Valutazione della permeazione/penetrazione transungueale di Ciclosporina da formulazioni nanostrutturate

Dipartimento di Farmacia

Corso di Laurea Magistrale a Ciclo Unico in Farmacia

Tesi di Laurea:

“Valutazione della permeazione/penetrazione transungueale di

Ciclosporina da formulazioni nanostrutturate”

Relatori:

Candidato:

Dott.ssa Daniela Monti

Beatrice Bonsignori

Dott.ssa Silvia Tampucci

Dedico questa tesi

alla mia famiglia.

RIASSUNTO

L’obiettivo di questa tesi è stato la messa a punto di sistemi nanomicellari tensioattivi per la somministrazione transungueale di Ciclosporina A (CyA), farmaco immunosoppressore molto attivo nel trattamento della psoriasi ungueale. L’efficacia delle forme farmaceutiche, applicate topicamente sull’unghia, nelle patologie ungueali e periungueali dipende dalla capacità dell’attivo di interagire con la struttura ungueale, di accumularsi nella matrice e di passare al di là della barriera per raggiungere il letto ungueale in quantità terapeuticamente attiva. L’alto peso molecolare (PM=1202,6) e la natura lipofila (Log P = da 1,4 a 3,0) della CyA sono responsabili della sua bassa solubilità in acqua. Queste caratteristiche non agevolano il processo di diffusione del farmaco attraverso la matrice ungueale, costituita da una struttura compatta di numerosi strati di cellule cheratinizzate di natura prettamente idrofila (assimilabile ad un gel idrofilo) e nota per essere maggiormente permeabile a composti polari. I sistemi nanomicellari sono stati quindi scelti per le loro proprietà di favorire la solubilizzazione di farmaci poco solubili in acqua e l’incapsulamento di farmaci lipofili in modo tale da renderli più affini ad un substrato biologico idrofilo.

Le nanomicelle (Nano) contenevano ciclosporina A allo 0.1 e 0.3 % p/p e come tensioattivi una miscela di vitamina E-TPGS e IGEPAL® in rapporto 2.25:1 con una quantità totale di tensioattivi pari all’ 1% p/p nel caso delle formulazioni Nano1 e al 3.25% in quelle Nano3.25. La preparazione di formulazioni con differente composizione, Nano1CyA0.1 e Nano3.25CyA0.3, aveva lo scopo di mettere in luce la relazione esistente tra:

- concentrazione di tensioattivo ed efficienza di incapsulamento del farmaco - carico di farmaco e dimensione della nanomicella

- carico di farmaco nella formulazione e quantità di farmaco permeata nell’unità di tempo per unità di area attraverso la lamina ungueale bovina. Le nanomicelle sono state preparate anche in presenza di acido ialuronico (Nano1HA CyA0.1; Nano3.25HACyA0.3) per agevolare un intimo contatto tra la formulazione ed il substrato idrofilo e nel tentativo di rendere la forma nanostrutturata più stabile. La caratterizzazione delle nanomicelle dal punto di vista dimensionale è stato eseguita mediante il dynamic light scattering (DLS),

mentre il contenuto del principio attivo (entrapment) e la capacità di caricamento della formulazione sono stati determinati invertendo le nanomicelle in un solvente organico (acetonitrile o etanolo) per estrarre il farmaco dal nucleo. L’analisi quantitativa della ciclosporina A presente è stata effettuata mediante HPLC. Le formulazioni ottenute sono state utilizzate per gli studi in vitro di penetrazione in e permeazione attraverso lamine ungueali bovine utilizzando celle di diffusione verticali di tipo Gummer. La quantità di farmaco permeata è stata monitorata per 24/30h ore e determinata mediante analisi HPLC. Differenti fasi riceventi (acqua, acqua/Brij 98 allo 0,01% p/p e etanolo al 10%) sono state sottoposte allo studio per selezionare la fase ricevente più idonea a promuovere la permeazione in relazione alla bassa solubilità della CyA in acqua allo scopo di evitare fenomeni di saturazione che ostacolerebbero la diffusione del farmaco dalla fase donatrice a quella ricevente. L’addizione all’acqua di un cosolvente come l’etanolo o di un tensioattivo come il Brij per agevolare la solubilizzazione della ciclosporina non ha influenzato positivamente la permeazione (Brij) o l’ha addirittura ostacolata (etanolo). L’acqua, infine, appariva la scelta migliore con dati più riproducibili. Al termine delle prove di permeazione transungueale, la lamina ungueale bovina era rimossa dalle celle di diffusione, ripulita dall’eccesso di formulazione presente sulla superficie con acqua/etanolo e carta assorbente. Successivamente ogni lamina veniva sottoposta ad opportuno trattamento per estrarre il farmaco in essa presente. La metodica consisteva nel ridurre in piccoli frammenti ogni lamina, trattarla con MeOH tenendola in agitazione per 24 ore, prelevare il surnatante dopo centrifugazione e portarlo a secco Dopo essiccamento, il campione veniva ripreso con EtOH ed analizzato tramite HPLC.

Gli studi di permeazione hanno messo in evidenza che esiste una correlazione tra la velocità di permeazione e quantità di farmaco nella formulazione nanomicellare. L’acido ialuronico appare, in ogni caso, avere un effetto promotore ma solo sulla permeazione transungueale. L’analisi del contenuto di farmaco accumulato nell’unghia ha dimostrato che non c’è alcuna variazione significativa della quantità di farmaco accumulato nella membrana al variare della composizione della formulazione sia in termini qualitativi che quantitativi.

La stabilità a breve termine (24 e 48 ore) a temperature di 4°C (temperatura di stoccaggio), 20°C (temperatura ambiente) e 32°C (temperatura della superficie ungueale) è stata determinata per verificare la conservazione strutturale delle

nanomicelle mediante analisi dimensionale e analisi turbidimetrica, eseguendo la lettura spettrofotometrica in un intervallo tra 400 e 500 nm. È stato inoltre monitorato giornalmente il titolo delle nanomicelle per una durata di 7 giorni a 4°C mediante analisi HPLC. Dai risultati è emerso che il titolo delle nanomicelle era stabile a 4°C fino a 7 giorni senza segno di degradazione in tutte e 3 le formulazioni prese in considerazione; le nanomicelle inoltre sembrano mantenere la loro struttura nel tempo a 4°C e 20°C e 32°C fino a 48 ore, ad eccezione della formulazione Nano1HA0.1%CyA che in partenza si presentava limpida e diventava, a 32°C, torbida. In ogni caso la formulazione, lasciata a temperatura ambiente, impiegava 10 minuti a ritornare alle condizioni di partenza, tempo necessario alle nanomicelle per riformarsi (tempo di rigenerazione).

INDICE

1. Anatomia dell’unghia………...………..…..1

1.1. Struttura dell’unghia………..………..………..1

1.2. Crescita e ricrescita della lamina ungueale………....………..4

1.3. Composizione chimica dell’unghia…….………..………….….……5

2. La psoriasi e la psoriasi ungueale……….…….…...……..6

2.1 Le caratteristiche dell’unghia psoriatica……….………..8

3. Trattamento della psoriasi ungueale………..…………...10

3.1 Terapia sistemica………....………...11

3.2 Terapia topica……….……….………11

4. Permeazione transungueale………....…….………...……16

4.1 Unghia umana e fattori che influenzano la permeazione Transungueale .……….………..…….…….…16

4.2 Membrane ottenute da zoccolo bovino………..…..……...18

5. Penetrazione ungueale e tecniche di estrazione del farmaco della membrana ungueale.. ………..………..….….…19

6. Formulazioni ad applicazione ungueale……….…….21

7. Forme farmaceutiche nanostrutturate: Nanomicelle………...24

6.1 Nanomicelle tensioattive………...…………...…...……...24

6.2 Nanomicelle polimeriche………...…...26

6.3 Metodo di prepazione………....…...28

I. PARTE SPERIMENTALE………..………...…..……31

2. Materiali……….…….……...33

2.1 Ciclosporina (CyA)……….……….….………...33

2.2 Vitamina E-TPGS (VE-TPGS)………...…..34

2.3 L’igepal® _{CA-630 (OFPEE)……….…………...…...…...34}

2.4 Acido Ialuronico (HA)……….…..……….……...…….35

3. Metodi………..………...………..………...…..…...…36

3.1 Preparazione, caratterizzazione e valutazione della permeazione ungueale di CyA di formulazioni acquose nanostrutturate……...…..……....36

