Aziende Unità Sanitarie Locali di Forlì, Cesena, Ravenna e Rimini, secondo un modello di rete “hub & spoke”: un laboratorio centralizzato ad alta specializzazione (centro hub), situato a Pievesestina, e sette laboratori a risposta rapida (centri spoke), locati nei Presidi Ospedalieri di Ravenna, Lugo, Faenza, Cesena, Forlì, Rimini e Riccione, ed infine 93 punti prelievo distribuiti sull’intero territorio romagnolo.

Il Laboratorio Unico AUSL Romagna rappresenta una delle esperienze più importanti a livello europeo di gestione unificata di attività laboratoristiche: da una parte assicura al sistema socio-sanitario romagnolo equità di accesso a una gamma di servizi completa e di qualità, mettendo a disposizione della popolazione competenze specialistiche e strumenti di ultima generazione, e dall’altra garantisce la massima sostenibilità economica per il sistema sanitario.

Qui vengono parametrati tutti gli esami esterni e gli esami specialistici di secondo e terzo livello (più di 10 milioni di analisi/anno) che vengono inviati dall’intera rete, grazie anche alla concentrazione delle più innovative e importanti metodologie analitiche.

4.2 Settore di Allergologia e Autoimmunità del Laboratorio Unico AUSL ROMAGNA

Il Settore di Allergologia e Autoimmunità del Laboratorio Unico AUSL Romagna svolge la sua attività nella diagnosi delle patologie autoimmuni, tramite dosaggio degli autoanticorpi sistemici e organo-specifici, con le più recenti strumentazioni di laboratorio.

Inoltre, effettua dosaggi di IgE totali e specifiche per un ampio spettro di allergeni, tramite reazioni immunoenzimatiche su fase solida, per la diagnosi di patologie allergiche immuno-mediate.

Ogni anno vengono eseguiti quasi 300000 determinazioni. Nell’ultimo anno concluso, il 2016, ad esempio, sono stati eseguiti più di 120000 test di Allergologia, e più di 150000 test di Autoimmunità, mentre nel triennio 2014-2016 sono stati eseguiti più di 500000 test di Allergologia, e più di 500000 test di Autoimmunità.

A fronte di un numero di richieste così importante il personale del laboratorio risulta contenuto: esso comprende due Dirigenti, di cui un medico e un biologo, e sei Tecnici sanitari di laboratorio biomedico (TSLB), di cui due part-time.

Il flusso dei campioni -e parallelamente quello dei dati ad essi associati- è rappresentato nello schema in Fig.8.

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Fig. 8. Flusso di campioni e di dati nel Settore di Allergologia e Autoimmunità del Laboratorio Unico AUSL Romagna.

EIA: enzyme immuno assay; ELISA: enzyme linked immunosorbent assay; IFA: immunofluorescence assay.

I campioni di siero vengono aliquotati prima di essere analizzati: quelli che verranno processati entro 5 giorni sono conservati a 4°C, mentre quelli che necessitano analisi specialistiche sono congelati e verranno processati entro 30 giorni.

4.2.1 Controlli di calibrazione e di qualità

Il microscopio a fluorescenza EUROPattern Suite è dotato di un controllo di qualità interno che viene inserito ad ogni seduta: esso permette un settaggio del microscopio e una corretta calibrazione dell’immagine in immunofluorescenza. Tale controllo è contenuto nel kit di preparazione dei vetrini della casa madre EUROIMMUN, e non produce alcuna immagine visionabile dall’operatore.

Nel Settore di Allergologia e Autoimmunità del Laboratorio Unico AUSL Romagna vengono inoltre utilizzati dei controlli interni per valutare se l’intero processo di preparazione e lettura del

ALLERGOLOGIA AU TO IMMU N IT A’ Preparatori Vetrini IFA IF, XL SPRINTER (EI) Programma EUROLAB OFFICE

EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG · D-23560 Lübeck · Seekamp 31 · Tel. 0 45 1/58 55-0 · Fax 58 55-591

