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Alla mia famiglia
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INDICE
1. INTRODUZIONE ... 3
2. CHIMICA ... 5
3. ATTIVITA’ FARMACOLOGICHE DEI DERIVATI BTA ... 6
3.1 BTA COME AGENTI ANTIMICOTICI ... 6
3.1.1 Infezioni micotiche ... 6
3.1.2 Infezione batteriche... 7
3.1.3 Derivati del BTA ... 9
3.2 BTA COME AGENTI ANTITUMORALI ... 25
3.2.1 Attività antitumorale ... 25
3.2.2 BTA come inibitore delle topoisomerasi ... 29
3.2.3 BTA come inibitori della polimerizzazione dei microtubuli ... 31
3.2.4 BTA come inibitori del citocromo P450 ... 33
3.2.5 Altri agenti antitumorali a base BTA ... 34
3.3 BTA COME AGENTE ANTI-ALZHEIMER ... 43
3.4 BTA COME AGENTI ANTINFIAMMATORI E ANALGESICI ... 45
3.5 BTA COME AGENTI ANTI-HIV ... 49
3.6 BTA COME AGENTI ANTIOSSIDANTI ... 52
3.7 BTA COME AGENTE ANTICONVULSIVANTE ... 56
3.8 BTA COME AGENTI ANTITUBERCOLARI ... 61
4.CONCLUSIONE... 66
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1. INTRODUZIONE
La struttura del benzotiazolo (BTA) è comune ad un’ampia varietà di prodotti naturali e di agenti farmaceutici, infatti è in grado di conferire alle molecole diverse proprietà farmacologiche. La ricerca di molecole con struttura benzotiazolica e dotate di attività farmacologica, negli ultimi anni è diventato un argomento in rapido sviluppo e di crescente interesse, ed in clinica sono stati introdotti numerosi farmaci a struttura benzotiazolica per il trattamento di varie patologie, mostrando un’alta potenzialità terapeutica.
Il BTA raramente si trova in composti marini o terrestri, mentre è ampiamente diffuso nel fungo Aspergillus Clavatus e Polyporus Frondosus [1,2], come costituente delle foglie di thè e dei mirtilli, ed inoltre è un componente importante delle luciferine della lucciola.
I derivati del BTA hanno catturato l’interesse dei ricercatori grazie alla varietà di proprietà biologiche ad assi attribuite, come l’attività antitumorale [3], antimicrobica [4], anticonvulsivante [5], antivirale [6], antitubercolare [7], antimalarica[8], antielmintica [9], analgesica [10], antinfiammatoria [11], antidiabetica [12] e attività fungicida [13]. Recentemente, i derivati del benzotiazolo sono stati valutati come potenziali agenti diagnostici che si legano all’amiloide nelle malattie neurodegenerative [14,15], inibitori selettivi dell’amide idrolasi dell’acido grasso (FAAH) [16], inibitori del stearoil-coenzima 9-desaturasi [17], antagonisti del recettore del leucotriene D4 (LTD4) [18], antagonisti del recettore dell oressina 2 [19] e antagonisti dei recettori H2 dell’stamina [20]. La struttura benzotiazolica inoltre è spesso presente in intermedi per tinture [21], protettori per piante [22], e sensibilizzanti fotografici [23], oltre che in derivati di BTA si usano in varie branche della ricerca chimica, per esempio, nella chimica polimerica [24,25]. I derivati 2-sostituiti del BTA costituiscono un largo gruppo di xenobiotici, che sono prodotti in tutto il mondo per una gran varietà di applicazioni come è mostrato nella Figura 1 [26]. Il membro più semplice della famiglia è il benzotiazolo utilizzato come antifungino [27].
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Fig.1: Applicazioni del benzotiazolo
Il Metabenzthiazuron (MBTU) è usato come erbicida nelle coltivazioni invernali del grano ed è il principio attivo del Tribunil e dell’Ormet [28], due composti commerciali, e come slimicida (= contro la formazione di sostanze viscide come le muffe) nella carta e nell’industria della pasta di legno [29]. Il 2-Aminobenzotiazolo è usato nella produzione di certe tinture a dispersione a base di azoto [30]. Il Riluzolo è stato messo in commercio dalla Rhone-Poulenc (Rilutek) in trattamenti per la SLA (sclerosi laterale amiotrofica) [31] mentre il 2-(4-aminofenil)benzotiazolo ha evidenziato proprietà antitumorali [32]. I derivati di BTA catalizzano la formazione di legami solforici tra polimeri elastomerici insaturi col fine di ottenere un materiale flessibile ed elastico-reticolato. Il 2-Mercaptobenzotiazolo (MBT/BTSH) è il più usato come acceleratore della gomma in certi prodotti ed anche nella produzione di pneumatici [33].
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2. CHIMICA
Il BTA è un composto organico eterociclico aromatico di formula bruta C7H5NS,
formato da un anello benzilico ed uno tiazolico condensati tra loro, in posizione 4,5 posizione del tiazolo ed assume una configurazione completamente planare.
S N S N 1 2 3 3a 4 5 6 7 7a
I benzotiazoli-2-sostituiti sono stati sintetizzati per la prima volta nel 1887 da A.W. Hofmann, il quale ha riportato un semplice meccanismo di ciclizzazione, in particolare il metodo tradizionale per la preparazione della struttura del BTA riguarda una reazione di condensazione del 2-amminotiofenolo (o orto-ammino-tiofenolo) con nitrili, acidi carbossilici, cloruri acilici o esteri sostituiti (Figura 2).
Questo metodo però ha alcune limitazioni, in quanto non è appropriato per le sostituzioni dei 2-arilbenzotiazoli e per la preparazione dei 2-amminotiofenoli (che sopportano gruppi sostituiti) facilmente ossidabili. Un altro metodo per la sintesi dei benzotiazoli è la ciclizzazione delle tiobenzanilidi di Jacobson, mentre altri metodi includono la reazione, mediata da microonde.
S N R NH2 SH O
+
a) NH O CH3 OCH3 b) NH S CH3 OCH3 CH3 N S OCH36
3. ATTIVITA’ FARMACOLOGICHE DEI DERIVATI BTA 3.1 BTA COME AGENTI ANTIMICOTICI
3.1.1 Infezioni micotiche
La scoperta di composti, naturali prima e di sintesi poi, ad attività antifungina, ha creato le basi, dalla seconda metà del XX secolo, per un’intensa ricerca che ha portato sul mercato svariati farmaci. Le infezioni fungine stanno acquistando sempre maggiore rilevanza e pongono una serie di problemi sia in ambito clinico che a livello di progettazione di nuovi farmaci. Un antimicotico o antifungino è un farmaco capace di inibire la crescita degli organismi fungini quali lieviti, muffe, e dermatofiti. I funghi si distinguono in patogeni e non in base alla loro capacità o meno di determinare stati patologici, la maggior parte di essi sono non-patogeni. Tutti i funghi appartengono ad una classe di organismi che vanno dalle strutture monocellulari, visibili solo al microscopio, a quelle pluricellulari, facilmente visibili ad occhio nudo. I funghi possono essere “saprofiti” o “parassiti”. I saprofiti traggono il loro nutrimento da sostanze morte, mentre i parassiti si nutrono in genere di materia vivente. I funghi sono in grado di prosperare in un’ampia varietà di ambienti; li ritroviamo nell’uomo, negli animali, sulle piante e anche nel suolo, se “arricchito” da escrementi di animali oppure da vegetazione in via di decomposizione.