3.1.1 Preparazione delle nanomicelle contenenti CyA………..……..…..36

3.2 Caratterizzazione delle formulazioni .nanostrutturate ...……….…….…..36

3.2.1 Analisi dimensionale………..………..…...……..…...36

3.2.2 Entrapment e efficienza di incapsulamento....……….…37

3.2.3 Stabilità delle formulazioni nanostrutturate………...…...……37

3.3 Studi di permeazione transungueale da formulazioni nanostrutturate...38

3.4 Determinazione quantitativa di Ciclosporina A ...…...40

3.5 Determinazione quantitativa di Cya trattenuta dalla membrana alla fine degli esperimenti di permeazione……….40

4. Risultati e discussione……….……….…..42

5.Bibliografia……….……….….….…...…48

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1. ANATOMIA DELL’UNGHIA

1.1 Struttura dell’unghia

Fig. 1- Vista dorsale (A) e sagittale (B) del complesso ungueale

Le unghie umane sono lamine cornee disposte sulla superficie dorsale delle falangi terminali delle dita di mani e piedi; ricoprono una superficie cutanea, denominata letto ungueale, e sono circondate, sui lati e nella porzione prossimale, da una piega cutanea denominata vallo ungueale, distinto in plica ungueale prossimale e in plica ungueale laterale. (Fig.1)

L’estremità prossimale della lamina ungueale denominata radice dell’unghia, rimane sotto la plica prossimale e rappresenta circa un quarto della lunghezza totale della lamina ungueale.

In prossimità della radice, l’unghia ha un colore biancastro; questa regione, denominata lunula, ha la forma di mezzaluna ed è la porzione anteriore della matrice vista in trasparenza; è visibile soprattutto nel pollice, mentre nelle altre dita è spesso assente o talvolta ricoperta di cuticola.

La parte visibile della lamina ungueale è semitrasparente e permette di distinguere il colore del sottostante tessuto connettivo, ricco di vasi sanguigni.

Nella porzione distale del corpo dell’unghia si distingue la banda onicodermica (stretta banda trasversale, chiara, ambrata, traslucida, il cui spessore varia da 0.1 a 1mm) che corrisponde alla giunzione letto ungueale-iponichio ed è dovuta ad un ispessimento dell’epitelio ungueale.

La lamina ungueale è curva, ciò gli consente di essere incorporata nelle pliche ai margini prossimali e laterali, fornendo un forte attaccamento e rendendo il bordo libero uno strumento utile. Questa caratteristica è più marcata nelle dita delle mani.

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La superficie superiore è relativamente liscia e brillante; con un numero variabile di creste che cambiano con l'età. Nell'infanzia, ci sono spesso creste parzialmente oblique corti denominati spina di pesce (fig. 2). Con l'età, queste scompaiono e le creste longitudinali diventano più comuni. Queste creste sono sufficientemente specifiche per consentire la distinzione tra gemelli identici e per l'identificazione forense.

Fig. 2- Creste longitudinali nel bambino

La porzione distale dell’unghia sporge libera dal letto ungueale, cresce in lunghezza e può consumarsi gradatamente o essere asportata; la velocità di crescita della lamina ungueale viene monitorata tramite una semplice misura dell’allungamento longitudinale utilizzando la lunula o la piega prossimale dell’unghia come struttura di riferimento (David de Berker et.,2013).

La lamina ungueale è divisa in tre strati: dorsale, intermedio e ventrale (Fig 3).

Fig. 3 - sezione longitudinale della lamina ungueale

Lo strato superficiale o dorsale della lamina è costituito da piccole cellule cheratinizzate le cui membrane plasmatiche sono unite le une alle altre tramite giunzioni strette o tight junction (zonula occludente), regioni specializzate di contatto intercellulare dove i foglietti esterni delle membrane di cellule adiacenti si

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fondono. La stabilità della giunzione sembra mantenuta da proteine intrinseche di membrana capaci di interagire col citoscheletro (Molinaro et al., 1992).

La zona intermedia della lamina ungueale è costituita da cellule poliedriche la cui membrana plasmatica si interpenetra con le cellule vicine. Non sono presenti giunzioni occludenti, ma desmosomi puntiformi che rappresentano zone isolate di contatto in grado di mantenere le membrane cellulari adiacenti parallele e separate da uno spazio di circa 12-25nm. Le cellule, sotto la membrana, in corrispondenza del desmosoma, contengono un disco di materiale denso e fibroso detto placca, ed alcuni filamenti di cheratina detti tonofilamenti, che si inseriscono direttamente in ciascuna placca. I filamenti di cheratina si estendono all’interno della cellula formando cosi un’impalcatura citoplasmatica e costituiscono, insieme con un altro tipo di fibra intercellulare che connette le due metà del desmosoma, parte di una trama fibrosa che si estende attraverso l’intero strato ungueale e conferisce al tessuto la caratteristica rigidità (Avers et al.,1992)

Lo strato ventrale è formato da uno o due strati cellulari con qualche traccia di nucleo. Questo strato non è caratterizzato nell’ultrastruttura, se non da una vacuolizzazione estensiva delle cellule epiteliali (Proserpio et al.,1991).

In corrispondenza della parte prossimale del vallo ungueale è presente un’espansione dello strato corneo epiteliale, chiamata eponichio, formazione che deriva dalla plica ungueale prossimale e dalle pliche laterali ed è quindi costituita da un epitelio simile a quello della cute dorsale del dito, da cui si differenzia solo perché più sottile, privo di peli e con poche ghiandole sudoripare. La stessa area presenta inoltre la cuticola vera e propria che deriva dalla parte ventrale della plica ungueale prossimale ed è caratterizzata da un epitelio ancora più sottile di quello dell’eponichio, che non presenta creste epidermiche, papille dermiche o annessi. Nei punti in cui le pliche ungueale laterali si spingono all’interno dei solchi ungueali laterali, l’epidermide perde lo strato corneo e continua, sotto il corpo dell’unghia, formando il letto ungueale. In questa sede il derma è fuso con la membrana fibro-elastica che avvolge la falange: l’epidermide consiste di uno strato basale e di uno strato spinoso, mentre l’unghia sostituisce lo strato corneo. Sotto l’estremità libera dell’unghia, in corrispondenza dell’iponichio, riappare nuovamente lo strato corneo. La matrice è costituita da un tessuto epidermico altamente rigenerativo che ha origine da un’invaginazione dell’epidermide della regione dorsale delle dita

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e si estende sino alla porzione distale della lunula; è posizionata dietro al letto ungueale e dà origine all’unghia propriamente detta.

Fig. 4- Vista sagittale del complesso ungueale

La matrice quindi può essere considerata l’origine dell’unghia e in caso di trauma chirurgico e accidentale, una volta che si è verificato un danno della matrice, è difficile riparare in modo efficace (David de Berker et.,2013). È divisa in più porzioni in alcuni casi chiamate matrice prossimale e matrice distale, in altri, matrice dorsale, intermedia e del letto. (Proserpio et al.,1991)

La matrice ha la stessa struttura istologica dell’epitelio superficiale cutaneo e comprende: strato basale, strato intermedio e strato corneo. Contiene inoltre melanociti, cellule di Langerhans e cellule di Merkel. Le cellule di Langeranhans si trovano in posizione basale e superficiale, contengono tipici granuli e svolgono una funzione immunitaria. Le cellule di Merkel costituiscono dei recettori sensoriali, sono molto rare e sono state osservate solo nella matrice ventrale dell’alluce.

1.2 Crescita e ricrescita della lamina ungueale

L’unghia è formata dalla matrice in maniera continua, diversamente da quanto accade per i capelli che sono formati ciclicamente; la velocità di ricrescita dipende dal turnover cellulare. Le fasi della crescita sono molto variabili fra gli individui: in media si valutano in 3 mm mensili nelle unghie delle mani e 1 mm in quelle dei piedi. La normale crescita delle unghie delle mani si completa in circa 6 mesi, mentre quella dei piedi ha una durata di circa 18 mesi.

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Lo sviluppo dell’unghia è più rapido nel genere maschile, della mano dominante, in condizioni climatiche temperate, nel periodo di gestazione, nei soggetti affetti da onicofagia, onicolisi e psoriasi. Il tasso di crescita è inferiore negli anziani, in soggetti con alterata circolazione, affetti da infezioni acute e in terapia con farmaci antimicotici (Murdam,et al., 2002).

