Il supporto del laboratorio di autoimmunità nella diagnosi delle Malattie Autoimmuni
Intra Jari 26 Novembre 2020
Autoimmunità
Risposta immune verso Antigene self dovuta alla scomparsa della tolleranza immunologica
Malattia autoimmune
condizione patologica dovuta alla scomparsa della tolleranza immunologica con conseguente formazione di auto-Ab e/o cellule immunitarie reattive
Disordine del sistema immunitario che non riconosce più le proprie
strutture cellulari e tissutali e produce anticorpi diretti contro di esse.
Le M.A. rappresentano ancora oggi uno dei problemi più spinosi dell’immunologia sia sul piano laboratoristico che sul piano clinico.
Le conoscenze attuali sui meccanismi coinvolti sono ancora incomplete e di conseguenza l’eziologia è spesso ignota.
Sono malattie per lo più multifattoriali, in quanto nella loro patogenesi intervengono fattori di predisposizione genetica e fattori ambientali.
Sono state individuate circa 80 M.A. alcune conosciute e comprese, altre rare e difficili da diagnosticare.
Possono colpire qualsiasi organo e a seconda dove si verifica la reazione immunitaria
vengono suddivise in:
- ORGANO SPECIFICHE
un solo organo colpito - SISTEMICHE:
coinvolti piu' organi
L'Iceberg epidemiologico delle M.A.
Si stima che per ogni forma di patologia autoimmune conclamata ve ne siano presenti 5-10 casi pre-clinici asintomatici.
La prevalenza delle MA è in aumento grazie al miglioramento delle tecniche diagnostiche = aumento delle diagnosi.
Si ritiene che per ogni caso clinicamente diagnosticato ve ne siano almeno 3/4 non diagnosticati (sottostima).
I soggetti malati sintomatici costituiscono la
componente minore dell’iceberg: quella emersa dall’acqua.
Si calcola questa patologia riguardi il 2% della popolazione mondiale.
forme cliniche:
autoAb +
danno tissutale + funzionalità alterata soggetto malato forme sub-cliniche:
autoAb +
danno tissutale +
funzionalità normale (compenso) soggetto “apparentemente sano”
forme pre-cliniche:
autoAb +
danno tissutale - funzionalità normale soggetto “sano”
Iceberg epidemiologico delle M.A.
DIAGNOSTICA DI LABORATORIO DELLE M.A.
✓ INDICI IMMUNOLOGICI
✓ INDICI DI FLOGOSI
✓ INDICI DI LESIONE CITO-TISSUTALE
INDICI IMMUNOLOGICI
▪ AUTOANTICORPI CIRCOLANTI
▪ ATTIVAZIONE DEL SISTEMA IMMUNITARIO
▪ PREDISPOSIZIONE GENETICA
Indici di flogosi
1.
VES
2.
PCR
DIAGNOSTICA DI LABORATORIO DELLE M.A.: AUTOANTICORPI CIRCOLANTI
✓ NON INDICA L’ANDAMENTO DELLA MALATTIA
✓ RICHIEDE ESPERIENZA (IN PARTICOLARE PER L’INTERPRETAZIONE DEI QUADRI DI FLUORESCENZA AL MICROSCOPIO )
✓ PREZIOSA PER LA DIAGNOSI CLINICA
✓ DA CORRELARE SEMPRE AL QUADRO CLINICO
Elenco esami di Autoimmunità
Ab anti-mieloperossidasi Ab anti-perossidasi3
Ab anti-citoplasma dei neutrofili Ab anti-saccaromyces cerevisiae Ab anti-immuno complessi circolanti
Ab anti-antigeni nucleari estraibili
Ab anti-SSA Ab ant-Ro52 Ab anti-SSB Ab anti-Scl70 Ab antit-Jo1 Ab anti-PCNA
Ab anti-ribonucleoproteine Ab anti-Sm
Ab anti-iston Ab ant-nucleosoma Ab anti-ribosomi Ab anti-DFS70
– Lo scenario strumentale in Autoimmunità:
• Immunofluorescenza – Euroimmun:
Malattie sistemiche LES
Artrite reumatoide Sindrome di
Sjögren Sclerodermia.