EUROIMMUN M e d i z i n i s c h e L a b o r d i a g n o s t i k a A G

Istruzioni per l'uso Microscopio EUROPattern

Microscopio robo>zzato IFA

EUROPATTERN SUITE (EI) Microscopio manuale IFA EUROSTAR III PLUS (EI) Test EIA N°2 PHADIA 250 (TS) ImmunoBLOT su siero EUROBLOT MASTER (EI) Test ELISA ANALYZER 1(EI) Presa in carico FRONT END Preanali>ca Sor>ng-Aliquote COBAS P612 (ROCHE) Programma Ges+onale LIS Acce0azione campioni

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test ANA è avvenuto correttamente. Tali controlli sono costituiti da sieri di pazienti il cui pattern fluoroscopico è ben definito e particolarmente brillante. Vengono quindi utilizzati controlli per tutte le tipologie di pattern e vengono inseriti nelle sedute di analisi IFI tre volte a settimana (Fig 9,10).

Un controllo interno di seduta viene utilizzato per circa tre- cinque mesi, fino a quando la fluorescenza dell’immagine corrispondente non si affievolisce o quando il campione va in esaurimento. A tal punto verrà sostituito con il siero fresco di un altro paziente che diventerà il controllo per i mesi successivi. E’ bene sapere che non tutti i pattern fluoroscopici hanno lo stesso tempo di decadimento: quelli nucleari, ad esempio, durano meno degli altri, in quanto già dopo tre mesi l’intensità della loro fluorescenza mostra un’apprezzabile degradazione.

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(B)

Fig.10 Controllo interno IFI di membrana nucleare (A) e di cute (B)

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5. RISULTATI

Il 1 Gennaio 2014 è stato introdotto il microscopio a fluorescenza automatizzato EUROPattern Suite per la lettura del test ANA nella routine dell’attività del Settore di Allergologia e Autoimmunità del Laboratorio Unico AUSL Romagna.

EUROPattern Suite standardizza e facilita l’analisi del Test ANA/ANA-reflex attraverso l'automazione della lettura e la proposta d’interpretazione dell’immunofluorescenza.

Lo strumento elabora i risultati velocemente: queste caratteristiche sono di cruciale importanza per garantire un elevato standard di qualità in un Laboratorio di riferimento come quello dell’AUSL Romagna in cui arrivano quasi 30000 richieste di test ANA ogni anno.

Durante i primi tre anni di utilizzo di tale tecnologia sono pervenute 48560 richieste di test ANA e 35659 di test ANA-reflex, per un totale di 84201 campioni analizzati almeno per un esame.

Nell’ambito del test ANA, si sono osservati 22494 campioni negativi, 4734 campioni debolmente positivi e 8431 campioni positivi, mentre per il test ANA-reflex i casi negativi sono stati 30442, quelli debolmente positivi 6730 e quelli positivi 11388 (Fig.11).

Fig.11. Richieste pervenute al Settore di Allergologia e Autoimmunità del Laboratorio Unico AUSL Romagna nel triennio 2014-2016

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Da quest’analisi preliminare si nota subito chiaramente come la percentuale di richieste in cui è stata riscontrata una significativa positività rappresenta solo il 23,5% del totale (23,6% per il test ANA e 23,5% per il test ANA-reflex) . Andando a scomporre tale dato nei singoli anni di attività si nota una crescente aumento di determinazioni ANA-reflex, come atteso, soprattutto da parte dei medici curanti di base.

L’analisi dei pattern fluoroscopici mostra che la positività speckled è quella più diffusa (53.1% nel test ANA, 54.6% nel test ANA-reflex) seguita dal pattern omogeneo (26.8% nel test ANA, 27.0% nel test ANA-reflex), poi quello nucleolare (12.4% nel test ANA, 11.7% nel test ANA-reflex), centromerico (3.8% nel test ANA, 3.3% nel test ANA-reflex), nDOT ( 2.8% nel test ANA, 2.0% nel test ANA-reflex), ed infine positività della membrana nucleare ( 1.1% nel test ANA, 1.0% nel test ANA-reflex) (Fig.12,13). Sono stati inoltre identificati pattern rari (ribosomiale, M.body), la cui gestione varia caso per caso. Possiamo comunque dire che tali pattern non sono generalmente accompagnati da test di approfondimento, in quanto il target antigenico non è noto o non è confermabile con test specifici.