La candidosi (o candidasi) è la più frequente micosi (infezione da funghi) umana e costituisce uno dei problemi più importanti del soggetto immunocompromesso. Clinicamente, può dare infezioni superficiali, della cute e delle mucose, infezioni profonde ed infezioni generalizzate. Il genere Candida è un batterio gram + e comprende circa 150 specie, delle quali una decina potenzialmente patogene per l'uomo. Tra esse, la principale è Candida albicans [38]; responsabili di infezioni umane sono
anche Candida tropicalis, Candida Krusei, Candida guilliermondi, Candida
parapsilosis, Candida stellatoidea, Candida glabrata ed altre. Tutte queste, in particolare Candida albicans, fanno parte della normale flora microbica dell'uomo e si ritrovano sulle superfici mucose sane della cavità orale, della vagina, del tratto gastrointestinale e dell'area rettale. Tuttavia, in condizioni che portano alla debilitazione dell'ospite, molti soggetti diventano suscettibili ai funghi, candida compresa. Se l'infezione non viene diagnosticata in tempo e trattata aggressivamente, e se le condizioni sottostanti che causano la debilitazione dell'ospite non vengono tenute sotto controllo, l'infezione fungina può diventare letale. Queste infezioni, un tempo
7 considerate rare ed esotiche, oggi sono diventate più comuni ed importanti dal punto di vista medico. Questo a causa della sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS), dall'aumentato impiego della radio e della chemioterapia per la cura di pazienti con tumori maligni e per l'impiego di farmaci soppressori del sistema immunitario (immunosoppressori) nella prevenzione del rigetto dopo trapianto d'organo. Poiché questi funghi diventano patogeni quando l'ospite è in condizioni di debilitazione, vengono comunemente chiamati funghi opportunisti. Un allarmante aumento di casi di infezioni fungine sistemiche potenzialmente letali si è registrata nei malati di AIDS, che hanno un sistema immunitario compromesso. Altre ragioni per l’accresciuta incidenza di infezioni fungine invasive sono da individuare nell’impiego di agenti immunomodulatori per la prevenzione del rigetto nei trapianti di organo e di midollo osseo, l’uso di farmaci antineoplastici, le terapie a lungo termine a base di corticosteroidi e perfino, paradossalmente, l’uso indiscriminato di antibiotici, che riducendo la carica batterica possono creare condizioni di sviluppo ottimali per i funghi. Anche certe procedure mediche invasive, come il ricorso a cateteri vascolari, alla dialisi peritoneale, all’emodialisi ed alla nutrizione parenterale hanno concorso all’aumento di infezioni fungine. L’insieme di tutti questi fattori (con la chemioresistenza al primo posto) giustificano una forte ripresa di attività di ricerca rivolta alla scoperta di agenti antifungini innovativi e più efficaci [39].
3.1.2 Infezione batteriche
Lo Staphylococcus aureus è il più comune agente eziologico delle infezioni cutanee e dei tessuti molli; si tratta in particolare di infezioni piogeniche (quindi formanti pus) che appaiono come foruncoli e ascessi. Tra le altre affezioni piogeniche correlate
allo Staphylococcus aureus figurano alcune forme di gastroenterite (intossicazione alimentare), ma anche patologie più gravi, come osteomielite, artrite settica, borsite, sindrome da shock tossico, necrolisi epidermica tossica, polmonite, meningite
ed endocardite. Lo Staphylococcus aureus è anche un comune responsabile di infezioni nosocomiali, e può interessare pazienti sottoposti ad interventi chirurgici o a manovre invasive, complicando la guarigione [34,35].
8 Pseudomonas aeruginosa è un piccolo batterio a forma di bastoncello, gram negativo, aerobio e mobile per la presenza di un unico flagello polare. La Pseudomonas aeruginosa è soprattutto un patogeno nosocomiale opportunista; produce quindi infezioni soprattutto nei pazienti ospedalizzati, predilingendo quelli debilitati, immunocompromessi o sottoposti a cateterismi uretrali, ventilazione meccanica, punture lombari e perfusioni intravenose. Nel soggetto sano adulto le infezioni da Pseudomonas aeruginosa sono piuttosto rare. Nel bambino in buona salute, le malattie da Pseudomonas aeruginosa sono limitate a processi infettivi locali nel sito di
attacco:otite esterna, infezioni urinarie, dermatiti (intertrigine). Nei soggetti
immunocompromessi per malattie metaboliche o ematologiche, per tumori, prolungata terapia antibiotica o chemioterapia, l'infezione da Pseudomonas aeruginosa può divenire disseminata e provocare, per esempio, polmonite, endocardite, peritonite, meningite e grave setticemia. Le infezioni da Pseudomonas aeruginosa possono presentarsi in molte sedi anatomiche, come cute, tessuti sottocutanei, ossa, orecchie, occhi, tratto urinario e valvole cardiache. La sede varia a seconda della porta d'ingresso e della vulnerabilità del paziente. I sintomi dell'infezione da Pseudomonas aeruginosa dipendono quindi dalla sede corporea interessata dal processo infettivo [36,37].
Il Bacillus subtilis è un batterio Gram-positivo, conosciuto anche come bacillo del fieno o dei pascoli, comunemente presente nel suolo. B. subtilis non è un patogeno umano. Esso comunque può degradare o può contaminare gli alimenti, e modificarli, ma raramente causa intossicazione alimentare.
La scoperta e lo sviluppo di nuovi medicinali antimicrobici rappresenta uno degli obiettivi principali degli scienziati. Nelle ultime decadi, i problemi con i microrganismi resistenti a vari medicinali hanno raggiunto un livello allarmante in molti paesi nel mondo. La resistenza ad un numero di agenti antimicrobici (antibiotici β-lattamici, macrolidi, chinoloni e vancomicina) di varie specie di batteri clinicamente significanti sta diventando un crescente problema a livello mondiale [40]. Nonostante numerosi tentativi di sviluppare nuovi ed efficaci antimicrobici, i derivati BTA restano ancora come una delle più versatili classi di composti attive contro i microbi [41] e rappresentano comunque il punto di partenza per il disegno e la progettazione di farmaci antimicrobici.
9 3.1.3 Derivati del BTA
Le basi di Schiff di coniugati BTA-triazolo sono state riportate da Sonì ed altri e sono state valutate per le loro attività antimicrobiche contro un gruppo di macchie batteriche e fungine. Di questa serie di composti (1a-d), i derivati sostituiti in posizione 4 dell’anello aromatico con un gruppo idrossilico o con una dimetilamina o in posizione 3 e 4 con il metossile hanno mostrato una buona attività antibatterica. La presenza in posizione 2 dell’anello aromatico di un cloro determina un aumento dell’attività antifungina mentre nei derivati 2-nitro o 3-nitro l’attività diminuisce [42].
N H N S N N N N SH CH R
(1a-d) a) R=H; b) R=4-OH c)2-Cl; d)3,4-OCH3
Derivati sulfonamidici del BTA sono stati sintetizzati e testati in vitro per le loro proprietà antimicrobiche contro un gruppo di batteri selezionati. Questi composti (2a e
2b) hanno mostrato attività antimicrobiche confrontabili al composto standard costituito
dalla miscela Sulfametossazolo-trimetoprim. Le sulfonamidi con un gruppo amminico e un gruppo nitro in posizione 4 dell’anello fenilico e un metile sull’anello benzotiazolico, sono risultati essere i più attivi della serie. La sostituzione di un gruppo amminico con un gruppo nitro, porta però, ad una diminuzione dell’attività antibatterica [43]. S C H3 N S NH O O R (2a-b) a) R=NH2; b) R=NO2
10 Sharma e i suoi collaboratori hanno sintetizzato i derivati BTA-pirimidinici e hanno valutato la loro attività antimicrobica contro specie batteriche quali Bacillus coagulans, Bacillus Subtilis, Staphilococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa. La fusione di due eterocicli quali BTA e pirimidina, ha portato alla formazione di una nuova struttura eterociclica che ha presentato una significativa attività biologica [44]. Il composto (3) ha mostrato un’attività significativa contro il B. coagulans e la P. aeruginosa, se paragonato al Cloramfenicolo che è il composto standard.
O C H3 S N N O (3)
I derivati BTA 2-sostituiti, sono stati preparati e testati per attività antimicrobiche contro entrambi i batteri gram positivi e negativi, prendendo l’ Ampicillina come standard. Tra questi i composti 4(a,b) hanno esibito eccellenti attività rispettivamente contro P. aeruginosa e E. Coli [45].
N S NH C H3 NH S N CH3 R (4a-b) a) R=3-NO2; b) R=4-Br
I derivati BTA coniugati con la tiourea sono stati descritti da Saeed e altri. I composti sembrerebbero possedere un largo spettro di azione contro i microrganismi testati mostrando una più elevata attività contro i funghi che contro i batteri.