Sindrome di Reiter Sclerosi multipla
SUBSTRATI
Hep-2 di linea cellulare epiteliale di carcinoma laringeo con cellule a diversi stadi del ciclo cellulare
Struttura molto complessa con
molti componenti e numerosi
potenziali antigeni
IMMUNOFLUORESCENZA INDIRETTA
Antigene nel Substrato cellulare
Anticorpo del siero del paziente non marcato Anti-IgG umani marcati
con coloranti fluorescenti
Diagnostica di Laboratorio
MICROSCOPIO OTTICO A FLUORESCENZA
FLUORESCENZA, PERCHE’?
Normalmente i componenti cellulari non sono fluorescenti
molecole marcate con fluorocromi mostrano la localizzazione cellulare di molecole
specifiche
Utili per osservare il loro percorso in cellule vive
IF molto sensibile (osservazione in ambiente
buio e fondo nero)
LUCE E MOLECOLE FLUORESCENTI
Luce incidente
Molecola fluorescente assorbe luce
a lunghezza d’onda specifica
Stato
d’eccitazione
Stato normale
Emissione di
luce
FLUOROCROMI
FLUOROCROMO FILTRI
ECCITAZIONE FILTRI
EMISSIONE
Acridine Orange 503 nm 530/640 nm
Fluorescein isothiocyanate
495 nm 519 nm
Rhodamine 570 nm 576 nm
DAPI 345 nm 455 nm
Ethidium
bromide 493 nm 620 nm
Hoechst 33258 345 nm 478 nm
• Chemiluminescenza -Werfen (IL):
• Principio della Chemiluminescenza, CLIA:
• vengono impiegate cartucce contenenti microparticelle magnetiche ricoperte da Antigeni specifici
• si mescolano e si incubano (37°c) con il campione: se sono presenti Ab specifici questi ultimi si legano agli Antigeni che ricoprono le
microparticelle
• viene eseguita una separazione magnetica ed un lavaggio volto ad eliminare il campione residuo
• si aggiunge un tracciatore (Ab marcati con isoluminolo) che si unisce agli Ab specifici catturati dalle microparticelle
• dopo una seconda incubazione (37°c), separazione magnetica e ulteriore lavaggio, si aggiungono i reagenti che attivano la reazione chemiluminescente
• un luminometro misurerà la luce emessa in “unità relative di luce”
(URL), direttamente proporzionali alla concentrazione di Ab specifici del campione
• attraverso apposita curva di calibrazione le URL vengono trasformate in “unità di chemioluminescenza” (CU): unità di misura dei test CLIA
• Immunoblotting - Euroimmune
• Immunoblot Euroimmun
• Elisa- Werfen
UNA SOLA PROVETTA (siero)
PER TUTTI I TEST
Ricerca degli autoAb anti-nucleo (ANA)
TEST DI II LIVELLO NELLE M.A. SISTEMICHE:
ENA, DNA (connettiviti)
CCP (artrite reumatoide)
ANCA (vasculiti)
ANTI-FOSFOLIPIDI (cardio+beta2glicoI)
Il riscontro di positività indirizza i successivi test diagnostici da dosare, secondo algoritmi diagnostici consolidati
Ricerca degli autoAb anti-ENA
La loro presenza caratterizza il profilo sierologico della malattia.
Gli ENA sono Ag nucleari:
- proteine associate al DNA (istoni, Ag Scl-70, PCNA,KU, proteine centromeriche) - proteine associate all’RNA (U1RNP, Sm, RNA-polimerasi1, SSA Ro 52 e SSA 60,
SS-B, Jo1, PL-7,PL-12, RNP ribosomiali);
- citoplasmatici.
Hanno notevole significato diagnostico e prognostico, compaiono precocemente.