1.3

Composizione chimica dell’unghia

La composizione chimica dell’unghia umana differisce significativamente dagli altri corpi membranosi. Il costituente principale è rappresentato dalla cheratina, una scleroproteina contenente alte percentuali di solfuri. L’intera porzione cheratinica può essere distinta in una frazione “povera di solfuri” e una frazione amorfa, “ricca di solfuri”. La prima è costituita da proteine fibrose in cui tutta la catena polipeptidica presenta un tipo di struttura secondaria ad alfa-elica destrogira nella quale compaiono spesso sequenze periodiche di aminoacidi. Più catene polipeptidiche si uniscono a formare una struttura più complessa, una superelica levogira detta “protofibrilla” che è stabilizzata dalla presenza di ponti disolfuro tra le catene. La porzione ad alfa-elica costituisce circa il 33-55% dell’intera cheratina. Ogni filamento ha un diametro compreso tra 7 e 10 nm e diversi μm di lunghezza. Le protofibrille sono associate ad una matrice amorfa costituita da proteine aventi una struttura globulare ricca di legami a idrogeno; questi legami catalizzano il legame delle proteine globulari tra loro e con le protofibrille. Le analisi biochimiche hanno dimostrato che le unghie ed i capelli dell’uomo contengono gli stessi tipi di filamenti di cheratina, che non sono però presenti nell’epidermide cutanea (Marshall, 1983; Baden, 1973) perciò l’unghia viene generalmente considerata più simile ai capelli che alla cute. Tuttavia Lynch et al. (1986) ed Heid et al. (1988) hanno scoperto all’interno delle cellule ungueali l’esistenza di una percentuale pari al 10% di cheratina tipica delle cellule dell’epidermide. Studi seguiti da Kitarahara et al.(1993) hanno permesso di accertare che nella matrice ungueale si sviluppano cheratinociti analoghi a quelli della pelle e dei capelli: i cheratinociti analoghi a quelli della pelle sono stati localizzati principalmente nella matrice dorsale e intermedia, mentre quelli analoghi a quelli dei capelli prevalentemente in quelli del letto. Nella matrice ungueale sono inoltre presenti delle cellule non ancora differenziate che esprimono entrambi i tipi di cheratina. Le unghie umane

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contengono inoltre una discreta quantità di aminoacidi: ritroviamo una grossa quantità di acido glutammico, glicina, cisteina, arginina acido aspartico, serina e leucina. La presenza di ponti disolfuro, dovuti all’alto contenuto di cisteina, conferisce alla struttura cheratinica un eccezionale stabilità chimica e fisica. Ai ponti disolfuro si aggiungono legami secondari che includono forze di Van der Waals, legami a idrogeno e forze di Coulomb; queste ultime si generano a causa della presenza di gruppi amminici carichi positivamente e gruppi carbossilici caricati negativamente. Per quanto riguarda la componente lipidica, essa rappresenta meno del 5% del contenuto totale ed esiste sotto forma di fosfolipidi, di colesterolo (per la maggior parte), di acidi grassi saturi, di acidi grassi insaturi e di idrocarburi. La componente lipidica è importante per l’elasticità della lamina e per la coesione intercellulare.

Le unghie umane contengono inoltre grandi quantità di oligoelementi soprattutto S e N, mentre ridotta è la quantità di Ca, Mg, Na, K, Fe, Cu e Zn (Vellar, 1970) e di vitamine, in particolare vitamina A, C, E, H e vitamine del gruppo B. Inizialmente il calcio era ritenuto responsabile della durezza della lamina dorsale dell’unghia (Jarret, 1966). Attualmente si ritiene che questa caratteristica sia dovuta alla presenza dei legami disolfuro. Nell’unghia del pollice sono state ritrovate tracce di Cr, Se, Au, Hg, Ag e Co (Kanabrocki et al., 1979). Gli oligoelementi e le vitamine costituiscono le sostanze più importanti per una corretta crescita ungueale. La cheratina, una proteina fibrosa elicoidale, è il componente principale delle lamine ungueali umane.

2. LA PSORIASI E LA PSORIASI UNGUEALE

La psoriasi è una malattia infiammatoria cronica della pelle, non infettiva né contagiosa, solitamente di carattere cronico e recidivante. Nella sua patogenesi intervengono fattori autoimmunitari, genetici e ambientali. La psoriasi sembra inoltre essere correlata ad un aumentato rischio di malattie cardiovascolari (Boehncke et al., 2000) tra cui l'ictus e l'infarto del miocardio e trattare l'iperlipidemia dei pazienti correllata all'insorgenza di queste patologie può portare a un miglioramento delle manifestazioni psoriasiche (Xu et al., 2012; Kimball et al. 2010; Ghazizadeh et al. 2011). Poichè le unghie rappresentano le appendici dell'apparato epidermico, sono comunemente coinvolte nei pazienti affetti da

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psoriasi. È dimostrato da dati scientifici che l'80-90% di questi ultimi svilupperà probabilmente psoriasi ungueale come conseguenza della loro condizione patologica (Baran et al., 2010). Uno studio condotto nel 2010 su 3531 pazienti affetti da psoriasi ha mostrato che il coinvolgimento ungueale è prevalente negli uomini (11,2%). (Augustin et al., 2010). Anche fra i pazienti colpiti da artrite psoriasica (infiammazione cronica delle articolazioni colpite da psoriasi) il coinvolgimento delle unghie può essere molto elevato, fino all'80,5% (Brazzelli et al., 2012). Solo l'1%-5% dei pazienti affetti da psoriasi ungueale non presenterà nessun’altra malattia cutanea conclamata. Le unghie dei piedi e delle mani infatti possono rappresentare talvolta anche l'unica sede interessata dalla malattia: le parti dell’unghia maggiormente colpite da psoriasi sono la matrice, il letto e le pliche ungueali (Del Rosso 1997).Nonostante le sue implicazioni estetiche e funzionali, la psoriasi e ancora di più la psoriasi ungueale sono state trattate molto brevemente in letteratura e non sono molti gli studi che hanno indagato riguardo l'epidemiologia e le caratteristiche cliniche (Armesto et al.,2011 e Augustin et al. 2010). L'eziologia della psoriasi non è ancora completamente conosciuta, anche se alcuni dati a disposizione sembrano indicare un’origine polifattoriale. Attualmente sono due le ipotesi principali inerenti lo sviluppo della malattia.

La prima ipotesi considera la psoriasi come un disturbo di eccessiva crescita e riproduzione delle cellule della pelle. Il problema è semplicemente visto come un disturbo dell'epidermide e dei cheratinociti. La seconda ipotesi vede la malattia come un disordine immuno-mediato in cui l'eccessiva riproduzione delle cellule della pelle è secondaria a fattori prodotti dal sistema immunitario. I linfociti T, che assumono un ruolo centrale nell’ immunità cellulo-mediata, si attivano e migrano verso il derma, innescando il rilascio di citochine (in particolare il fattore di necrosi tumorale- TNF-α) che a loro volta causano infiammazione e riproduzione rapida di cellule della pelle. Non è ancora chiaro quali siano i fattori che innescano l'attivazione delle cellule T (Chandran et al., 2010; Zenz et al., 2005; de Cid et al., 2009).Poiché la psoriasi è una malattia cronica caratterizzata da periodi di remissione alternati a fasi di riacutizzazione, riconoscerne i fattori scatenanti è importante anche al fine di evitare abitudini e comportamenti che possano aggravare o indurre una ripresa della malattia. Sono stati riconosciuti come fattori scatenanti traumatismi, irritazione (Fiumara et al., 1976), esposizione prolungata agli UV-A e/o scottature solari, infezioni (Rosenberg et al. 1988; Rosen et al.

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1991), uso di determinati farmaci ed altri fattori come stress emotivi (Raychaudhuri et al. 2000) e fisici (Jankovic et al. 2009), xerosi, consumo di alcool e tabacco (Behnam et al., 2005; Naldi L.et al., 2006, Della Valle et al. 2005), obesità (Peserico et al. 2005), fattori psicosomatici (Gupta et al.,1990), cambiamenti di stagione o cambiamenti climatici e raramente l’ipocalcemia (Lee et al. 2005; Aksoylar et al., 2004; Maeda et al.,2003).

2.1

La matrice, il letto e le pliche delle unghie possono essere tutte zone colpite da psoriasi e l’area colpita influisce sui sintomi della malattia, che includono infossature, decolorazione, onicolisi, ipercheratosi subungueale dovuta alla deposizione e al raggruppamento di cellule che non hanno subito desquamazione sotto la lamina ungueale, anomalie della lamina ungueale, emorragie a scheggia e paronichia (Del Rosso, 1997).