11 I composti (5), (6), (7), (8), (9) esibiscono la più grande attività antimicrobica. Gli studi di SAR hanno messo in evidenza che, i composti con gli anelli BTA sostituiti mostrano una migliore attività antimicrobica rispetto a quelli con un anello non sostituito, e che i composti contenenti gruppi funzionali amminici e nitro sull’anello BTA sono altamente attivi contro i batteri e i funghi. La presenza di un gruppo elettronattrattore sull’anello BTA può diminuire la densità degli elettroni sull’anello di benzene attraverso un effetto di risonanza. I composti contenenti gruppi nitro sull’anello BTA sono estremamente attivi non solo contro i batteri gram positivi ma anche contro i gram negativi e i funghi. Gli studi sulla citotossicità in modelli di MTT hanno rivelato che i derivati tioureici (6b,
9b-c) sono i più potenti, con valori IC50, contro MCF-7 e le cellule Hela, nel range di
18-26 e 38-46 μM, rispettivamente [46]. O2N N H N H S O N S NO2 S N H N H O S N S NO2 (5) (6a) S N H N H O S N S Br N H N H O S N S NO2 (6b) (7)
12 C H3 N H O N H S N S NO2 N O N H N H O S N S NO2 (8) (9a) N O N H N H O S N S NH2 N O N H N H O S N S Br (9b) (9c)
Bondock e i suoi collaboratori hanno progettato la sintesi di composti che coniugano pirazolo, isossazolo e derivati della pirimidina con BTA (10-15), ed hanno valutato in vitro la loro attività antimicrobica contro diversi ceppi batterici e fungini. I derivati BTA-pirimidina (10,12,15) hanno mostrato un largo spettro di azione contro i batteri gram positivi. Il composto (14) ha la stessa potenza della Streptomicina nell’inibire la crescita del B. subtilis (MIC (concentrazione minima inibitoria)= 3.12 μg/mL), mentre i composti (11), (12) e (14) sono equipotenti al Treflucan (standard) nell’inibire la crescita del Bacillus fabae (MIC= 3.12 μg/mL). Il derivato pirimidinico ha mostrato una migliore attività antimicrobica rispetto all’analogo pirazolico.
N S N N O CN N S N H NH N O NH 2 N S N H O N N NH2 NH2 (10) (11) (12)
13 N S N H O N N S NH N S N H O N N N N N NH2 (13) (14) N S N H O N N NH (15)
In uno studio recente condotto da Youssef e Noaman sono stati descritti alcuni composti coniugati BTA-pirimidina (16-18) che sono stati testati per l’attività antimicrobica e antitumorale. Il composto (18) ha mostrato una moderata attività antifungina contro C.Albicans con un valore di MIC di 125 μg/mL mentre il composto (17) (IC50 di 42.55 μg/mL ) ha mostrato un’azione più citotossica rispetto al farmaco di controllo, la Doxorubicina (52 μg/mL) [47]. S N CN CH3 C2H5 O N S N H NH N O COOC2H5 (16) (17) N S N H NH N O CH2CH2CH2CH3 CH3 (18)
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I derivati BTA-–aminofosfonati hanno mostrato un’interessante attività contro
entrambi i batteri, e i composti 19(a,b) sono risultati più efficaci rispetto alla comune Penicillina. Tra questi fosfonati i derivati della clorosalicilaldeide (19a), della 2-bromosalicilaldeide (19b) e della 2-nitrosalicilaldeide (19c) sono risultati essere i più potenti per le attività antibatteriche ed antiossidanti [48].
Singh e i suoi collaboratori hanno riportato la sintesi di analoghi BTA usando la chimica “a scatto” e ne hanno testato la potenziale attività antibatterica. Il composto
(20a) ha evidenziato la massima potenza contro tutti i ceppi batterici gram positivi e
negativi con un valore di MIC di 3.12 μg/mL, due volte più attivo della Ciprofloxacina (MIC=6.25 μg/mL), utilizzato come farmaco di riferimento. Il composto (20b) è risultato essere più attivo contro tutti i ceppi fungini con un valore MIC compreso tra 1.56-12.5 μg/mL, mentre i restanti composti hanno mostrato moderata o debole attività antifungina. Gli studi di SAR hanno dimostrato come la presenza di gruppi elettron-attrattori quali il fluoro o il cloro, è importante per l’attività antibatterica. La seconda posizione sull’anello di benzene è critica per l’attività antibatterica e il fluoro ha un effetto significativo su questa attività se paragonato al cloro. La presenza di gruppi elettron-donatori come il metile, metossi e il pentile, determina una debole o moderata attività rispetto ai gruppi elettron-attrattori [49].
H3CO S N NH O H Cl P O O O H (19a) H3CO S N NH O H Br P O O O H (19b)
15 H3CO S N NH O H NO2 P O O O H (19c) F F N N N N N N N N S F F Br N N N N N N N N S Br (20a) (20b)
I composti ottenuti dalla coniugazione di BTA e piridina-ossadiazolo sono stati sintetizzati e valutati per le loro attività antimicrobiche e antimicobatteriche. I composti
21(a,b) hanno mostrato una promettente attività contro l’ E. coli, con MIC= 12.5 e 25
μg/mL) se comparati all’Ampicillina, e composti inattivi contro i ceppi micobatterici [50]. L’attività antibatterica contro V. colera, Bacillus cereus e S. dysenteriae del composto (22) risulta essere maggiore rispetto a quella della Ciprofloxacina, che è il farmaco antibatterico di riferimento [51]. Altri composti interessanti sono i derivati 2-amino BTA sintetizzati e testati in vitro per attività antibatteriche contro un gruppo di ceppi batterici. Di questa classe il composto (23), 5,6 difluorosostituto, è risultato un potente inibitore dei patogeni gram positivi ed ha mostrato una buona potenzialità contro batteri farmaco-resistenti, senza presentare citotossicità alle concentrazioni terapeutiche. Inoltre sono stati studiati i derivati 6-sostituti, alcuni dei quali hanno mostrato attività antifungina, in particolare, i composti 24(a,b), che hanno mostrato un valore MIC di 4-8 μg/mL contro C. albicans, C. parapsilosis e C. tropicalis.
16 S N O N N S NH O N S CH3 (21a) S N O N N S NH O N S SCN (21b) N S Et N S MeO Br (22a) (22b) S N F F N H NH Cl Cl Cl O N S NH2 (23) (24a)
17 Cl O N S NH2 (24b)
Questi studi hanno comprovato l’importanza del sostituente in posizione 2 della porzione eterociclica per i derivati BTA. In particolare, i derivati 2-mercapto sono generalmente più attivi contro i batteri, mentre quelli 2-amino sono più potenti contro i funghi. Inoltre è stato dimostrato come la presenza di gruppi ingombranti in posizione 6 contribuisca ad incrementare l’attività antifungina [52].
Gli ibridi BTA-purinil tioureidici (25 a-c) sono stati sintetizzati e valutati in vitro per l’azione antimicrobica. I composti 25(a,b) hanno mostrato un’eccellente attività contro Klebsiella (25c) e contro B. subtilis e A. niger, anche se il composto (25c) ha presentato un valore MIC minore rispetto al farmaco di riferimento. La presenza di un gruppo elettron-donatore specialmente quello alogenato e il gruppo metossi sull’anello BTA, influenza positivamente l’attività antibatterica e antifungina, mentre la presenza del gruppo NHCSNH come linker tra l’anello BTA e l’anello purinico è molto significativo per l’effetto antimicrobico [53].
In uno studio di Amir e altri sono state descritte molecole ibride ottenute dalla coniugazione di un pirazolone/pirazolo e BTA, di cui sono state valutate le loro attività antibatteriche contro S. aureus e E. coli, e l’attività antifungina contro Aspergillus niger e C. albicans. Tra i composti pirazolone-BTA, il composto (26a), che presenta un atomo di bromo in posizione para sull’anello fenilico, è risultato essere il più potente agente antibatterico (MIC=13.95 μM) contro S. aureus se confrontato al farmaco di riferimento, la Ciprofloxacina (MIC=18.86 μM). I composti 26(b,c), rispettivamente, p-fluoro (MIC=32.29 μM) e p-cloro (MIC=31.01 μM) hanno anche mostrato una considerevole attività antibatterica contro lo S. aureus. La presenza di un gruppo elettron-donatore come metile nella stessa posizione determina una diminuzione dell’ attività.
18 N S Cl NH NH S O N N NH2 N N S O O (25a) N S NH NH S O N N NH2 N N S O O F (25b) N S NH NH S O N N NH2 N N S O O H3CO (25c) S N Cl N N CH3 O N N H R
(26 a-c) R= a) Br; MIC= 13.95 μM/ b) F; MIC= 32.29 μM/ c) Cl; MIC= 31.01 μM
Anche per quanto riguarda gli ibridi BTA-pirazolo, il derivato p-cloro (27a) (MIC=15.58 μM contro S.aureus) e quello p-fluoro (27b) (MIC=32.46 μM contro E. coli), hanno mostrato una significativa attività antibatterica. Dagli studi di SAR, è emerso che l’incorporazione di un cloro in posizione 6 del BTA, nei derivati pirazolinone/pirazolo, rafforza l’attività antimicrobica, e i composti che hanno un
19 gruppo elettrone-attrattore sull’anello fenilico legato al linker idrazinico sono più attivi rispetto ai composti che hanno un gruppo elettron-donatore [54].
