D
IPARTIMENTO DI
F
ARMACIA
Corso di Laurea Magistrale in Farmacia
TESI DI LAUREA
GLI INIBITORI DELLE CHINASI COME TERAPIA
AVANZATA NELL’ASMA GRAVE E NELLA BPCO.
RUOLO DELL’IMATINIB
Relatore:
Prof.ssa Maria Cristina Breschi
Candidato:
Gabriele Carratori
Indice
1.Introduzione...….3
2. Ruolo delle protein chinasi nell’asma e nella BPCO...5
3. Chinasi...7
3.1 Inibitori delle chinasi...8
4. Inibizione del fattore nucleare-kappaB...11
4.1 Ruolo nell’asma e BPCO...11
4.2 Inibitori...14
5. Inibizione delle MAP-chinasi...18
5.1 MAPK p38...20
5.1.1 Ruolo nell’asma e nella BPCO...21
5.2 Inibitori di p38...23
5.3 Inibitori delle chinasi Jun NH2-terminali (JNK)...25
5.4 Chinasi di regolazione extracellulare (ERK) / inibitori MAP-chinasi………...27
5.5 Inibizione della chinasi ASK-1...28
5.6 Inibizione delle chinasi TAK-1...29
5.7 Inibizione di MAPKAPK2...30
6. Fosfatidilinositolo-3-chinasi(PI3K)...32
6.1 Ruolo nell’asma e BPCO...33
6.2 Inibizione di PI3K-Akt-mTOR...38
6.2.1 Inibitori PI3K...38
6.2.2 Inibitori Akt – mTOR...41
6.2.3 Attivatori degli inibitori endogeni...41
7. Inibizione delle Janus chinasi (JAK)...45
7.1 Ruolo nell’asma e nella BPCO...46
7.2 Jakinibs...48
8. Inibizione della tirosin-chinasi splenica(Syk)...50
8.1 Ruolo nell’asma e nella BPCO...50
8.2 Inibitori della tirosin-chinasi splenica...54
9. Recettori tirosin-chinasici(RTK)...55
9.2 Inibitori dei recettori tirosin-chinasici...57
9.3 Inibitori c-Kit...58
10. Chinasi del recettore del fattore di crescita trasformante-beta...59
10.1 Ruolo nell’asma e BPCO………...60
10.2 Inibitori della T-betaRI chinasi...60
11 Inibizione della protein chinasi C(PKC)...63
11.1 Ruolo nell’asma e BPCO...63
11.2 Inibitori della protein chinasi C...64
12. Altre chinasi come target terapeutici...66
12.1 Inibizione della proteina chinasi associata a Rho...66
12.2 Inibizione della proteina chinasi associata al recettore per l’interleuchina-1…...67
12.3 Inibizione delle proteine chinasi appartenenti alla famiglia Src...68
12.4 Inibizione delle proteine chinasi della cellula staminale ematopoietica…………...69
12.5 Tirosin-chinasi di Bruton...69
13. Ruolo dell’ Imatinib, farmaco oncologico efficace anche contro l’asma grave...70
13.1 Considerazioni sui risultati ottenuti dalla sperimentazione clinica...73
14. Nuovi sviluppi per il futuro...75
14.1 Migliorare la selettività e la sicurezza...75
14.2 Sopprimere l’attività di più chinasi...77
14.3 Eliminare la resistenza ai farmaci chinasi-inibitori...78
14.4 Conclusioni...78
Abbreviazioni...79
Capitolo 1
Introduzione
Asma e broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) sono causa di ostruzione e infiammazione cronica nelle vie respiratorie. Entrambe sono patologie oggi giorno sempre più frequenti in tutto il mondo. L’asma è attualmente la più comune affezione cronica nei paesi sviluppati: circa il 20% della popolazione mondiale ne è affetta, percentuale sempre più in aumento (Beasley et al.,2000). Essa è ancora causa di morte e di ricoveri ospedalieri per via degli aggravamenti che determina sulla salute e sulla condizione di vita del paziente. Sebbene sia di solito ben controllata attraverso l’utilizzo di inalatori a base di corticosteroidi, la terapia risulta molto difficile da far rispettare ai pazienti che dimostrano un uso inappropriato degli inalatori(Partridgeet al, 2006); approssimativamente per il 20% dei pazienti affetti da asma ne resta
difficile l’utilizzo, mentre il 3-5% dei pazienti presentano la patologia ad uno stadio talmente avanzato che non riescono a controllarla persino con massivi trattamenti per via inalatoria di corticosteroidi o beta2-agonisti (Chung e Wenzel). Esiste quindi un bisogno concreto di sviluppare nuove terapie per i pazienti che utilizzano
eccessivamente questi farmaci. Anche la BPCO è molto comune: si riscontra oggi nel 10%della popolazione sopra i 45 anni nei paesi sviluppati ed è in aumento
soprattutto negli anziani. Presenta un tasso di morbilità molto alto ed è una delle maggiori cause di ricoveri ospedalieri e di conseguente assenteismo dal lavoro. E’ caratterizzata da un trend crescente di mortalità ed è la terza causa di morte nei paesi sviluppati (Lozano et al. 2012). Nessun trattamento in particolare, corticosteroidi inclusi, riesce a fermare la progressione della malattia, ciò è dovuto al fatto che nessuna terapia è in grado di esplicare gli effetti anti-infiammatori richiesti per