La gravità della psoriasi ungueale dipende principalmente dalla parte dell’unghia interessata dal processo infiammatorio. I cambi più significativi sono osservati quando la patologia interessa la matrice ungueale, l’epitelio germinativo che produce la lamina ungueale. In questo caso i segni della psoriasi sono pitting, leuconichia, emorragie a scheggia, e caduta della lamina ungueale (Fig.5).

Fig. 5 Fig. 6

La psoriasi del letto ungueale invece produce una decolorazione a “macchia d’olio” ovale color salmone della lamina, ipercheratosi subungueale, emorragie a scheggia e onicolisi (Fig.6). Quest’ultimo sintomo può essere causato anche dalla psoriasi dell’iponichio. L’unghia affetta da psoriasi a livello delle pliche ungueali si manifesta invece attraverso la comparsa della paronichia che conduce alla rincalzatura della lamina ungueale. Quando la paronichia raggiunge una certa

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gravità, può essere danneggiata anche la matrice con conseguenti anomalie dell’unghia (Del Rosso, 1997 e Augustin et al.2010).

I sintomi più comuni che identificano l’unghia psoriasica sono i seguenti: • Pitting (Fig. 7):

Caratterizzato dalla comparsa sulla lamina ungueale di piccole depressioni cupoliformi, conseguenti ad un alterato processo di cheratinizzazione della lamina ungueale., Tale manifestazione clinica viene comunemente chiamata

unghia a ditale da cucito (Praveen et al., 2013) Fig. 7

• Linee di Beau (Fig. 8):

Caratterizzata dalla presenza di solcature trasversali ben definite conseguenti ad una ridotta attività della matrice prossimale. La solcatura trasversale non è altro che l'unione di tante singole depressioni cupoliformi (pitting) disposte

quasi tutte sulla stessa linea orizzontale. Fig. 8

Queste manifestazione sono tipiche dei soggetti con psoriasi ma possono comparire che in seguito a episodi febbrili insorti bruscamente. (Freedberg, et al. 2003).

• Leuconichia (Fig. 9):

Nota anche con il nome di unghia di Bean, caratterizzata dalla comparsa a livello della lamina ungueale di una o più chiazze di colore bianco (Freedberg, et al. ,2003).

Fig. 9 • Ipercheratosi:

Caratterizzata da un ispessimento dell’unghia di colore bianco-giallastro conseguente all'accumulo di squame al di sotto della lamina ungueale in prossimità del margine distale. L’ipercheratosi può essere parziale e localizzata oppure totale con conseguente scollamento dell'unghia dal letto. (Del Rosso, 1997)

10 • Onicolisi (Fig.10):

Caratterizzata da un'area di colorito giallastro, localizzata in prossimità del margine distale e laterale dell'unghia, spesso confusa con un'onicomicosi conseguente allo scollamento dell'unghia dal letto ungueale. (Freedberg; et al.

2003). Fig. 10 • Emorragie a scheggia:

Manifestazione che insorge in seguito a eventi traumatici con presenza di striature lineari e longitudinali all'asse maggiore della lamina ungueale, di colore rossoporpora (Cindy, 2011).

• Macchie di Gottron:

Caratterizzata dalla comparsa sulla lamina ungueale di chiazze singole o multiple, simili ad una macchia d'olio, di colore giallo o color salmone, proprio per questo chiamate macchie color salmone (Baran & Haneke, 2007).

Le manifestazioni ungueali sono quindi molteplici e differenti, possono essere presenti singolarmente oppure combinate tra loro nello stesso soggetto. Il polimorfismo clinico delle lesioni ungueali della psoriasi dipende dalla sede in cui insorge il problema. Una disfunzione transitoria e limitata della matrice ungueale risulta visibile dalle infossature, dalle macchie bianche e dai solchi trasversali, mentre una disfunzione più importante della matrice causa fragilità, fatiscenza e perdita dell’unghia.

3.TRATTAMENTO DELLA PSORIASI UNGUEALE

Per la cura della psoriasi si può ricorrere al trattamento sistemica oppure all’approccio topico che risulta non facilmente attuabile per la particolare composizione e struttura dell'unghia e la difficoltà dei farmaci di permeare attraverso tale barriera. La scelta della terapia topica o della terapia sistemica dipende dallo stadio della patologia e si ricorre alla via sistemica quando la malattia si manifesta in forma estremamente grave (Nast et al.,2011 e Cassel e Kavanaugh, 2007).

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3.1 Terapia sistemica

Il trattamento sistemico è raccomandato nella psoriasi ungueale avanzata quando la terapia topica o intralesionale non ha dato risultati oppure nel trattamento della psoriasi vulgaris da moderata a severa accompagnata con il coinvolgimento dell’unghia (De Simone et al, 2012). I retinoidi sono molti utilizzati, Vitamina A e derivati sono impiegati soprattutto per ridurre i problemi inerenti la cheratinizzazione (Tosti et al.,2009). La ciclosporina per via orale viene prescritta nei casi più gravi, in quanto ad essa sono associati numerosi effetti collaterali come sintomi gastrointestinali, aumento della pressione arteriosa, crampi, affaticamento, ridotta attività del sistema immunitario (Sanchèz-Regana et al., 2011). Nell'ultima decade l’introduzione di agenti biologici usati per il trattamento della psoriasi a placche e dell’artrite psoriasica ha portato una ulteriore alternativa sicura e altamente efficace per il trattamento delle patologie del letto ungueale e della matrice. Sono state introdotte terapie in grado di agire a livello di specifici targets come TNF-α, cellule T e B, varie citochine e enzimi chiave nei processi infiammatori ed autoimmuni utili per la psoriasi ungueale severa refrattaria. Alcuni esempi sono: infliximab, adalimumab, etanercept, golimumab alefacept, ustekinumab. (Smolen and Emery, 2011; Oram e Akkaya, 2013).

3.2 Terapia topica

La terapia topica consiste nell’applicazione sull’unghia e nella zona periungueale del principio attivo veicolato in opportune formulazioni.

Le forme farmaceutiche più rappresentate sono creme, unguenti, geli, lozioni, lacche, mousse, spray, paste e patches da applicare a seconda della localizzazione della lesione psoriasica sulla lamina e/o sulle pliche e/o sul letto dell’unghia. Creme, unguenti e geli, le tradizionali formulazioni, necessitano applicazioni frequenti e ripetute e tempo affinché la formulazione si asciughi e si assorba; Le lozioni invece sono soluzioni o dispersioni concentrate che possono contenere uno o più farmaci in un veicolo acquoso o idroalcolico che a loro volta possono produrre un film sulla lamina ungueale per evaporazione del solvente, permettendone una maggior permanenza sull'unghia. Gli smalti hanno invece il vantaggio di asciugare rapidamente appena applicati sulla lamina, lasciando un

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film sottilissimo, solitamente trasparente, a lunga tenuta e resistente all'acqua, esteticamente ben accettato. I patches adesivi invece costituiscono un vero e proprio sistema terapeutico in grado di rilasciare concentrazioni terapeutiche di farmaco in modo controllato limitando fortemente la necessità di applicazioni ripetute, peculiarità delle formulazioni tradizionali (Susilo et al.,2006). Quindi una formulazione ungueale ideale dovrebbe essere cosmeticamente accettabile ad esempio non creando disagi estetici o non interferendo con l'attività lavorativa, facile da applicare e da rimuovere ma allo stesso tempo deve permanere a lungo a livello della lamina in modo tale che non siano richieste frequenti applicazioni e soprattutto deve rilasciare il farmaco ed agevolare la permeazione all'interno dell'unghia (Murdan, 2007). A questo proposito, spesso le formulazioni ungueali possono contenere sostanze chiamate enhancer o promotori di permeazione in grado di aumentare la penetrazione/permeazione del farmaco all'interno dell'unghia quali 2-mercaptoethanol and N-acetyl-l-cysteine (Jiaravuthisan et al. 2007; Edwards and de Berker, 2009). Il trattamento terapeutico della psoriasi ungueale è spesso reso difficoltoso dal fatto che le lesioni psoriasiche non sono esposte, ma sono protette dai tessuti sovrastanti, ad esempio le lesioni che colpiscono la matrice intermedia sono nascoste dalla lamina e dalla plica ungueale prossimale, così come le lesioni a livello del letto sono coperte dalla lamina. Queste barriere rappresentano un notevole ostacolo al passaggio dei farmaci (Kruger et al.,2006). È pratica comune per agevolare la guarigione dell’unghia, effettuare alcune operazioni prima di applicare la formulazione: per esempio se è presente onicolisi, la lamina viene tagliata nel punto in cui si separa dal letto; talvolta la lamina ungueale viene avulsa mediante trattamento chimico e la formulazione viene applicata direttamente sul letto dell’unghia. Nella maggior parte dei casi il trattamento terapeutico viene effettuato in condizioni occlusive vale a dire si copre la formulazione applicata localmente con guanti di plastica o applicando dei cerotti occlusivi con l’unico obiettivo di alterare le proprietà di barriera della lamina ungueale aumentandone l’idratazione (Jiaravuthisan et al. 2007; Edwards and de Berker 2009).