S N Cl N N CH3 N N R C H3
(27 a,b) R= a) Cl; MIC=15.58 μM/ b) F; MIC=32.46 μM
Bolelli e i suoi collaboratori hanno sintetizzato una serie di derivati BTA e li hanno valutati per la loro attività antimicrobica con differenti ceppi. I composti possedevano un vasto spettro di attività contro i microorganismi testati a valori di MIC tra 100 e 6.25 μg/mL. I composti 28(a,b) hanno mostrato una significativa attività antibatterica evidenziando un valore MIC di 6.25 μg/mL contro gli isolati farmaco-resistenti S. aureus e P. aeruginosa. Gli studi SAR hanno rivelato che, un raggruppamento 4-metossifenilacetamidico in posizione 2 del BTA è importante per l’aumento della potenza contro i batteri gram negativi specialmente contro l’isolato P. aeruginosa farmaco-resistente. Ma nello stesso tempo questa porzione benzamidica risulta efficace nell’aumentare l’azione contro S. aureus gram positivo isolato farmaco resistente [55].
Cl S N NH O C2H5 (28a) Cl S N NH O OCH3 (28b)
20 Altri composti interessanti sono i coniugati BTA-sulfonamide. Di questi il composto
(29b) ha mostrato una promettente attività contro i differenti ceppi batterici e fungini
con valori MIC nel range 15.5 e 31.25 μg/mL; mentre i composti (29a) e (29c) hanno mostrato una moderata attività con valori MIC tra 31.25 e 62.5 μg/mL [56]. È stato provato dagli studi di SAR che, la presenza di un gruppo elettron-attrattore come F, Cl e
NO2 in posizione 6 degli amino-BTA (29 a-c) è importante per l’attività antibatterica e
antifungina. Mentre la presenza di un gruppo elettron-donatore come CH3 nella stessa
posizione determina un peggioramento dell’attività. Sono stati riportati i derivati BTA sostituiti in posizione 2 con un raggruppamento 4-fenil-(benzilideneaminico) e diversi sostituenti carbossilati in posizione 6. Il composto 30(a,b) si è dimostrato significativamente attivo contro C. albicans e A. niger [57]. Anche i derivati 2-mercapto-BTA 31(a,b) hanno dimostrato un’interessante attività antibatterica con valori MIC di 3.12 μg/mL rispettivamente contro S.aureus e 25 μg/mL contro E. coli. Sostituendo il gruppo SH con gruppi più ingombranti come S-Bn si ha una perdita considerevole dell’azione antibatterica [58].
N N O H S O O N H S N Cl N N O H S O O N H S N Cl F (29a) (29b) N N S O O N H S N NO2 O H (29c)
21 O2N N S N O O R (30a) R=C2 H5 ; (30b) R=CH2C6H5 F3C N S SH O2N N S SH (31a) (31b)
Bhusari ed i suoi collaboratori hanno riportato i derivati BTA-benzenesulfonamidici come agenti antimicrobici e antiturbecolari. I composti cloro-sostituiti e carbossi-sostituiti hanno evidenziato una buona attività antibatterica contro B. subtilis e E. coli. I composti cloro-sostituiti e metossi-sostituiti hanno mostrato una pronunciata attività antifungina contro il C. albicans. Inoltre quelli che possiedono un sostituente elettron-attrattore (Cl; Br) sono risultati essere più attivi rispetto ai derivati nitro-sostituti nel caso dell’attività antitubercolare.
I composti coniugati di BTA- acido guanidinopropanoico sono stati sintetizzati e valutati per attività antimicrobiche e antiproliferative contro la linea cellulare del cancro umano, Hela. Il derivato 32(a) è risultato superiore alla Ciprofloxacina contro P. aeruginosa (MIC=3.12 vs Cp MIC 19.5 μg/mL) e il composto (33) è risultato altamente attivo contro la Salmonella paratyphyi (MIC 3.125 vs Cp MIC 43.4 μg/mL). Il composto (32b) ha mostrato la più potente attività antiproliferativa con IC50 di 2 μM paragonabile al valore del controllo positivo, la Doxorubicina.
R N S NH NH OH N H O (32a) R= Br ; (32b) R= OH
22 N H NH Br N S N C H3 C6H5 (33)
Gli studi di SAR hanno rivelato che la coniugazione BTA e acido guanidinopropanoico è importante ai fini dell’attività e anche sostituenti come OH, COOH, e SO2NH2 in
posizione 6 dell’anello BTA, giocando un importante ruolo per l’attività. Per l’attività sono importanti i legame ad idrogeno da parte del sostituente e la
dimensione di questi gruppi, con un andamento che segue l’ordine OH> COOH>
SO2NH2. Da ciò si può concludere che, per una buona attività, è necessario in posizione
6 dell’anello BTA un gruppo piccolo in grado di dare legame ad idrogeno [59].
Altri derivati interessanti sono quelli ottenuti dalla coniugazione tra BTA-pirimidina (34
a-c), considerati degli agenti antimicrobici [60]. I composti in cui BTA è sostituito con
triazolo e piridina hanno esibito promettenti attività antimicrobiche e
antimicobatteriche. In particolare i derivati fluoro, cloro, e metil sostituiti hanno presentato una buona attività sulle specie batteriche e fungine, mentre i derivati bromo, nitro e metossi si sono rivelati efficaci contro Mtb. I composti 35(a-d) hanno evidenziato promettenti attività antimicrobiche, mentre il composto 40d ha mostrato una potente attività antimicobatterica [61].
N S N Cl NH N NH2 O N H N R (34a) R= 4-Cl; (34b) R= 4-F; (34c) R= 4-NO2
23 N N N N NH N S R O CH3 (35a) R=6F; (35b) R=4CH3; (35c) R=4NO2; (35d) R=4Cl
Tra i derivati BTA-tiazolidin-4-one sintetizzati e testati per attività antimicrobiche e anti-TB, i composti 36(a,b) possiedono una buona attività antimicobatterica contro il ceppo Mtb H37RV [62].
Sono stati anche proposti dei derivati di BTA sostituiti con tiazolo, tiofene e pirazolo. Il composto BTA-tiofene (37) ha mostrato un’attività confrontabile con quella del cloroamfenicolo contro S. aureus (MIC 3.125 μg/mL), mentre la sua attività contro S. piogene era inferiore del 50% rispetto al cloramfenicolo. I derivati del tiazolo (38) e del pirazolo (39) hanno presentato la più potente attività antifungina in vitro con un valore MIC di 6.25 μg/mL contro Aspergillus fumigatus e F. oxysporum. Gli studi di SAR hanno rivelato che l’incorporazione del BTA al nucleo del tiofenolo in posizione 3
tramite un linker carbossammidico determina un’elevata attività antimicrobica[63]. Due composti interessanti sono i derivati BTA-pirimidina (40 e 41) che possiedono
rispettivamente un’eccellente attività contro i batteri gram positivi e negativi e contro A. niger [64]. In un altro lavoro sono stati sintetizzati e selezionati per la loro attività antimicrobica e citotossica, i derivati pirimidina-bis-BTA.