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Fig.13. Grafico dei pattern fluoroscopici per il test ANA-reflex nel triennio 2014-2016

La tecnologia EuroPattern Suite, insieme all’utilizzo del sistema gestionale PPM, che consente un agevole controllo del flusso di lavoro da e per le piattaforme analitiche in uso, e il richiamo del dato storico, ha permesso ai due dirigenti del settore di Allergologia e Autoimmunità del Laboratorio AUSL Romagna una gestione efficace delle 84201 richieste di test ANA/ANA-reflex pervenute in tre anni e una puntuale elaborazione del referto (tempo massimo di refertazione 5-6 giorni).

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6. CONCLUSIONI

Gli autoanticorpi, e in particolare gli anticorpi contro le componenti nucleari della cellula (ANA) sono biomarcatori informativi per le malattie autoimmuni.

Negli ultimi 60 anni sono stati sviluppati numerosi metodi per individuare gli ANA ed altri autoanticorpi nei sieri dei pazienti. Poiché tali metodi differiscono sensibilmente per quel che concerne il profilo antigenico, la sensibilità e la specificità, si è ritenuto necessario standardizzare l’applicazione del test e l’interpretazione dei risultati.

L'attuale gold standard per lo screening ANA è l'immunofluorescenza indiretta (IFI) sulle cellule epiteliali umane (HEp-2), come affermato dall’American College of Rheumatology nel 2009. In tal caso le linee guida internazionali regolamentano tutti gli step della metodica: il substrato, la preparazione e l’incubazione dei vetrini, fino alla lettura e all’interpretazione degli stessi (Agmon-Levin et al. 2014).

La tecnica di IFI convenzionale, tuttavia, richiede tempo e l’interpretazione del pattern fluoroscopico risente della soggettività del personale dirigente di laboratorio addetto alla lettura delle immagini in fluorescenza. Ciò comporta un'alta variabilità inter- laboratoristica.

Nei Laboratori cosiddetti centralizzati, o unici, o metropolitani, l’ automazione dell’IFI (sia come preparazione dei vetrini che come prima lettura delle immagini) diventa un prezioso supporto nella determinazione degli autoanticorpi, al fine di garantire una diagnostica il più possibile oggettiva su ampie casistiche.

Nell’ultimo decennio sono state sviluppate molteplici piattaforme per l'automazione dell’immunofluorescenza indiretta, diverse tra loro per funzionalità e tipologia di applicazioni, che hanno agevolato e standardizzando la diagnostica ANA in numerosi laboratori in tutto il mondo (Tozzoli et al. 2013), (Bizzaro et al. 2014), (Pier Luigi Meroni et al. 2014). Tali tecnologie si basano sull'acquisizione digitale automatizzata di immagini IFI, che vengono visualizzate sul monitor del computer, in alta qualità, e combinate con algoritmi per una interpretazione preliminare (Krause et al. 2015).

Affinche’ l'automazione della lettura IFI sia vantaggiosa, però, essa deve garantire: lettura affidabile delle immagini fluorescenti nella routine clinica, precisione dei risultati elaborati dal software rispetto all'osservazione visiva classica da parte di un esperto, funzionamento efficiente e robusto, velocità e semplicità nel consultare e confrontare le immagini di archivio (Gerlach et al. 2015).

In questo lavoro di tesi sono stati riportati i dati raccolti nell’arco di tre anni (2014-2016) di utilizzo del sistema di automazione IFI EUROPattern Suite nel Settore di Allergologia e Autoimmunità del Laboratorio Unico AUSL Romagna.

EUROPattern-Suite è un sistema di microscopia per la lettura dell’ immunofluorescenza che combina diversi moduli hardware, quali microscopio, rack portavetrini e computer, e un modulo software per l'acquisizione e la valutazione di immagini in IFI, in modo completamente automatizzato. EUROPattern-Suite discrimina in modo rapido ed affidabile i risultati positivi e

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quelli negativi di su cellule HEp-2 (e HEp-20-10); inoltre garantisce il riconoscimento automatico e accurato dei diversi pattern fluoroscopici e la stima dei rispettivi titoli anticorpali, sia singoli che misti.

Il tipo di pattern e la titolazione proposti dal software devono essere convalidati dal personale dirigente di laboratorio che può facilmente visionare le immagini sullo schermo del computer. I risultati potranno poi essere ricontrollati facilmente a distanza di anni.