Per quanto riguarda i principi attivi più comunemente usati nella terapia topica della psoriasi ungueale possiamo ricordare:

• Glucocorticosteroidi, come betametasone, clobetasolo proprionato, fluocinolone acetonide e triamcinolone acetonide. Sono stati e continuano ad

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essere i più comuni farmaci utilizzati nel trattamento della psoriasi per la loro azione antinfiammatoria e immunosoppressiva. Sono disponibili in commercio numerose formulazioni a base di soli steroidi (DIPROSONE® crema, unguento, gel e soluzione, Clobesol® crema o unguento, Localyn® crema, un'associazione di fluocinolone e neomicina), oppure in associazione con calcipotriolo (Dovobet ® gel e unguento) (Jiaravuthisan et al. 2007; Edwards and de Berker 2009). Numerosi studi sono stati eseguiti per la messa a punto di uno smalto ungueale a base di clobetasolo a partire dal 2005 quando Sanchez Regana et al.,2011 dimostrarono che l’applicazione di uno smalto all'8% di clobetasolo sull’unghia psoriasica di 10 pazienti provocava una forte riduzione del pitting, dell'onicolisi e delle macchie ad olio dopo 3 mesi di trattamento. Gli studi sono proseguiti anche valutando l’influenza della concentrazione del farmaco (0.05, 1.0 e 8.0%) sull’effetto terapeutico confermando l’efficacia e la sicurezza dello smalto contenente clobetasolo all’8% nel trattamento topico della psoriasi ungueale. Queste ricerche hanno dimostrato l’efficace penetrazione transungueale del farmaco e l’effetto terapeutico rivolto sia al letto ungueale che alle lesioni della matrice (Nakamura et al, 2012).

• Vitamina D3 e analoghi, come calcipotriolo (Daivonex®, 0.005%, unguento), tacalcitolo e calcitriolo (Silkis® unguento) (Jiaravuthisan et al. 2007; Edwards and de Berker 2009). L’applicazione di calcipotriolo 2 volte al giorno per 3-6 mesi nel trattamento della psoriasi ungueale si è dimostrato efficace soprattutto nella risoluzione dell’ipercheratosi con minimi effetti collaterali (Piraccini et al. 2001; Rigopoulos et al., 2002).

È comune usare questi due gruppi di sostanze in associazione usando ad esempio, analoghi della vitamina D3 durante la settimana e steroidi nel week-end. Il trattamento combinato con calipotriolo crema e clobetasolo ha dimostrato di ridurre la cheratosi subungueale del 72% in 6 mesi e del 81% dopo 12 mesi (Rigopoulos et al.,2008).

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Tazarotene: un retinoide topico con comprovata efficacia in onicolisi, pitting e ipercheratosi, è usato in gel o crema per un periodo di 12-24 settimane. Nel 2007 (Rigopolous et al 2008) hanno dimostrato con uno studio clinico su 46 pazienti trattati per 12 settimane che la crema di tazarotene (0.1%) ha lo stesso effetto della crema allo 0.05% di clobetasolo proprionato.

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Apremilast: un inibitore selettivo orale della fosfodiesterasi 4 (PDE4), indicata per il trattamento di psoriasi ungueale cronica da moderata a grave, nei pazienti adulti che non hanno risposto o che sono intolleranti ad altre terapie sistemiche tra cui ciclosporina, methotrexate o psoralen e luce ultravioletta A. Sono state preparate delle lacche ungueali utilizzando Eudragit® S100 come polimero e una miscela di etanolo, acetato di etile e acqua come solvente. Questa formulazione ha portato ad un notevole accumulo di farmaco nell'unghia tanto da renderla una valida opzione per il trattamento della psoriasi ungueale (Avadhesh Singh Kushwaha et al.,2017)

• L’urea e l’acido salicilico, talvolta vengono inseriti in formulazioni topiche come agenti cheratolitici che possono aiutare la permeazione del farmaco. L'urea, in particolare, viene tipicamente utilizzata nella cura della psoriasi ungueale a concentrazioni diverse e in diverse formulazioni: Onyster ® pasta al 40% viene utilizzata per ammorbidire l'unghia fino al punto che la sua rimozione risulti facile ed indolore, può essere usato in associazione ad altri trattamenti agevolando la permeazione nei tessuti sottostanti; .uno smalto al 15 %, come l'Onypso®, viene frequentemente prescritto nella psoriasi per la cura dell'ipercheratosi subungueale. L'acido salicilico invece si trova generalmente in associazione con altri farmaci dei quali facilità la permeazione per azione cheratolitica, ad esempio il Diprosalic® (associazione acido salicilico/ betametasone dipropionato) che può essere applicato sottoforma di unguento o di soluzione in base alle esigenze terapeutiche del paziente (Kruger et al. 2006).

Altri farmaci come 5-fluorouracile e ciclosporine ad azione locale hanno mostrato effetti benefici:

• Il 5-fluorouracile (5-FU) è stato usato nel trattamento della psoriasi ungueale con risultati contrastanti. Appare efficace soprattutto quando il “pitting” e l’ipertrofia appaiono come i sintomi principali ed è da evitare quando è presente onicolisi. È stato dimostrato che l'applicazione di una soluzione all'1% due volte al giorno per 6 mesi ha ridotto enormemente i sintomi dell'ipercheratosi (Jiaravuthisan et al. 2007; Edwards and de Berker 2009). Le limitazioni di questa terapia sono connesse ad una rapida perdita del principio attivo dall’unghia ed un fenomeno collaterale di iperpigmentazione ed irritazione cutanea.

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• Ciclosporina e similari. La ciclosporina è un peptide naturale estratto dai funghi Trichoderma polysporum e Cyclindrocarpon lucidum che, grazie alle sue proprietà immunosoppressive, da oltre trenta anni è stata adottata come trattamento delle reazioni di rigetto dei trapianti d’organo ed in numerose malattie immuno-mediate. La ciclosporina, infatti, agisce principalmente sui linfociti T, inibendone la proliferazione attraverso l’inibizione della produzione di molecole pro-infiammatorie quali l’interleuchina 2. Numerosi studi clinici nel corso degli anni hanno confermato gli effetti benefici nei confronti delle manifestazioni psoriasiche ed oggi l’efficacia della ciclosporina nel trattamento della psoriasi è ormai ampiamente consolidata, sia nel trattamento locale che in quello sistemico. La ciclosporina è una molecola fortemente idrofobica e questa caratteristica chimico-fisica rende difficoltosa la formulazione e la permeazione attraverso l’unghia, substrato con proprietà prettamente idrofile. Le formulazioni più comuni sono unguenti o creme. L’applicazione topica di ciclosporina in una formulazione oleosa ha portato al miglioramento della patologia soprattutto nelle manifestazioni di pitting e di onicolisi. In ogni modo la terapia topica non è risultata efficace quanto quella sistemica (Pasch M., 2016). Le limitazioni maggiori riguardano la difficoltà di formulare la ciclosporina, di natura lipofila, in un veicolo appropriato che permetta la penetrazione del farmaco attraverso l’unghia. Alcuni studi hanno mostrato che il tacrolimus, molecola analoga alla ciclosporina sia per le caratteristiche chimico-fisiche che per quelle farmacologiche, in unguento poteva penetrare nella pelle periungueale e quindi poteva essere usato nel trattamento della distrofia ungueale causata dal lichen planus o dalla paronichia cronica (Dehesa e Tosti, 2012). È stata inoltre dimostrato che l’applicazione topica di tacrolimus in unguento allo 0.1% per 12 settimane era efficace nei confronti della psoriasi sia del letto ungueale che delle lesioni della matrice senza avere importanti effetti collaterali (Sànchez Regana et al., 2011; De Simone et al, 2012).

L'impiego di questi agenti ad azione locale, seppur efficace, può portare comunque all'insorgenza di alcuni effetti collaterali che includono eritemi, atrofia della pelle e possibile atrofia dell’osso sottostante l’unghia trattata con potenti corticosteroidi, irritazione cutanea in caso di trattamento con calcipotriolo, dolore, gonfiore e onicolisi con 5-fluorouracile (Jiaravuthisan et al.2007; Edwards and Berker 2009).