Il risultato si esprime com Pos/Neg; solo per Sm e Scl70 si puo' procedere a quantificazione in CLIA (significato clinico)
Metodo:
CLIA come test di screening, comprende un mix dei 7 Ag principali:
SSA-52,SSA-60, SSB, RNP, Sm, Jo1 e Scl-70.
se positivo si procede con l'identificazione del singolo autoAb con l' Immunoblot.
Significato diagnostico degli autoAb anti-ENA
⚫ autoAb anti-SSA52+SSa60: Sindrome di Sjogren, LES
⚫ autoAb anti-SSA52: Sindrome di Sjogren, blocco atrio-ventricolare congenito (possono essere trasmessi al feto attraverso la placenta e semplice reazione infiammatoria o causare blocco cardiaco congenito nel neonato)
⚫ autoAb anti-SSA60: LES
⚫ autoAb anti-SSB: si ritrovano praticamente solo in donne affette da Sindrome di Sjogren o da LES
⚫ autoAb anti-Scl70: nel 30-40% dei pazienti affetti da sclerodermia sistemica progressiva
⚫ autoAb anti-Jo1: nel 50% dei pazienti affetti da dermato/polimiosite
⚫ autoAb anti-U1RNP: nel 90-100% della Connettivite Tissutale Mista
⚫ autoAb anti-Sm: LES
Significato diagnostico degli autoAb anti-DNA, anti-Istoni e anti-Nucleosoma
Gli autoAb anti-DNA si ritrovano esclusivamente in casi di LES Lo screening viene effettuato in CLIA mentre, il test
di conferma/riferimento in caso di positiv ità dello screening è rappresentato dall’IFI con Chrithidia Lucilliae.
E’ possibile identificarli anche in IB.
Il rilievo di un brusco aumento di autoAb anti-DNA é segno prognostico sfavorevole.
Crithidia luciliae
Crithidia luciliae
Un campione è positivo se il kinetoplasto è più fluorescente
del controllo negativo (anti ds-Dna detection)
Gli autoAb anti-nucleosomi sono presenti nel 100% dei pazienti affetti da LES ed in particolare durante la fase attiva della malattia.
Compaiono prima della manifestazione dei sintomi tipici di LES e sono marker più precoce rispetto agli autoAb anti-DNA.
Si ritiene che il dosaggio degli autoAb anti-nucleosomi possa affiancare ma non sostituire il dosaggio degli autoAb anti-DNA nella diagnosi di LES.
Metdo impiegato: IB.
MALATTIA CELIACA
Ricerca dei marcatori sierologi anticorpali e autoAb della malattia celiaca
Definizione: disordine immunitario sistemico, dovuto ad una suscettibilità individuale,
geneticamente determinata al glutine; caratterizzata dalla presenza di varie manifestazioni cliniche glutine-dipendenti, da autoAb specifici e dall’associazione con HLA-DQ2 o DQ8.
Gli autoAb sono di classe IgA:
-anti tTG IgA: compaiono solo nella malattia celiaca con una specificità del 100%
-autoAb anti-endomisio (EMA): hanno una specificità quasi del 100% e compaiono unicamente nella celiachia e nella dermatite erpetiforme che è un sintomo della malattia celiaca.
Minore è la specificità degli AGA IgA (80-95%) perchè sono presenti anche nei casi di intolleranza alle proteine del latte vaccino, nelle enteriti severe e in alcuni casi di malattie infiammatorie croniche dell’intestino.
Nei pazienti con deficit di IgA si ricorrere alla ricerca degli tTG IgG e AGA IgG.
Metodi:
Ema IgA : IFI
AGA IgA/IgG : Elisa
AGA IgA/IgG deaminata: CLIA
tTg IgA/IgG: CLIA
La Regione Lombardia nel 2011 ha reso obbligatorio l’attuazione del seguente algoritmo:
Ricerca dei marcatori sierologici autoAb delle malattie infiammatorie dell’intestino (IBD)
Le malattie infiammatorie dell’intestino (IBD) comprendono:
- colite ulcerosa (CU) - malattia di Crohn (CD).