Cl N S N N H S O N N R (36a) R=4-H; (36b) R=4-F
24 S N N H S O NH 2 COOEt PhHN S N N H CN O N S Ph Ph S N N H O N N N Ph PhHN (37) (38) (39) O C H3 N S NH O S N N O O C H3 (40) N S NH O S N N O O C H3 O2N (41)
25
3.2 BTA COME AGENTI ANTITUMORALI 3.2.1 Attività antitumorale
La neoplasia è un processo patologico caratterizzato dalla proliferazione abnorme delle cellule di un tessuto. Le cellule proliferanti sono elementi anomali, che per cause ancora poco note si sono resi più o meno indipendenti dai meccanismi che regolano i processi di proliferazione, di differenziazione cellulare e di accrescimento dei tessuti. Come conseguenza di ciò tali cellule creano una massa abnorme di tessuto, che di solito deforma e distrugge le normali strutture anatomiche entro le quali si sviluppa, provocando spesso la perdita progressiva della funzione del tessuto o dell’organo coinvolti. Il tessuto tumorale in genere presenta molte differenze rispetto al tessuto di origine, anche se alcune caratteristiche del tessuto di origine possono essere mantenute, in maniera completa oppure parziale. Un processo neoplastico può svilupparsi da qualunque tipo di cellula e di tessuto dell’organismo, molti tumori hanno un’origine monoclonale, derivano cioè dalla trasformazione e proliferazione di una singola cellula altri invece originano dalla trasformazione di un’area più o meno estesa di tessuto, nella quale prima che il tumore si sviluppi si possono osservare alterazioni citologiche e strutturali di vario tipo, che preludono alla trasformazione neoplastica. Il tumore si comporta come qualcosa di autonomo e di estraneo all’organismo, le cui cellule, non più subordinate al piano di regolazione generale, utilizzano l’organismo solo come supporto nutritivo. Le cause della trasformazione neoplastica di una cellula e i meccanismi precisi attraverso i quali essa si realizza sono ancora poco noti, ma la neoplasia è principalmente una malattia ambientale, con il 90-95% dei casi attribuiti a fattori ambientale e per il 5-10% alla genetica [65]. Anche i virus sono agenti che possono provocare la comparsa di neoplasie: virus umani a DNA, quali il Papillomavirus ( Human Papilloma Virus-HPV), il virus di Epstein-Barr (Epstein-Barr Virus-EPV), il virus dell’ epatite B (Hepatitis B Virus-HBV) e l’ herpes virus del sarcoma di Kaposi (Kaposi Sarcoma Herpes Virus-SHV); virus oncogeni a RNA, quali il virus della leucemia umana a cellule T di tipo 1 (Human T-cell Leuemia Virus type1-HTLV-1) [66].
26 La terapia tumorale si basa su diversi approcci:
1) Trattamento chirurgico, dove viene rimossa la massa tumorale ed è possibile qualora il tumore sia ben localizzato e non in fase di metastasi.
2) Radioterapia, usata da sola o associata a chirurgia/chemioterapia, è una modalità di trattamento localizzato del tumore che vede l’ utilizzo di radiazioni ionizzanti. 3) Chemioterapia, si basa sulla somministrazione sistemica di farmaci antitumorali sia sul tumore localizzato sia su quello metastatico. Il principale problema legato a tale terapia è la mancata selettività di azione del farmaco che non agisce solo sulle cellule malate ma anche su quelle sane, principalmente i tessuti in rapida proliferazione come il midollo osseo, la mucosa orale, il bulbo pilifero, l’ovaio ed il testicolo [67]. Di conseguenza la ricerca farmaceutica è ampiamente dedicata all’individuazione di nuovi farmaci capaci di agire selettivamente sui tessuti malati e alla messa a punto di nuove strategie terapeutiche antitumorali rivolgendo sempre più l’attenzione alle anomalie che coinvolgono tre importanti classi di geni che controllano la proliferazione cellulare: i proto-oncogeni, che stimolano la cellula a progredire nel suo ciclo cellulare [figura 3] (aumento di volume, replicazione del DNA e divisione cellulare), gli oncosoppressori, che inibiscono la proliferazione cellulare, e i geni coinvolti nella riparazione del DNA.
27 Se un proto-oncogene subisce una mutazione che comporta l’attivazione dell’oncogene, è facile che la cellula assuma la capacità di proliferare anche in assenza di segnali positivi o che ignori segnali inibitori provenienti dall’esterno. La perdita di questi vincoli è un passo cruciale nella trasformazione in cellula neoplastica. La maggior parte dei proto-oncogeni codifica proteine che partecipano alle cosiddette vie di trasduzione del segnale, attraverso le quali i segnali di crescita o di non crescita vengono trasferiti dall‘esterno della cellula all’interno del nucleo. Un gene oncosoppressore (o semplicemente oncosoppressore) è un gene che codifica per prodotti che agiscono negativamente sulla progressione del ciclo cellulare proteggendo in tal modo la cellula dall'accumulo di mutazioni potenzialmente tumorali. I geni oncosoppressori assolvono ad una grande varietà di funzioni, generalmente in contrasto con le funzionalità espresse dagli oncogeni. Se gli oncogeni, nella maggioranza dei casi, presiedono a tutti i meccanismi di accrescimento e proliferazione cellulare, gli oncosoppressori si pongono come limite a tali funzioni.
La terapia medica comprende numerosi farmaci tra cui: agenti alchilanti che agiscono
inibendo la replicazione del DNA e, secondariamente, inducendo alterazioni
nella trascrizione dell’RNA o bloccando la sintesi proteica (es: mostarde azotate, tiotepa, nitrosuree, dacarbazina e derivati del platino); farmaci citotossici (o citostatici o antiproliferativi) che agiscono interagendo con il DNA e bloccandone la duplicazione o
con i componenti del DNA impedendone la formazione, l'unico farmaco ancora
utilizzato di questa categoria è il MGBG (metil-gliossale bis-guanilidrazone);antibiotici
la cui azione principale è quella di formare legami covalenti con gli acidi nucleici e
interferire con la sintesi del DNA (es: mitramicina, doxorubicina,
bleomicina); ormoni che vengono utilizzati in particolare per le neoplasie agli organi
più sensibili ad essi, come la mammella nella donna e la prostata nell'uomo, soprattutto in seguito all'intervento chirurgico per eliminare eventuali cellule rimaste ed evitare la formazione di metastasi. Attualmente la terapia si basa principalmente su anti-estrogeni (es. tamoxifene eraloxifene) nel caso della donna. Un grande salto di qualità è stato fatto con la scoperta degli inibitori dell'aromatasi, l'enzima che partendo dal testosterone opera la sintesi di estradiolo. Il primo scoperto fu l'amino-glutetimide, che però opera un'inibizione non-selettiva anche di tutte le vie che portano alla sintesi di androgeni e glucocorticoidi. Migliore selettività si ha con il vorozolo, il fadrozolo, l'exemestano e l'anastrozolo, selettivi per l'aromatasi ed oggi usati assieme ad altri farmaci nella terapia
28 dei carcinomi ormono-sensibili. La terapia ormonale è usata anche per trattare neoplasie all'endometrio (utero), leucemie e linfomi. I farmaci antimitotici, come dice il nome stesso, impediscono la mitosi cioè la riproduzione cellulare. Uno dei primi farmaci impiegati è stata la podofillina, isolata dal Podophyllum peltatum, dotata di buona attività verso gli epiteliomi ed i sarcomi. Data la sua tossicità generalizzata, ne sono stati preparati dei derivati con maggiore selettività e minori effetti collaterali: l'etoposide o VP16 ed il teniposide o VM26, tutt'oggi impiegati in schemi polichemioterapici per linfomi e molti tipi di carcinoma. Una molecola con attività simile alla colchicina (il primo antimitotico impiegato, oggi del tutto abbandonato) ed alla podofillina, è la combretastatina, isolata dalla pianta africana Combretum caffrum. Per migliorare la biodisponibilità di questa molecola è stato sintetizzato il suo derivato fosforico (combretastatin-3'-fosfato) che risulta essere molto più solubile rispetto alla molecola originale. È attiva nei tumori gastrointestinali e polmonari ad elevata vascolarizzazione. Una categoria di antimitotici che agisce sui microtubuli è quella degli alcaloidi della Vinca rosea, composti chimici di un certo peso molecolare usati praticamente in ogni tipo di carcinoma, sarcoma e malattie linfoproliferative. Il primo alcaloide ad essere usato fu la vinblastina, poi seguirono la vincristina e la vinorelbine, L'ultima molecola attiva ad essere stata scoperta, appartenente a questa classe di antineoplastici, è la vinflunina. Un'analoga classe di antimitotici, i taxani, sono degli alcaloidi isolati dal Taxus canadensis che agiscono in modo esattamente opposto alla colchicina: "congelano", cioè, i microtubuli impedendone il loro ricambio e movimento dentro la cellula. Il primo ad entrare in terapia fu il paclitaxel, risultato molto attivo su vari carcinomi e sarcomi, seguito dal docetaxel, che ha una farmacocinetica e biodisponibilità migliori. Tutti questi farmaci che bersagliano il sistema dei microtubuli hanno nello specifico l'effetto collaterale della neuropatia, specie periferica, dato che possono interferire con il trasporto di proteine lungo gli assoni nervosi.