L’utilizzo della piattaforma EUROPattern Suite nella routine del Settore di Allergologia e Autoimmunità del Laboratorio Unico AUSL Romagna ha messo in luce i numerosi vantaggi che tale lettura automatizzata offre rispetto a quella manuale tradizionale:

i. Maggiore standardizzazione del dato, grazie ad un grado elevato di sensibilità analitica e riproducibilità;

ii. Maggiore velocità di refertazione, con la possibilità di lettura fino a 500 vetrini in 2,5 ore; iii. Maggior accuratezza nel seguire l’andamento sieroimmunologico dei pazienti, grazie alla possibilità di aprire sullo schermo di EUROPAttern Suite lo storico del singolo paziente e controllare il pattern e il titolo anticorpale nelle varie sedute di analisi;

iv. Archiviazione di tutte le immagini acquisite da EurolabOffice, che risultano poi essere facilmente consultabili e confrontabili anche a distanza di anni.

Dall’inizio del 2014, quando il microscopio EUROPattern Suite è entrato nel Laboratorio Unico AUSL Romagna, le applicazioni sono state ulteriormente ampliate. Oggi esso offre anche la rilevazione e il riconoscimento sia degli ANCA su granulociti umani, sia degli anticorpi anti-dsDNA su Crithidia luciliae.

La rilevazione di autoanticorpi contro granulociti neutrofili (ANCA) e di anticorpi anti-doppio filamento di DNA (anti-dsDNA) sono di prezioso aiuto per la diagnosi di vasculiti primitive sistemiche e di LES, rispettivamente (Radice, Bianchi, and Sinico 2013).

Entrambi i test, per i quali la preparazione dei vetrini è già automatizzata, verranno a breve introdotti nella programmazione di EUROPatter Suite. Seguirà un periodo di valutazione della robustezza dell’algoritmo di lettura sia in termini di sensibilità che di specificità.

Proprio a seguito dello sviluppo di tecnologie innovative come quella sopradescritta, in associazione con l’introduzione di nuovi test diagnostici, i laboratori di Autoimmunità hanno visto negli ultimi anni un incremento dell’attività e un ampliamento dell’offerta diagnostica. Di conseguenza, il personale di laboratorio si ritrova a lavorare in ambiti clinico-diagnostici dai contorni ‘sfumati’ e intedisciplinari. Inoltre, nel Laboratorio di Autoimmunità si utilizzano metodiche in grado di identificare plurispecificità autoanticorpali, quali l’immunofluorescenza indiretta, le metodiche di blot e i sistemi multiplex. Ciò comporta anche la possibilità di rilevare anticorpi non richiesti e quindi non attesi, con la necessità di gestire il dato casualmente riscontrato (Tozzoli, R , Bizzaro, N, Villalta, D, Tonutti 2016). La possibilità da parte dei dirigenti del laboratorio di procedere con test supplementari sulla base delle informazioni ottenute dai test

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di primo livello, e alla luce delle informazioni cliniche fornite dal medico curante, diventa indispensabile.

Da qui l’esigenza di introdurre precisi algoritmi nei percorsi diagnostici, quali, ad esempio, l’ANA-reflex.

Il 12 Ottobre 2012, il Laboratorio Unico AUSL Romagna è stato il primo in Italia ad inserire tale determinazione nella propria lista di esami disponibili, inizialmente in fase sperimentale per i pazienti interni. A metà del 2013 l’ANA-reflex è stato reso disponibile a tutti, e approvato come algoritmo semplificato secondo le Linee Guida regionali.

L’ANA reflex garantisce il miglior iter diagnostico, sia perché prevede l’esecuzione di test appropriati e guidati da personale altamente specializzato, sia perché il relativo referto è spesso accompagnato da indicazioni sul significato dei risultati, di grande aiuto soprattutto per i medici non specialisti e i clinici non reumatologi. D’altro canto, però, l’elaborazione di un corretto ed efficace referto, implica che il dirigente di laboratorio dovrebbe conoscere la clinica del soggetto sottoposto all’esame. Di conseguenza, diventa essenziale una stretta collaborazione tra i medici clinici e i medici e i biologi di laboratorio: solo in questo modo quest’ultimi riusciranno ad inserire i risultati degli esami in un preciso contesto e dare un’interpretazione organica ai singoli valori che presi a se stanti potrebbero essere parziali e talvolta fuorvianti.