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4. PERMEAZIONE TRANSUNGUALE

4.1 Unghia umana e

fattori che influenzano la permeazione

transungueale

In virtù della sua composizione chimica, la lamina ungueale forma un’effettiva barriera alla penetrazione dei farmaci; di conseguenza la penetrazione dei principi attivi nell’unghia e la diffusione al suo interno sono estremamente basse se confrontate con quelle di altre membrane biologiche. Tuttavia la lamina ungueale, nonostante la sua natura cheratinica altamente compatta, non è una struttura del tutto impermeabile; essa infatti rammollisce per assorbimento di acqua ed è sensibile all’azione di molti tossici, aumentando la sua permeabilità. Tale proprietà può essere sfruttata per fini terapeutici: l’applicazione topica di farmaci, direttamente sulla lamina ungueale, permette di trattare le patologie dell’unghia e del suo letto in modo più efficace e, soprattutto di evitare gli effetti collaterali associati alla terapia sistemica. La permeabilità della lamina ungueale, tuttavia, si rivela spesso troppo bassa per garantire un flusso di farmaco sufficiente a determinare l’effetto terapeutico auspicato; per questo motivo, negli ultimi 30 anni sono stati fatti molti studi che hanno dimostrato che la permeazione dei farmaci attraverso la lamina ungueale è influenzata dalle proprietà dell’unghia (spessore, idratazione), dalle proprietà chimico-fisiche del permeante, caratteristiche della formulazione (pH, concentrazione del farmaco, presenza di promotori di permeazione), interazione tra permeante e cheratina.

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I fattori che influenzano la permeazione transungueale e quindi l’efficacia di una formulazione topica possono essere riassunti nel seguente schema:

La quantità di farmaco disponibile per la diffusione può essere notevolmente influenzato da processi di cristallizzazione quando il solvente volatile (etanolo principalmente, evapora rapidamente dopo l’applicazione. Anche se questo possa portare ad una temporanea supersaturazione, la maggiore quantità di farmaco precipita come solido, non in forma capace di diffondere. Le proprietà e le condizioni dell’unghia possono giocare un ruolo di controllo importante influenzato dai componenti della formulazione. L’unghia idratata sembra comportarsi più come un idrogel che come una membrana lipofila: prodotti di natura idrofila sono più affini all’unghia che risulta più permeabile alla forma dissociata di composti ionici e veicoli acquosi sono da preferire per promuovere la permeazione dei farmaci attraverso e nell’unghia.

Numerosi studi hanno dimostrato che il flusso di un permeante, attraverso la matrice cheratinica ungueale, è governato dalla legge di Fick:

dM/dt= -D A (dC/dx)

dove dM è la quantità di soluto che diffonde nel tempo dt, attraverso una superfice A, sotto l’influenza di un gradiente di concentrazione dC/dx; D è il coefficiente di diffusione.

Se ne deduce facilmente che l’entità della permeazione di una molecola attraverso la lamina ungueale è inversamente proporzionale al suo spessore e alle dimensioni molecolari del permeante: quando è più alto il suo PM, infatti, tanto più difficilmente le molecole diffondono attraverso il reticolo cheratinico e tanto minore risulta la permeazione; permeanti voluminosi percorrerebbero con difficoltà i pori stretti e tortuosi della matrice cheratinica. Un altro parametro che influenza l’entità della permeazione è l’idratazione. L’unghia infatti si dilata in seguito ad idratazione, la distanza tra le fibre di cheratina aumenta, ed i pori si allargano facilitando la diffusione del permeante. Come conseguenza il flusso di permeante attraverso la lamina risulta incrementato. In definitiva l’unghia idratata diventa meno selettiva al variare del peso molecolare del farmaco.

È ritenuto importante anche il rapporto idrofilità/lipofilicità. Il carattere idrofilo/lipofilo di una molecola può essere espresso ricorrendo al suo coefficiente

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di ripartizione n-ottanolo-acqua (LogPO/A) cioè al rapporto delle solubilità di una

sostanza in questi due solventi.

Le indagini sull'influenza della lipofilicità sulla permeazione sono state ostacolate dal fatto che l'aumento della lipofilicità è direttamente proporzionale a un crescente peso molecolare. Sebbene l’influenza della lipofilicità sulla permeabilità dell’unghia sia meno rilevante dell'effetto che esercita la dimensione molecolare, non dovrebbe essere comunque trascurata (Mustafa M.A 2015).

Il rapporto idrofilicità/lipofilicità del farmaco è influenzato inoltre dal suo grado di dissociazione: farmaci che presentano deboli proprietà acide o basiche possono, in base al pH del veicolo, essere presenti in forma dissociata (ioni) o indissociata e le interazioni elettrostatiche che si vengono a creare tra le cariche delle molecole ionizzate di permeante e le cariche delle proteine dell’unghia (cheratina) possono promuovere o ridurre la permeazione transungueale. L’aumento di permeazione può essere facilitato quando le cariche del permeante e delle proteine sono opposte e ridotte quando queste cariche sono uguali. La ionizzazione inoltre aumenta la solubilità della molecola in acqua e ne riduce la permeabilità attraverso l’unghia (Mustafa M.A. 2015).

4.2 Membrane ottenute da zoccolo bovino

Le unghie umane sono substrati difficilmente reperibili quindi si è reso necessario individuare un modello alternativo idoneo, che fosse in possesso di caratteristiche strutturali e di permeabilità analoghe a quelle dell’unghia umana. Mertin e Lippold, nel corso dei studi durante il 1997, dopo aver scrupolosamente valutato gli effetti di numerosi parametri sulla permeazione attraverso le due barriere, proposero le membrane bovine quale modello alternativo alle unghie umane per gli studi di permeazione in vitro. Il modello animale, infatti, dimostrava di possedere caratteristiche analoghe a quello umano: si tratta in entrambi i casi di membrane cheratiniche che si comportano, nei confronti dei permeanti, come geli idrofili, anche se l’unghia bovina possiede una permeabilità 30 volte superiore ed una minore selettività nei confronti dei permeanti voluminosi (Mertin e Lippo, 1997-a). Per gli autori tuttavia, queste differenze non inficerebbero la validità del modello e consentirebbero esperimenti più brevi e l’acquisizione di risultati in tempi ragionevoli. Le lamine ungueali bovine presentano una rete cheratinica meno

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densa che, quando immersa in acqua, si rigonfia maggiormente probabilmente a causa di un contenuto in cisteina ed in ponti di solfuro significativamente più basso rispetto all’unghia umana. Questo porta ad una differente mobilità del farmaco nelle due differenti strutture tridimensionali e quindi ad una differente permeabilità. In ogni caso, l’affinità di un penetrante per l’unghia umana e le lamine bovine, entrambi costituiti di cheratine, dovrebbe essere simile. Dagli studi è emerso che la permeazione risulta tanto più efficace quanto più la barriera è idratata e quanto più il permeante è solubile in acqua. Quando il farmaco è in sospensione si verifica il massimo gradiente di concentrazione tra donatore e barriera; il flusso allo stato stazionario quindi non dipende dalla natura del veicolo se quest’ultimo non altera la barriera. Una bassa solubilità del principio attivo all’interno della formulazione può tuttavia influenzare la velocità di raggiungimento dello stato stazionario. I dati sperimentali dimostrano anche che la velocità di diffusione è controllata dal rilascio del farmaco dalla matrice. Il processo diffusivo è controllato completamente dalla membrana, indipendentemente dalla concentrazione del farmaco, solo fino al raggiungimento dello stato stazionario. In tempi più recenti sono stati numerosi gli studi che hanno comprovato la validità della lamina ungueale bovina come modello di unghia umana. Monti ed al (2010) , in uno studio comparato tra lamine ungueali bovine e unghie umane infette, ne hanno confermato la validità negli studi di permeazione transungueale di ciclopirox da una lacca ungueale idrofila: nonostante che il flusso di ciclopirox attraverso le lamine ungueali bovine fosse circa 14 volte più alto rispetto a quello attraverso le unghie umane infette, le differenze sembravano dovute principalmente al maggiore spessore di queste ultime (4 volte più spesse) suggerendo una sostanziale equivalenza fra i due modelli.

5. PENETRAZIONE UNGUEALE E TECNICHE DI ESTRAZIONE

DEL FARMACO DALLA MEMBRANA UNGUEALE

La quantità di farmaco accumulata nelle lamine ungueali ottenute dallo zoccolo bovino viene quantitativamente determinata mediante analisi HPLC dopo aver sottoposto le membrane biologiche ad opportune tecniche di estrazione.