debellare tale affezione. E’ di fondamentale importanza quindi trovare nuove cure per la BPCO che abbiano come obiettivo primario quello di contrastare il processo
infiammatorio utilizzando meccanismi d’azione alternativi (Barnes, 2013b). Sebbene Asma e BPCO presentino differenti processi d’infiammazione, alcuni pazienti affetti
da BPCO potrebbero manifestare sintomi asmatici come il reclutamento di eosinofili con una parziale reversibilità dell’ostruzione bronchiale. Al contrario pazienti asmatici potrebbero presentare sintomatologie tipiche della BPCO, come neutrofilia, ridotta reversibilità dell’ostruzione bronchiale e ridotta risposta ai corticosteroidi. In questi casi i pazienti sono affetti da una malattia denominata sindrome da
sovrapposizione di asma e BPCO e richiedono al più presto nuove cure(Barnes
2015b). Poiché l’infiammazione cronica coinvolge molteplici segnali di attivazione da parte delle chinasi (Cohen,2002), lo sviluppo di nuove terapie si è focalizzato sulla ricerca di inibitori selettivi per queste proteine in modo tale da poter fronteggiare tutti i pazienti che non godono di nessun beneficio dalle cure esistenti oggi. Il ruolo di queste chinasi sembrerebbe sempre più determinante anche nella resistenza ai corticosteroidi, altra caratteristica importante per la nascita dell’ asma grave e della BPCO (Barnes et al., 2009). Lo sviluppo di inibitori di chinasi per patologie
infiammatorie si è rivelato tuttavia molto difficile in quanto questi farmaci agiscono a livello sistemico. In teoria tale ostacolo potrebbe essere superato somministrando inibitori selettivi attraverso l’uso di inalatori, ma risulta in ogni caso difficile trovare molecole specifiche che agiscano solo a livello delle vie respiratorie. In questo lavoro vengono riassunte le potenzialità degli effetti ottenuti tramite utilizzo degli inibitori delle protein chinasi nelle infiammazioni delle vie respiratorie.
Capitolo 2
Ruolo delle protein chinasi nell’asma e nella BPCO
Sia asma che BPCO causano una risposta infiammatoria a livello del parenchima polmonare che comporta il reclutamento e l’attivazione di moltepici cellule del sistema immunitario nonché la secrezione di fattori infiammatori, inclusi mediatori lipidici,citochine, chemochine,fattori di crescita e gli enzimi che contribuiscono alla formazione di tutti i prodotti implicati nel processo infiammatorio e nel processo ricostitutivo dei tessuti. Molte delle proteine aventi origine infiammatoria sono regolate da fattori di trascrizione pro-infiammatori come ad esempio il Fattore Nucleare-kB(NF-kB) e l’Attivatore Proteico-1 (AP-1) i quali sono mediati a loro volta da vie di segnalazione chinasiche. Inoltre, questi mediatori agiscono sui recettori di membrana delle cellule bersaglio nelle vie respiratorie e attivano le chinasi ad essi associate. In caso di asma, gli allergeni possono essere un fattore decisivo nella risposta infiammatoria allergica ed evidenzia il collegamento tra questi e le immunoglobuline E (Ig E) legate ai mastociti, con la conseguente attivazione delle chinasi che provoca il rilascio di Istamina e mediatori lipidici come Cisteinil-Leucotrieni e prostaglandine. L’allergene viene anche captato dalle cellule
dendritiche: ciò induce le chinasi a promuovere il reclutamento dei linfociti T helper 2 che, raggiunto il tratto respiratorio, medieranno il reclutamento degli eosinofili e l’ iperreattività delle vie aeree, ovvero le cause scatenanti dell’asma.(Barnes,2011). Anche l’immunità innata gioca un ruolo chiave nell’asma: in particolare nelle sue forme più gravi e non in quelle di tipo allergico sono coinvolte le cellule linfoidi innate di tipo 2 (ILC-2)(Scanlon and McKenzie,2012).I meccanismi dell’immunità innata e i recettori per il riconoscimento dei profili(pattern recognition receptors), ad esempio i recettori Toll-like, vengono attivati dal fumo della sigaretta oppure dal fumo della combustione del legno( fattori entrambi determinanti per lo sviluppo della BPCO) e dagli agenti patogeni come i batteri colonizzanti. Le MAP-chinasi (mitogen-activated protein kinase) giocano un ruolo chiave nell’attivazione sia delle cellule dell’immunità
innata che delle cellule dell’immunità acquisita: esse permettono la secrezione di molteplici citochine,chemochine e fattori di crescita che poi attiveranno ulteriori processi infiammatori.(Arthur and Ley, 2013).La BPCO rappresenta una vera e
propria accelerazione del normale processo d’invecchiamento del tessuto polmonare, meccanismo anch’esso regolato da molte protein chinasi.