Da queste considerazioni, il Laboratorio Unico AUSL Romagna ha richiesto fermamente la possibilità di visionare la cartella clinica dei pazienti per cui si richiede il test ANA/ ANA-reflex così come gli esami specialistici.

A compendio di ciò sarebbe auspicabile implementare i software gestionali EUROlabOffice e PPM in modo da poter inserire delle parole chiave, quali ad esempio il nome di una specifica malattia, e associarla al pattern fluoroscopico corrispondente. In tal modo si riuscirebbe facilmente ad elaborare statistiche mirate, essenziali per eseguire studi retrospettivi e di supporto all’attività di indagine delle patologie autoimmuni sistemiche.

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BIBLIOGRAFIA

Agmon-Levin, Nancy et al. 2014. “International Recommendations for the Assessment of Autoantibodies to Cellular Antigens Referred to as Anti-Nuclear Antibodies.” Annals of the Rheumatic Diseases 73(1): 17–23. http://ard.bmj.com/lookup/doi/10.1136/annrheumdis-2013-203863.

Bassetti, Danila. 2016. “LABORATORIO E MALATTIE REUMATICHE Dott. Danila Bassetti.” Struttura Sierologia e Autoimmunità Microbiologia e Virologia, Ospedale S. Chiara Azienda Provinciale Servizi Sanitari – TRENTO: 1–4.

Bizzaro, Nicola et al. 2014. “Automated Antinuclear Immunofluorescence Antibody Screening: A

Comparative Study of Six Computer-Aided Diagnostic Systems.” Autoimmunity Reviews 13(3): 292– 98. http://dx.doi.org/10.1016/j.autrev.2013.10.015.

Chan, Edward K L et al. 2015. “Report of the First International Consensus on Standardized Nomenclature of Antinuclear Antibody HEp-2 Cell Patterns (ICAP) 2014-2015.” Frontiers in Immunology 6(JUL): 1–13.

Cozzani, Emanuele, Massimo Drosera, Giulia Gasparini, and Aurora Parodi. 2014. “Serology of Lupus Erythematosus: Correlation between Immunopathological Features and Clinical Aspects.” Autoimmune Diseases 2014.

Euroimmun. 2005. “Istruzioni per L ’ Uso.” 49(4298): 1–16.

Fritzler, Marvin J. 2016. “Choosing Wisely: Review and Commentary on Anti-Nuclear Antibody (ANA) Testing.” Autoimmunity Reviews 15(3): 272–80. http://dx.doi.org/10.1016/j.autrev.2015.12.002. Fritzler, Marvin J, and Mark L Fritzler. 2006. “The Emergence of Multiplexed Technologies as Diagnostic

Platforms in Systemic Autoimmune Diseases.” Current medicinal chemistry 13(21): 2503–12. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17017907.

Gerlach, Stefan et al. 2015. “Automated Evaluation of Crithidia Luciliae Based Indirect

Immunofluorescence Tests: A Novel Application of the EUROPattern-Suite Technology.” Journal of Immunology Research 2015.

Iaccarino, Luca et al. 2014. “The Clinical Features, Diagnosis and Classification of Dermatomyositis.” Journal of Autoimmunity 48–49: 122–27.

Konstantinov, Konstantin N., and Robert L. Rubin. 2017. “The Universe of ANA Testing: A Case for Point-of-Care ANA Testing.” Autoimmunity Highlights 8(1): 17–20.

Krause, C et al. 2015. “EUROPattern Suite Technology for Computer-Aided Immunofluorescence Microscopy in Autoantibody Diagnostics.” Lupus 24: 516–29.

Lancaster, Eric, and Josep Dalma. 2013. “NIH Public Access.” 8(7): 380–90.

Lega, Jean Christophe et al. 2014. “The Clinical Phenotype Associated with Myositis-Specific and Associated Autoantibodies: A Meta-Analysis Revisiting the so-Called Antisynthetase Syndrome.” Autoimmunity Reviews 13(9): 883–91. http://dx.doi.org/10.1016/j.autrev.2014.03.004.