Differenti tecniche di estrazione vengono adottate e sono riportate In letteratura. Le membrane biologiche, dopo essere venute a contatto con la formulazione

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contenente il farmaco, prima di successivi trattamenti, vengono accuratamente puliti, sia meccanicamente che con appropriati solventi (ad es. acqua o etanolo), per eliminare completamente l’eccesso di formulazione. Monti ed al. (2011) hanno seguito Il procedimento che prevede il trattamento della lamina ungueale, previamente suddivisa in piccoli frammenti, con una soluzione di metanolo al 10%, incubazione ed agitazione a 25 °C per 24 ore per garantire l'estrazione completa dei farmaci dagli zoccoli bovini e dalle unghie umane. Dopo centrifugazione a 13800 g, 5 min, i supernatanti essiccati sotto vuoto, ripresi con etanolo e analizzati mediante HPLC.

In un altro studio (Monti et al., 2014), ogni campione, suddiviso in piccoli frammenti, è stato trattato con 250 μl di soluzione di NaOH 0,1 N. Dopo incubazione e agitazione a 25 ° C per 24 ore sono stati aggiunti 250 µL di soluzione di metanolo al 10% per assicurare l'estrazione completa dei farmaci dalle unghie e mantenuti sotto agitazione per 2 ore. Infine, i campioni sono stati centrifugati (12000 rpm, 5 minuti), i supernatanti essiccati sotto vuoto e i residui disciolti con etanolo assoluto e analizzati mediante HPLC.

In un altro studio (Monti et al. 2005) sono stati analizzati campioni di membrana trattati (10-20 mg) pesati, tagliati in piccoli frammenti e trasferiti in provette da 5,0 ml. I campioni sono stati trattati con 5,0 mL di NaOH 1N e lasciati a temperatura ambiente per 48 ore per produrre il completa degradazione della struttura cheratinica dell’unghia. La soluzione risultante è stata vortexata e centrifugata (12000 giri/min, 5 minuti); 100 µl di surnatante è stato diluito a 5,0 ml della fase mobile utilizzata nell’analisi con HPLC e direttamente iniettato nell'apparecchio. L’uso di idrossido di sodio per la destrutturazione della cheratina ungueale è piuttosto comune e sono presenti in letteratura numerosi studi scientifici che lo sfruttano sia nel caso di membrane biologiche animali che umane per ottenere una solubilizzazione della cheratina sottoposta ad idrolisi. L’efficacia di estrazione è direttamente dipendente dalla temperatura, dal tempo di contatto e dal volume di NaOH 0.1 N, ritenuta la concentrazione, in normalità, ottimale; già a temperatura ambiente l’idrossido di sodio esplica la sua attività. Effetti drastici si ottengono intorno a 80-90 C dove la struttura cheratinica è quasi completamente trasformata in aminoacidi liberi. Il grado di idrolisi della molecola di cheratina, ad es liberazione di frammenti dializzabili dalla molecola originale, dipende dalle condizioni sperimentali utilizzate (Palliyil et al., 2013)

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6. FORMULAZIONI AD APPLICAZIONE UNGUEALE

La terapia topica è un trattamento auspicabile per le malattie dell’unghia come l’onicomicosi e la psoriasi ungueale, in quanto evita gli effetti avversi associati alla terapia sistemica, permette la penetrazione e l’accumulo di farmaco direttamente nella lamina ungueale, dove il prodotto viene applicato, e migliora la compliance del paziente. Gli antimicotici sistemici raggiungono il sito dell’infezione attraverso il letto ungueale e la matrice distribuendosi in tutta l’unghia. Elevate dosi devono essere somministrate per via sistemica per ottenere una concentrazione di farmaco attiva a livello ungueale con molteplici effetti collaterali che vengono notevolmente ridotti con la terapia topica. L’efficacia della terapia topica però è limitata dall’alta resistenza della struttura cheratinizzata dell’unghia alla permeazione degli agenti attivi. La ricerca nel corso dell'ultimo decennio è stata focalizzata sul miglioramento della permeabilità transungueale mediante l’uso di metodi sia chimici (promotori di permeazione quali carriers, profarmaci) che fisici (ionoforesi, elettroporazione, sonoforesi, microaghi) per ridurre temporaneamente le proprietà di barriera dell’unghia (Shivakumar et al., 2011). Inoltre la messa a punto di appropriate formulazioni è la chiave per portare concentrazioni terapeutiche di farmaco nel letto attraverso la lamina ungueale. Un veicolo di natura acquosa comporta idratazione della lamina ungueale che è soggetta a swelling. Considerando che la lamina ungueale può essere rappresentata come un idrogel, il fenomeno di swelling porta ad un aumento della distanza tra le fibre di cheratina, alla presenza di pori più grandi attraverso i quali le molecole possono passare e conseguentemente ad una aumentata permeazione. La diminuzione della componente acquosa del veicolo comporta una diminuzione del coefficiente di permeabilità attraverso l’unghia.

La lacca ungueale rappresentava la formulazione topica di scelta rispetto alle tradizionali soluzioni o creme (difficoltà di applicazione, scarsa permanenza al sito di applicazione e facilità di essere eliminati) poiché la permanenza della formulazione nel sito di azione è il fattore più critico per il successo del trattamento. Il film formato dal polimero assicura una adesione con l’unghia, garantendo un continuo rilascio del farmaco per periodi lunghi (Kataria et al., 2016). La ricerca è comunque in continua attività nello sviluppo di nuovi carrier

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per la veicolazione di farmaci attraverso l’unghia. I farmaci antimicotici, ad esempio, sono stati veicolati in varie forme, anche nanostrutturate.

I carrier lipidici nanostrutturati (NLC) e nanoparticelle lipidiche solide (NLS) sono estremamente utilizzate in campo topico per la loro capacità di interagire con la parte lipidica dello strato corneo e, formando un film occlusivo, sono in grado di aumentare significativamente l’idratazione del tessuto con conseguente aumento della permeazione. Prendendo in considerazione queste caratteristiche, tali sistemi potrebbero aumentare l’idratazione della lamina ungueale con conseguente aumento della permeazione transungueale. L’idratazione dell’unghia è un elemento cruciale che influenza le proprietà fisiche dell’unghia. Quando idratata, l’unghia si comporta come un idrogel con una rete di pori attraverso i quali le molecole possono diffondere (Rocha et al.,2017).

L’effetto di NLC sul rilascio di farmaci antimicotici nelle regioni più profonde della lamina ungueale è stato determinato e dimostrato in numerosi studi scientifici. Rocha et al. (2017) hanno sviluppato NLC contenenti voriconazolo (VOR-NLC) e hanno determinato la permeazione/penetrazione del farmaco attraverso lamine ungueali porcine. L’incapsulamento del farmaco in NLC con dimensioni di circa 230 nm ha permesso un aumento della quantità di farmaco accumulata nella membrana biologica sia nella parte più superficiale che negli strati più profondi. Esiste inoltre un effetto sinergico tra l’NLC e l’urea, selezionato tra gli enhancer chimici aventi una potenziale azione sull’idratazione.

Elsherif et al. (2017) hanno formulato la terbinafina in nanovescicole costituite da

Span 60 o Span 65 insieme con Tween 80 o sodio desossicolato di sodio. Le nanovescicole preparate e caratterizzate venivano sottoposte a studi di permeazione/penetrazione transungueale in vitro utilizzando unghie umane. La formulazione nanovescicolare ha permesso di ottenere una permeazione trasungueale del farmaco. Inoltre è da sottolineare che tali sistemi nanostrutturati promuovono la penetrazione della terbinafina nella membrana biologica ed in particolare la quantità di farmaco accumulata nell’unghia risultava più alta rispetto a quella permeata. Questo aspetto può andare a vantaggio della terapia dell’onicomicosi a carico della lamina ungueale e non solo, relativa al letto ungueale. Liposomi contenenti terbinafina cloridrato sono stati preparati e caratterizzati da Shah e Jobanputra (2017) e applicati sull’unghia dopo averli formulati come lacca ungueale. La permeazione transungueale di terbinafina

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cloridrato attraverso la lamina ungueale era significativamente più alta quando rilasciata da una lacca ungueale contenente il farmaco incapsulato in liposomi rispetto a quando la lacca ungueale conteneva semplicemente un promotore di permeazione. Questo sistema appare idoneo ad essere sfruttato come un efficiente strumento per la permeazione transungueale anche di altri farmaci usati specificatamente per le patologie ungueali.