I derivati del platino agiscono invece legandosi covalentemente al DNA, formando in tal modo complessi stabili, che non sono accessibili al corredo enzimatico cellulare preposto alla replicazione del DNA. Il principale membro di questa classe è il cisplatino (o cis-diammino-dicloro-platino), successivamente sono stati introdotti in terapia derivati con un migliore profilo terapeutico, quali il carboplatino e l'oxaliplatino. Sono molto attivi nei sarcomi (come quello osseo), nei carcinomi (mammario, gastrico, renale) e sono i farmaci d'elezione per i seminomi testicolari. Manifestano però diversi
29 effetti collaterali quali ototossicità (a volte irreversibile), tossicità renale, tossicità gonadica, e neuropatie. In questi anni i derivati benzotiazolici sono stati molto studiati come farmaci antitumorale, e diversi tentativi sono stati fatti per modificare il nucleo BTA allo scopo di migliorarne l’attività. Tra questi l’imidazobenzotiazolo così come i BTA polimerizzati e altri BTA sostituti come per esempio 2-(3,4-dimetossifenil)-5-fluorobenzothiazolo (PMX 610) hanno dimostrato di esibire proprietà abbastanza potenti (GI50 < 0.1 nM) e selettive in vitro nella linea di cellule tumorali umane (per esempio il colon, polmone). Il 2-(4-aminofenil)-BTA e i suoi analoghi comprendono una nuova classe di agenti antitumorali. Ancora più importante è il continuo sforzo indirizzato allo sviluppo di nuovi agenti antitumorali a base di BTA che colpiscano vari enzimi o recettori come per esempio topoisomerasi, microtubuli, l’enzima citocromo P450, le chinasi di fibrosarcoma rapidamente accelerato (RAF), che trasformano la crescita del fattore-β (TGF-β) e il DNA. Essi hanno un gran potenziale per affrontare i diversi ostacoli dei farmaci clinici attualmente disponibili e per essere sviluppati come agenti antitumorali.
3.2.2 BTA come inibitore delle topoisomerasi
Le topoisomerasi (TOP) sono enzimi ubiquitari appartenenti alla classe delle isomerasi che regolano il metabolismo del DNA, in particolare determinano un aumento o diminuzione del grado di superavvolgimento. Questa affascinante famiglia di enzimi ha suscitato un considerevole interesse dal momento che molti farmaci antibatterici e antitumorali colpiscono le topoisomerasi [figura 4] e influenzano i passaggi chiave nel loro ciclo catalitico.
30 Esistono due classi di topoisomerasi:
Le topoisomerasi I (o DNA topoisomerasi) rompono transitoriamente una sola delle catene del DNA, la ruotano attorno a quella integra e infine riuniscono le estremità interrotte senza richiedere cofattori energetici. Le topoisomerasi II (DNA topoisomerasi idrolizzanti ATP), invece, rompono entrambe le catene di DNA. Un’ampia varietà di agenti antitumorali ha dimostrato di influenzare il ciclo catalitico delle topoisomerasi II. Nelle cellule umane i due enzimi non sono espressi allo stesso modo: la topoisomerasi I è molto abbondante del tessuti tumorali del colon, mentre la topoisomerasi II predomina a livello della mammella e delle ovaie. I composti che inibiscono la topoisomerasi I agiscono principalmente durante la fase replicativa del ciclo cellulare (fase S), invece l’azione degli inibitori della topoisomerasi II è associata alla fase di trascrizione
dell’RNA ed si ha quindi durante quasi tutto il ciclo cellulare (fase G2/M). Choi e altri hanno sintetizzato dei derivati del BTA 2-fenil sostituiti e ne hanno valutato
le capacità di inibire le topoisomerasi II. Il composto (42) ha mostrato la migliore
attività inibitoria con un IC50 di 71.7 μM, confrontabile all’agente antitumorale
etoposide che ha IC50 di 78.4 μM. Inoltre sembra possedere una citotossicità selettiva
verso le cellule di cancro mieloide leucemico (IC50 = 0.02 μM) [68].
I derivati 2-fenil/benzil-sostituti BTA e i loro sali sono stati studiati sulle topoisomerasi I e II del DNA eucariota. Il sale N-amino tosilato (43) del 2-bromobenzil-BTA è
risultato essere il composto più efficace con un valore IC50 di 39.4 µM,
significativamente più attivo dell’etoposide [69]. È stato riportato che i composti che hanno un singolo anello biciclico nella loro struttura, come nel caso del BTA, presentano una significativa attività inibitoria verso la topoisomerasi II [70]. Il triidrossibenzoil-2-aminobenzotiazolo (44) e il derivato diidrossi (45) hanno mostrato di
inibire la topoisomerasi I, con valori di IC50 di 8.2 e 16.9 μM, rispettivamente mentre i
derivati monoidrossi non hanno alcuna attività inibitoria verso la topoisomerasi I. Quindi dagli studi SAR, si evince che aumentando i gruppi idrossilici sui due anelli aromatici si ha un incremento dell’attività mentre diminuendo il numero di gruppi idrossilici diminuisce le loro attività [71].
31 N S NH2 CH3 S N H + Br SO3 -C H3 (42) (43) S N NH O OH OH OH S N NH O OH OH (44) (45)
3.2.3 BTA come inibitori della polimerizzazione dei microtubuli
I microtubuli sono lunghe fibre del citoscheletro, strutture intracellulari costituite da una
classe di proteine chiamate tubuline.I microtubuli costituiscono assieme
ai microfilamenti e ai filamenti intermedi del citoscheletro. La loro funzione principale è l'organizzazione e il trasporto intracellulare, ma assicurano anche una certa stabilità meccanica alla cellula. I microtubuli sono coinvolti nei processi cellulari e giocano un ruolo essenziale nella mitosi, specialmente nell’induzione dell’apoptosi. La mancata formazione di microtubuli può risultare nell’arresto del ciclo cellulare e nella morte delle cellule. Gli inibitori della polimerizzazione della tubulina si legano a uno qualsiasi dei tre siti di legame [72], stabilizzando o destabilizzando i microtubuli [73]. La scoperta di inibitori dei microtubuli, quindi, è un’attraente strategia per la terapia contro il cancro. Infatti composti che hanno come bersaglio la tubulina come i taxani, gli alcaloidi della vinca e i combretastatini sono stati ampiamente utilizzati nel trattamento di molti tumori [74,75]. La povera biodisponibilità e i frequenti fenomeni di resistenza di questi farmaci hanno spinto i ricercatori a valutare nuovi inibitori della polimerizzazione dei microtubuli con bassi effetti collaterali, poca resistenza e buona attività orale [76,77]. I coniugati calcone-amidobenzotiazolo si sono dimostrati dei promettenti antitumorali. Di questa classe di composti, i derivati (46,47) presentano una
32
potente attività con valori di IC50 che vanno da 0.85 a 3.3 μM nei confronti di diverse
linee cellulari tumorali. Dall’analisi citometrica di questi composti è risultato che il ciclo cellulare si arresta alla fase G2/M in una linea cellulare A549, portando alla morte della cellula caspasi-3 dipendente. I composti (46) e (47) hanno determinato la polimerizzazione della tubulina, con valori di IC50 di 3.5 e 5.2 μM, rispettivamente. Inoltre un’analisi di immunofluorescenza ha dimostrato che questi composti effettivamente inibiscono il complesso dei microtubuli sia a livello molecolare sia a livello cellulare, nelle cellule A549 [78]. Altro composto interessante è quello formato da 2-fenil BTA e imidazolo. Il composto (48) è molto efficace nell’arrestare il ciclo cellulare G2/M in differenti linee cellulari. L’inibizione della tubulina è associata all’arresto del ciclo cellulare G2/M interrompendo la separazione dei cromosomi e colpendo la formazione del fuso mitotico [79].
OCH3 H3CO H3CO O O N H O N S (46) OCH3 H3CO H3CO O O N H O N S O CF3 (47) S N OCH3 H3CO H3CO N N OCH3 H3CO (48)
33 3.2.4 BTA come inibitori del citocromo P450
Gli enzimi del citocromo P450 (CYP) sono enzimi eme-tiolati presenti in tutti i domini dei viventi e appartenente alla sottoclasse enzimatica delle ossidasi a funzione mista o monoossigenasi [80]. I citocromi P450 sono i maggiori attori coinvolti nella detossificazione dell’organismo, essendo coinvolti nel metabolismo (ossidazione ed eliminazione) di un largo numero di molecole sia esogene, come prodotti naturali, farmaci, e cancerogeni ambientali e composti endogeni come gli ormoni e prodotti di scarto dell’ organismo. Esempi di reazioni catalizzate dal citocromo P450 sono
l’ossidrilazione di composti alifatici o aromatici, la formazione di epossidi e
l’ossidazione di alcoli.