Mahler, Michael, and Marvin J. Fritzler. 2010. “Epitope Specificity and Significance in Systemic Autoimmune Diseases.” Annals of the New York Academy of Sciences 1183: 267–87.

———. 2012. “The Clinical Significance of the Dense Fine Speckled Immunofluorescence Pattern on HEp-2 Cells for the Diagnosis of Systemic Autoimmune Diseases.” Clinical and Developmental Immunology 2012.

(33)

Mehra, Sonal. 2013. “Autoantibodies in Systemic Sclerosis.” Autoimmunity Reviews 12(3): 340–54. http://dx.doi.org/10.1016/j.autrev.2012.05.011.

Meroni, P. L., and P. H. Schur. 2010. “ANA Screening: An Old Test with New Recommendations.” Annals of the Rheumatic Diseases 69(8): 1420–22. http://ard.bmj.com/cgi/doi/10.1136/ard.2009.127100. Meroni, Pier Luigi et al. 2014. “Automated Tests of ANA Immunofluorescence as Throughput

Autoantibody Detection Technology: Strengths and Limitations.” BMC Medicine 12(1): 38. http://bmcmedicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/1741-7015-12-38.

Nifli, Artemissia Phoebe et al. 2006. “Comparison of a Multiplex, Bead-Based Fluorescent Assay and Immunofluorescence Methods for the Detection of ANA and ANCA Autoantibodies in Human Serum.” Journal of Immunological Methods 311(1–2): 189–97.

Radice, Antonella, Laura Bianchi, and Renato Alberto Sinico. 2013. “Anti-Neutrophil Cytoplasmic Autoantibodies: Methodological Aspects and Clinical Significance in Systemic Vasculitis.” Autoimmunity Reviews 12(4): 487–95. http://dx.doi.org/10.1016/j.autrev.2012.08.008. Roggenbuck, Dirk et al. 2012. “Antiphospholipid Antibody Profiling - Time for a New Technical

Approach?” Autoimmunity Reviews 11(11): 821–26. http://dx.doi.org/10.1016/j.autrev.2012.02.016. Salamunić, Iilza. 2010. “Biochemia Medica.” Biochemia Medica 20(1): 1–5.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3900055/pdf/biochem_med-22-3-271-1.pdf.

Salant, David J. 2010. “M-Type Phospholipase A2 Receptor as Target Antigen in Idiopathic Membranous Nephropathy.” The New England Journal of Medicine 361(1): 11–21.

Solomon, Daniel H., Arthur J. Kavanaugh, and Peter H. Schur. 2002. “Evidence-Based Guidelines for the Use of Immunologic Tests: Antinuclear Antibody Testing.” Arthritis & Rheumatism 47(4): 434–44. http://doi.wiley.com/10.1002/art.10561.

Tonutti, Elio et al. 2015. “Il Test ANA-Reflex.” La Rivista Italiana della Medicina di Laboratorio - Italian Journal of Laboratory Medicine 11(3): 171–75. http://link.springer.com/10.1007/s13631-015-0092-4. Tozzoli, R , Bizzaro, N, Villalta, D, Tonutti, E. 2016. Il Laboratorio Nelle Malattie Reumatiche

Autoimmuni.

Tozzoli, Renato et al. 2013. “Current State of Diagnostic Technologies in the Autoimmunology Laboratory.” Clinical Chemistry and Laboratory Medicine 51(1): 129–38.

Verschuuren, Jan J G M et al. 2013. “Pathophysiology of Myasthenia Gravis with Antibodies to the Acetylcholine Receptor, Muscle-Specific Kinase and Low-Density Lipoprotein Receptor-Related Protein 4.” Autoimmunity Reviews 12(9): 918–23. http://dx.doi.org/10.1016/j.autrev.2013.03.001. Vincent, Angela. 2013. “Developments in Autoimmune Channelopathies.” Autoimmunity Reviews 12(6):

678–81. http://dx.doi.org/10.1016/j.autrev.2012.10.016.

Wiik, Allan S et al. 2004. “Cutting Edge Diagnostics in Rheumatology: The Role of Patients, Clinicians, and Laboratory Scientists in Optimizing the Use of Autoimmune Serology.” Arthritis and rheumatism 51(2): 291–98.

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