I principali autoAb testati sono gli :
- auto Ab anti-Saccharomyces cerevisiae (ASCA)
- auto Ab anti-neutrofili (p-ANCA, c-ANCA e ANCA atipico)
Ricerca degli autoAb anti-citoplasma dei neutrofili (ANCA)
Gli ANCA sono autoAb rivolti contro Ag citoplasmatici dei granulociti neutrofili e importanti markers delle vasculiti
ANCA-POSITIVE (primarie sistemiche dei piccoli vasi)
Metodi impiegati:
IFI: pattern di positività c-ANCA e p-ANCA CLIA: MPO-PR3
Ricerca degli autoAb anti-peptide ciclico citrullinato (CCP)
Gli autoAb anti-CCP sono marker altamente specifici dell'artrite reumatoide (= 100%)
Metodo impiegato: CLIA
Ricerca degli autoAb anti-fosfolipidi
Gli autoAb anti-fosfolipidi (aPL) caratterizzano la sindrome da Ab anti-fosfolipidi (APS).
Criteri di Laboratorio per definire la APS:
-Positività persistente per autoAb anti-cardiolipina (ACA) e anti-β2glicoproteina I- dipendenti (anti-β2GPI) di classe IgG e/o IgM a titolo medio-elevato, riscontrata in due o più campioni distanziati di almeno 12 settimane
-Positività persistente per Lupus Anticoagulant (LAC) riscontrata in due o più occasioni ad almeno 12 settimane di distanza
Gli autoAb aPL sono riscontrabili nel LES e in molte altre manifestazioni di sistemiche:
-Cardiache: infarto del miocardio, patologia delle valvole -Neurologiche: ischemia cerebrale, corea, demenza
METODI:
CLIA: beta e cardiolipina
Ricerca dei marcatori sierologici per le malattie epatiche-autoimmuni (EAI)
⚫ Le due più importanti malattie epatiche sono:
⚫ - la cirrosi biliare primitiva (PBC)
⚫ - l'epatite autoimmune (EAI)
⚫ METODI:
⚫ IFI di: AMA, ASMA, LKM e ANCA;
⚫ Pannello SPECIFICO Ib
⚫
•Country Partner
• Belgium Ghent University Hospital
• Belgium University Hospital KU Leuven
• Belgium Université Catholique de Louvain (St Luc)
• Denmark Rigshospitalet University of Copenhagen
• France Hôpital Bicêtre
• France Hôpital Beaujon
• France Hôpital Saint-Antoine
• Germany University Hospital Aachen
• Germany Universitaetsklinikum Tübingen
• Germany Hannover Medical School
• Germany Universitaetsklinikum Hamburg- Eppendorf
• Germany Saarland University Medical Center
• Italy Azienda Sanitaria Socio Assistenziale (ASST)-Monza, Ospedale San Gerardo, prof.
Invernizzi Pietro
• Italy Azienda Ospedaliera - Universitaria di Padova
• Italy Azienda Sanitaria Socio Assistenziale (ASST)- Santi Paolo e Carlo
ERN RARE LIVER Current Membership
Netherlands University Medical Center Groningen
• Netherlands Radboud UMC
• Netherlands Academic Medical Centre, University of Amsterdam
• Poland Medical University of Warsaw Hospital
• Portugal Centro Hospitalar Universitario de Coimbra
• Spain Hospital Universitario La Paz
• Spain Hospital Clínic de Barcelona
• Sweden Karolinska University Hospital
• Sweden Sahlgrenska University Hospital
• UK Birmingham Children's Hospital NHS Foundation Trust
• UK University Hospitals Birmingham NHS Foundation Trust
• UK Royal Free London NHS Foundation Trust
• UK The Newcastle upon Tyne Hospitals NHS Foundation Trust
European Reference Networks
IL MOSAICO DELL'AUTOIMMUNITA'
⚫ Piu'di una malattia AI puo' essere diagnosticata in uno stesso individuo
⚫ Diverse M.A.I. possono essere diagnosticate nell'ambito della stessa famiglia