La famiglia del citocromo P450 rappresenta il principale meccanismo di detossificazione dell’organismo per i farmaci, ed è una delle cause alla base della variabilità del rapporto dose/risposta in soggetti differenti che assumono lo stesso farmaco [81]. Il differente range di risposta può infatti derivare, oltre che da fattori fisiologici come l’età, il sesso e lo stato di salute dell’individuo, da una differente velocità di metabolizzazione del principio attivo, derivante a sua volta da un polimorfismo genetico nel citocromo P450. Uno più lento smaltimento della molecola farmacologicamente attiva può portare ad una sua eccessiva permanenza nell’organismo, e quindi al manifestarsi di effetti collaterali dovuti al sovradosaggio, mentre un’eccessiva attività del citocromo aumenta la velocità di smaltimento del farmaco e può portare ad una diminuzione del suo effetto o anche alla mancanza di effetti clinici. Il metabolismo dei cancerogeni, dei pro-cancerogeni e dei chemioterapici a causa del CYP gli conferisce un ruolo indiscutibile nella prevenzione del cancro e nelle strategie di trattamento. Numerosi studi hanno confermato un ruolo importante per
i CYP nella formazione del tumore e nel suo sviluppo.
L’inibizione dei CYP è un’area ampiamente trattata nella ricerca per il trattamento e la prevenzione del cancro.
Il 2-(-4amino-3-metilfenil)-5-fluorobenzotiazolo (49) appartiene alla nuova generazione degli antitumorali derivati del BTA. L’induzione del citocromo P450 CYP1A1 è un evento cruciale nel determinare la specificità antitumorale dei BTA [82], inoltre il 2-(4-amino-3-metilfenil)benzotiazolo (50) è un potente agente antitumorale con buone e selettive capacità inibitorie della crescita cellulare in varie linee cellulari di tumore
34 cellulare di cancro al seno, MCF-7 e T-47D. L’accumulo e il metabolismo di (50) sono stati osservati solo in linee cellulari sensibili [83].
F N S CH3 NH2 N S CH3 NH2 (49) GI50 (MCF-7) <0.1µM (50) IC50 (MCF-7)<0.001µM
3.2.5 Altri agenti antitumorali a base BTA
Kamal e i suoi collaboratori hanno riportato i derivati di triazolobenzotiadiazine-BTA e ne hanno valutato la citotossicità contro 60 linee cellulari umane tumorali. Alcuni di questi composti hanno mostrato un buon effetto inibitorio contro varie linee cellulari, in particolare il composto (51) ha inibito con una percentuale superiore al 90 % la crescita delle linee cellulari del polmone e della leucemia, mentre il composto (52), che è risultato essere il membro più attivo della serie, ha mostrato una significativa inibizione della crescita in quasi tutte le 60 linee cellulari e ha presentato una buona azione citotossica contro le linee cellulari di cancro polmonare, al seno, ovarico, renale, CNS e melanoma [84]. N S N N N O O O CH3 O CH3 N S Y
35 N S N N N (CH2) O O CH3 S N S OC2H5 (52)
Una classe interessante di composti è costituita dai coniugati
BTA-pirrolobenzodiazepinici che sono stati sintetizzati inserendo diversi distanziatori alchilici o alchilamidici e ne sono state valutate le attività antitumorali. Sono stati effettuati studi sulla denaturazione termica del DNA, analisi di digestione con endonucleasi di restrizione e analisi del flusso citometrico nelle linee cellulari del melanoma umano (A375). Il composto (53) ha mostrato una pronunciata attività antitumorale in vitro contro 60 linee cellulari tumorali. Havrylyuk ed altri hanno progettato la sintesi di una serie di derivati BTA-tiazolidinone, tra questi i composti
(54,55) hanno mostrato una buona attività antitumorale sulle linee cellulari della
leucemia, del melanoma, del cancro al polmone, al colon, CNS, ovarico, renale, alla prostata e al seno. In particolare, il composto (54) è risultato il più attivo con valori di
logGI50 e di logTGI di 5.38 e 4.45, rispettivamente. L’introduzione di un gruppo
4-clorofenossido-N-(4-metossifenil)-acetammide in posizione 5 del nucleo tiazolidinico
(54,55) risulta incrementare la potenza di questo tipo di composti [85].
S N Ar NH N S S O S N H Ar O NH N S CH3 (54) (55)
36 Lee e i suoi collaboratori hanno sintetizzato analoghi BTA-isatina e ne hanno valutato gli effetti citotossici su tre linee cellulari di tumore al seno: MB468, MDA-MB231 e MCF7, e su due linee cellulari epiteliali non-tumorali, 184B5 e MCF10A. Alcuni di questi derivati hanno mostrato una promettente attività contro il tumore al seno, e in particolare, il composto (56) risulta più potente rispetto al farmaco di riferimento Cisplatino. Gli studi SAR hanno rivelato che, l’introduzione di un sostituente idrofobico come un cloro (57b) o un bromo (57c) in posizione 4 del raggruppamento 1-dietilamino-metil-1H-indol-2,3-dione (57a) porta ad un aumento dell’attività citotossica sulle cellule di MDA-MB468, MDA-MB231 e MCF7 rispetto al composto non sostituito.
N N O N S CH3 N N O N O N R O N CH3 CH3 N N S CH3 (56) (57a-c)
I composti BTA α-aminofosfati sintetizzati da Jin e altri, sono stati valutati per le loro attività antitumorali in vitro contro cellule di PC3 (prostata), A431 (carcinoma epidermoide dell’epidermide), A375 (cellule epiteliali di adenocarcinoma alveolare) e con il metodo MTT (test colorimetrico che permette di stimare il numero di cellule vive presenti in coltura e quindi di valutare l’effetto del trattamento con un contaminante sulla vitalità della popolazione cellulare), è stata inoltre studiata la vitalità cellulare. Il composto (58) è altamente efficace contro cellule PC3 mentre ha un’azione moderata contro le cellule A431. Dagli studi SAR risulta che il composto che presenta la porzione Bu-fosfonata ha un’ attività maggiore rispetto a quelli con un sostituenti Et e n-Pr. La presenza del fluoro e dei gruppi alchilici influenza l’attività antitumorale nelle cellule A431 e PC3 [86].
37 C H3 S N NH P O F (OBu)3 (58)
Wang e collaboratori hanno riportato la sintesi e l’attività antiproliferative sulle cellule HepG2 e MCF7 di derivati 2-tiolo-BTA. I composti (59,60) hanno mostrato buone attività antitumorali contro diversi tipi di linee cellulari di cancro umane in vitro, con valori di IC50 nel range 1.1-8.8 μM. Gli studi SAR hanno rivelato che il clorometile potrebbe migliorare significativamente l’attività antitumorale di questa serie di derivati BTA [87]. Cl N H S O S N N H O O CH3 (59) N H S O S N N H O Cl (60)
Altri composti interessanti sono i 2-amino BTA progettati da Manjula e collaboratori che li hanno valutati, con il metodo MTT, per la loro citotossicità in vitro contro le cellule del tumore ascitico di Ehrlich (EAC-Ehrlich Ascites Carcinoma) e due linee cellulari tumorali (MCF-7 e Hela). Il derivato BTA-tiourea (61) è risultato essere il più efficace mentre altri composti hanno mostrato un’attività moderata. Gli studi SAR
38 dimostrano che una sostituzione con une atomo elettronegativo come il cloro o il bromo in posizione para dell’anello aromatico aumenta la liposolubilità delle molecole ed è responsabile della maggiore citotossicità nel modello MTT [88].
C H3 NH C H3 H S N Cl F (61)
I coniugati di aminobenzotiazolpirazolo[1,5-a]pirimidina sono stati sintetizzati e valutati per la loro attività antitumorale contro 5 linee cellulari tumorali (A549, Hela, MCF-7, HT-29, e ACHN). Alcuni di questi composti hanno mostrato promettenti attività
antitumorali con valori IC50 che vanno da 1.94 a 41.68 μM contro le diverse linee
cellulari tumorali. Specialmente i composti (62,63) hanno mostrato valori IC50 tra 1.94 e 3.46 μM e tra 2.01 e 7.07 μM, rispettivamente. Gli studi hanno inoltre rivelato che i composti (62) e (63) causano l’arresto del ciclo cellulare G2/M nella linea tumorale A549 e una riduzione nel livello d’espressione di Cdk1. Dagli studi SAR, si evince che la presenza di sostituenti quali 3,4,5-trimetossi, 4-fluoro o 4-metossi sull’anello fenilico del nucleo pirazolo[1,5-a]pirimidinico incrementa la citotossicità di questi composti. In particolare, i due derivati 3,4,5-trimetossi e 4-fluoro sostituiti, hanno evidenziato l’attività antitumorale migliore [89].