Tanriverdi et Özer, (2013) hanno veicolato la terbinafina incapsulata in liposomi o

etosomi in un gel. I liposomi erano preparati solubilizzando farmaco, fosfolipidi e colesterolo in cloroformio e, dopo evaporazione del solvente organico, il film ottenuto era idratato con tampone fosfato pH=7.4. Gli etosomi erano preparati dall’unione di lipidi, etanolo, farmaco ed acqua. Come agenti gelificati sono stati presi in considerazione un polaxamer, un derivato dell’acido poliacrilico e un chitosano. Tutte le formulazioni erano efficienti nel promuovere la permeazione transungueale del farmaco ma la più alta percentuale di farmaco accumulato era stata osservata con la formulazione a base di poloxamer contenente il farmaco incapsulato in liposomi. Inoltre la verifica delle condizioni strutturali dell’unghia mantenuta in contatto con le formulazioni allo studio ha evidenziato che le formulazioni etosomiali davano origine ad una maggiore irritazione sulla superficie ungueale, probabilmente a causa dell’elevato contenuto di etanolo. Lo studio, quindi, ha portato a concludere che la formulazione liposomiale in gel di polossamero poteva rappresentare un promettente sistema per il rilascio ungueale di farmaco.

La terbinafina è stata inglobata anche in microemulsioni gel mostrando un'alta permeazione dovuta alle piccole dimensioni delle goccioline, associata però ad una bassa ritenzione di farmaco nella lamina ungueale bovina (Thatai et Sapra, 2017).

Anche il tioconazolo è stato incapsulato in nanostrutture (nanocapsule) da formulare ad esempio in un veicolo che forma un film sulla superficie ungueale. Sospensioni di nanocapsule rivestite e non con chitosano sono state sottoposte a studi di permeazione transungueale. Le formulazioni contenenti nanocapsule prolungavano il rilascio del farmaco rispetto alle soluzione di controllo e questa capacità era correlata ad un aumento della sua permeazione transungueale. Inoltre le formulazioni film-forming rilasciavano il farmaco in modo ancora più

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efficiente del prodotto commerciale. Un effetto positivo è stato osservato anche sulla quantità di farmaco accumulato nell’unghia (Flores et al., 2017).

Nuovi carrier sono in continuo sviluppo per altri farmaci antimicotici quali: gel e nanoemulsioni-gel caricate con ciclopirox, nanovescicole caricate con sertaconazolo e microemulsioni gel caricate con itraconazolo (Akhtaret al., 2016).

7.

FORME

FARMACEUTICHE

NANOSTRUTTURATE:

NANOMICELLE

Le nanomicelle sono principalmente utilizzate per preparare soluzioni acquose acquose di farmaci insolubili in acqua. Esse sono formate da molecole anfifiliche (tensioattivi o polimeri) che si auto-assemblano per formare una struttura sovramolecolare organizzata nella media acquosa. Possono avere dimensioni diverse (10-1000 nm) e forme (sferiche, cilindriche, ecc.), a seconda dei pesi molecolari dei componenti. L'auto-assemblaggio di nanomateriali avviene solo al di sopra della concentrazione micellare critica (CMC). Sono costituiti da un nucleo idrofobo e da una corona idrofila, solubile in acqua (Figura 12), permettendo l'incapsulamento di molecole idrofobiche e aumentando notevolmente la solubilità in acqua degli attivi lipofili mediante la formazione di interazioni idrofobiche insieme a interazioni di Van der Waals e legami a idrogeno.

Fig. 12 - Schema illustrativo della formazione di micelle sferiche e incapsulamento di farmaci

7.1 Nanomicelle tensioattive

I tensioattivi sono molecole anfifiliche con testa idrofila e coda idrofobica. La testa idrofila può essere caricata (anionica o cationica), zwitterionica o non ionica. Sodio dodecil solfato (SDS, tensioattivo anionico), dodeciltrimetilammonio bromuro (DTAB, tensioattivo cationico), etileneossido (N-dodecile, tetra, C12E4), Vitamina

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E-TPGS (d-alfa tocoferil PEG 1000 succinato) tensioattivi ionici) e la diotanoil fosfatidilcolina (tensioattivi zwitterionici) sono i tensioattivi più comuni utilizzati per la preparazione dei nanomicelle. La coda di tensioattivi è di solito una lunga catena di idrocarburi e comprende raramente una catena idrocarburica o silossanica alogenata o ossigenata. Le micelle si formano quando i tensioattivi vengono disciolti in acqua a concentrazione superiore al CMC ed è anche necessario un equilibrio tra le varie interazioni (Van der Waals, idrofobica, sterica ecc ...). La formazione di nanomicelli è il risultato di due fenomeni:

 auto-associazione di code di tensioattivi a causa di interazioni idrofobiche

 forze repulsive (interazioni steriche e elettrostatiche) tra le teste idrofile che evitano la separazione di fase.

Un equilibrio corretto tra queste forze contribuisce a ridurre l'energia libera del sistema, dovuta alla rimozione di frammenti lipofili dall'ambiente acquoso e alla reintroduzione dei legami a idrogeno in acqua, consentendo la formazione di nanomicelle. Un parametro importante è il numero di aggregazione che rappresenta il numero medio di monomeri tensioattivi in ogni micella. Poiché la formazione di nanomicelle dipende dall'aggregazione non covalente di monomeri individuali di tensioattivi, queste strutture possono esistere in forme diverse (sferiche, cilindriche o planari) e dimensioni, entrambe influenzate dalla concentrazione totale del tensioattivo, dal pH, dalla temperatura e dalla forza ionica (Cholkar et al., 2014). Le nanomicelle, essendo strutture amfifiliche, quando vengono a contatto con un solvente adatto si aggregano a formare le nanomicelle,definite “normali” o “inverse” (Fig13).

Fig.13Rappresentazione schematica di una molecola anfifilica in acqua (a) ed in solvente organico (b)

In un solvente polare, la parte idrofila si orienta verso il solvente mentre la parte idrofoba verso l’interno; tale disposizione è tipica di quelle che vengono chiamate

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nanomicelle “normali”. Le nanomicelle “inverse”, invece, si formano quando vengono a contatto con un solvente apolare, poiché si aggregano disponendo la porzione apolare verso l’esterno, a contatto con il solvente, e la porzione idrofila all’interno. Le nanomicelle “normali” possono essere utilizzate per incapsulare, solubilizzare e rilasciare farmaci di natura idrofoba; mentre le nanomicelle inverse per incapsulare e rilasciare farmaci idrofili (Trivedi R, Kompella UB, 2010). I vantaggi che si riscontrano nell’utilizzo delle micelle sono molteplici. Tali sistemi infatti permettono di incorporare nel core idrofobico principi attivi poco solubili nei fluidi biologici, veicolandoli e proteggendo molti di essi da alterazioni chimiche e/o enzimatiche grazie allo shell idrofilo micellare. Molecole polari, invece, piuttosto che essere incorporate all’interno di tali sistemi, potrebbero essere adsorbite sulla superficie delle micelle (Attwood and Florence, 1983). I farmaci veicolati da micelle, grazie alle piccole dimensioni di queste ultime, raggiungono spontaneamente aree in cui le tecnologie tradizionali difficilmente riescono a raggiungere. Altra caratteristica importante di questi nanovettori è la possibilità di coniugare sulla loro superficie dei ligandi specifici per alcuni tessuti ciò permette di ottenere un direzionamento attivo verso una determinata regione dell’organismo e di aumentare l’efficacia farmacologica di un farmaco incorporato nelle micelle.

7.2 Nanomicelle polimeriche

Le nanomicelle polimeriche rappresentano una classe distinta di nanomicelle formate da copolimeri anfifilici a blocchi che comprendono unità monomeriche idrofile e idrofobiche. Tali strutture generalmente sferoidali sono contraddistinte da una struttura core-shell in cui il nucleo interno (idrofobico) è racchiuso in un guscio (idrofilo). Queste strutture consistono in catene polimeriche che si autoassemblano spontaneamente grazie a interazioni idrofobiche o di coppia ionica tra i segmenti di polimero. A differenza dei tensioattivi, questi polimeri possono essere sintetizzati per soddisfare caratteristiche specifiche. I segmenti idrofobici sono di frequente poliesteri (policaprolattone, poli (d,l-lattide), un polietere (ossido di polipropilene) o un poli aminoacido (poli(ß-benzil-l-aspartato)). Il glicole polietilenico è spesso impiegato per il blocco idrofilo. Più recentemente, è stata tentata l’applicazione di nuovi polimeri tra cui policarbonati idrofobici ed il poli(N-vinil-2-pirrolidone) idrofilo.