N N N N H N S F O C6H5 N N N N H N S H3CO O C6H5 H3CO OCH3 (62) (63)
39 I derivati isossazoli e triazoli 2-fenil-BTA hanno presentato una significativa attività
antitumorale con valori di IC50 nel range 26-43 μM contro le linee cellulari di MCF-7,
11-24 μM contro le cellule di A549 ed infine 11-21 μM contro le cellule Colo-205 (cellule tumorali del colon). Il composto (64) ha mostrato una buona citotossicità contro le cellule Colo-205 e A549, con un valore di 11 μM, in confronto con lo standard PMX 610. Gli studi SAR hanno rivelato che l’introduzione di un atomo di fluoro, in particolare il gruppo CF3, sulla posizione 3 del composto (64) aumenta l’attività citotossica. In maniera simile, i derivati del triazolo hanno anch’essi condotto ad un aumento dell’attività citotossica [90].
N S O N N N CF3 (64)
Gli inibitori degli enzimi istone deacetilasi di classe I e II (HDAC) rappresentano una grande potenzialità nel trattamento del cancro. Oanh e altri hanno sintetizzato dei derivati BTA-idrossamici e hanno valutato la citotossicità dei composti contro 5 linee cellulari tumorali, incluse SW620, MCF-7, PC3, AsPC-1 e NCIH460. Tre composti
65(a-c), i quali hanno mostrato apparente inibizione di HDAC a 1 μg/mL, si sono
rivelati i più citotossici con un valore medio IC50 tra 5.49 e 0.81 μg/mL [91]. I derivati di 4-BTA amino-chinazolina sono stati sintetizzati e indagati per la loro
attività citotossica in vitro con il metodo MTT contro 6 linee cellulari tumorali (HCT-116, DLD1, K562, U937, A549 e NCI-H661) e comparate con il farmaco di riferimanto Dasatinib. La maggior parte dei composti, ed in particolar modo i composti 2,4,6-trimetilanilinici (66,67) hanno mostrato buoni effetti di antiproliferazione anche se con
valori di IC50 minori rispetto al Dasatinib in 6 linee cellulari. I composti
2-metilpiperidinici hanno migliore attività citotossica rispetto ai composti con morfoline [92].
40 N S N H [ ]3 NHOH R O O
(65a-c) a)R=CH3/ b)R=OCH3/ c)R=NO2
N CH3 O N N O C H3 N H N S N H O C H3 CH3 CH3 (66) N O O N N O C H3 N H N S N H O C H3 CH3 CH3 (67)
I coniugati BTA-pirazolo-chinoloni sono stati sintetizzati e valutati per le loro attività antiproliferative in vitro contro 4 linee cellulari tumorali: MDA-MB-435 (seno), HL-60 (leucemia), HCT-8 (colon), e SF-295 (sistema nervoso centrale). I composti 68(a,b)
hanno evidenziato una buona citotossicità per 3 linee cellulari con valori IC50 minori di
5 μg/mL. Il composto (68a) è risultato molto attivo contro il cancro al seno
(MDA-MB-435) con una IC50 di 2.3 μg/mL e moderatamente attivo contro le linee cellulari di
cancro al colon (HCT-8) e del sistema nervoso centrale (SF-295) (IC50 rispettivamente
41
cellulari MDA-MB-435 e HL-60 con valori di IC50 rispettivamente di 1.6 e 3.0 μg/mL.
Il composto (68b) ha inoltre esibito una moderata attività contro SF-295 con un valore IC50 di 4.1 μg/mL [93]. N H N N N S C H3 O N H N N N S Br O (68a) (68b)
Derivati 2-aminobenzotiazolici sono stati descritti da Noovi e altri. Il composto (69) con valori di GI50 di 7.18 x 10-8 M contro il carcinoma polmonare non a piccole cellule (HOP-92) si è rivelato il più attivo. Gli studi di SAR hanno dimostrato che, ai fini dell’attività, la presenza di un raggruppamento anilinico in posizione C-2 dell’amina come regione idrofobica è necessaria, e che la presenza di un gruppo elettronattrattore sull’anello BTA e sull’anilina contribuiscono all’aumento dell’attività antitumorale [94]. I composti BTA-pirrolo hanno mostrato una significativa attività antiproliferativa contro le linee cellulari di cancro al seno (MCF-7) con valori di IG50 compresi tra 1-4 μM, specie nel caso del derivato (70). La stessa molecola ha anche mostrato una bassa regolazione dell’espressione oncogenetica del Ras e delle molecole a valle come MEK1, ERK1/2, p38 MAPK e VEGF [95].
Inoltre sono stati proposti derivati che coniugano il BTA con piperazina, morfolina, piperidina e valutati per le loro attività antitumorali contro linee cellulari di cancro al seno, MCF-7 e MDA-231. Il derivato N-metilpiperazinil sostituito (71) ha manifestato
la migliore attività inibitoria con valori IC50 nel range 8-17 nM. Il metilpiperazina-BTA
è più potente rispetto agli analoghi morfolina e piperidina sostituiti [96].
N S Cl NH Cl Cl (69)
42 N S NH O C H3 N CH3 H3CO H3CO OCH3 (70) S N NH N N O CH3 (71)
43
3.3 BTA COME AGENTE ANTI-ALZHEIMER
Il morbo di Alzheimer (AD) è un disordine neurodegenerativo progressivo tra i più comuni nella popolazione anziana ed è caratterizzato principalmente da: diffusa perdita di neuroni, deposito intracellulare di grovigli neurofibrillari (NFT) costituiti da proteina tau iperfosforilata e deposito extracellulare di placche senili costituite dal peptide β-amiloide. L’eziologia della malattia è in gran parte sconosciuta ma diversi studi, principalmente di tipo genetici, hanno dimostrato che la cascata amiloide è l’evento cruciale nello sviluppo della malattia. Nonostante negli ultimi anni c’è stato un grande interesse nella ricerca di nuovi farmaci anti-AD, fino ad oggi gli inibitori dell’acetilcolinesterasi (ACEIs) rappresentano la prima e l’unica classe di farmaci presente sul mercato [97,98]. Gli esempi di composti ad azione anti-AD presenti in letteratura sono tanti, e tra questi anche alcuni derivati del BTA.
Recentemente è stata riportata una serie di composti ibridi tacrina-BTA come AChEI e inibitori dell’aggregazione della β-amiloide. Tutti gli ibridi tacrina-BTA hanno
mostrano un’alta attività in vitro come inibitori di AChE con valori di IC50 nel range
del micromolare-submicromolaree e alte percentuali di inibizione dell’aggregazione Aβ autoindotta. Il composto (72) che presenta un linker più corto ha la migliore attività
AChEI (IC50=0.34 µM), mentre il composto (73) ha mostrato la massima attività come
inibitore dell’autoaggregazione Aβ42(61.3% a 50 µM) [99].
Huang e altri, hanno studiato altri derivati tacrina-BTA, tra cui il composto (74), dove la tacrina è legata al fenil-BTA tramite un linker a 3 atomi di carbonio, è il più potente
inibitore AChE con IC50=0.017 µM. Il composto (74) ha anche mostrato un’attività
inibitoria dell’aggregazione Aβ di 52.1% a 20 µM, indicando che questo ibrido è un
eccellente farmaco multifunzionale potenzialmente utile nel morbo di Alzheimer [100].
N N H ( )5 N H O S N N N H ( )5 N H O S N (72) (73)
44 N N H ( )3 O O N S (74)
Altro aspetto importante dei farmaci attivi nell’AD, è l’inibizione della butirrilcolinesterasi (BuChE), la quale è maggiormente presente a livello epatico e plasmatico e ha un’affinità nettamente minore per l’acetilcolina rispetto all’AChE. I derivati 6-fluoro-BTA sono stati sintetizzati e testati come inibitori dell’AChE e della BuChE. I composti 75(a,b) hanno mostrato la massima attività inibitoria per l’AChE, ed in particolare il composto (75c) è il migliore inibitore della BuChE. Dagli studi di SAR, si può dedurre che la catena n-propilica è necessaria per entrambi i tipi di inibizione AChE e BuChE e per la massima attività AChEI, mentre la sostituzione della lunga catena alchilica con un carbammato incrementa l’inibizione verso la BuChE [101].
F S N N H C H3 O CH3 NH O R O (75 a-c) a) R=CH2CH(CH3)2; b) R=CH(CH3)2; c) R=CH2CH3