Capitolo 3
Le chinasi
Le chinasi sono enzimi che trasferiscono il fosfato dell’adenosina-trifosfato (ATP) ai substrati aventi gruppi ossidrili e quindi fosforilano proteine, lipidi e zuccheri,
attivando altri enzimi o promuovendo interazioni cellulari con altre proteine. Sono di fondamentale importanza per la trasduzione del segnale. Nell’uomo sono stati
riconosciuti più di 500 geni codificanti per queste proteine: esse costituiscono il 2% del genoma (Chinoma) e più del 30% delle proteine attivate dalla fosforilazione (Manning et al. 2002). Sono organizzate all’interno di diverse famiglie, ad esempio le MAP-chinasi(MAPK). La maggior parte delle chinasi fosforilano residui di serina e treonina (serina/treonina-chinasi), mentre le altre fosforilano entrambi i residui. Le tirosin-chinasi possono esplicare la loro azione agendo come recettori per
determinati ligandi come il fattore di crescita per l’epidermide (EGFR). Poiché le chinasi sono molto importanti per la trasduzione, vengono strettamente controllate dalle fosfatasi, le quali rimuovono gruppi fosfato bloccando di conseguenza la loro azione. Questi enzimi sono costituiti da più domini, uno dei quali ad attività catalitica che lega ATP. La maggior parte di esse esplica la propria azione su proteine, lipidi (ad esempio il fosfatidil-inositolo), carboidrati(esochinasi) o nucleotidi(timidina chinasi). Le protein chinasi sono selettive per i residui di serina/treonina o tirosina all’interno delle loro proteine bersaglio, e riconoscono una specifica sequenza consenso
localizzata su questi residui piuttosto che un particolare target proteico (Fabbro et al. 2015). In ogni caso, non esiste una chinasi specifica per una determinata proteina, esse infatti possono agire su diversi bersagli proteici aventi tutti la sequenza-consenso riconosciuta. Pseudosubstrati si legano poi alle chinasi, essi però non presentano l’amminoacido fosoforilato e quindi agiscono da inibitori chinasici. Le chinasi sono organizzate tramite vie di segnalazione in base alle quali una di esse fosforilerà una chinasi, e quest’ultima fosforilerà in sequenza la chinasisuccessiva. Ognuna di esse inoltre può fosforilare più chinasi, in modo da creare un segnale a
cascata dove più chinasi collaboreranno al fine di ottenere un’amplificazione oppure un’inibizione del segnale. Questo rende la trasduzione del segnale molto complessa e risulta spesso difficile capire gli effetti derivanti dall’inibire una singola chinasi. Ci sono poi ulteriori meccanismi a feedback che, una volta interrotta la comunicazione tra le chinasi, potrebbero produrre effetti inaspettati.
3.1 Inibitori delle chinasi
La scoperta del ruolo delle chinasi nel regolare la proliferazione cellulare, l’apoptosi, l’infiammazione e soprattutto la scoperta che eventuali mutazioni dei geni codificanti per esse sia alla base di molte patologie del sistema immunitario, ha indirizzato una ricerca specifica nell’individuare, al fine di contrastare molte malattie umane, piccole molecole selettive ad azione inibitoria per le chinasi. Oggi infatti,molti composti classificati come inibitori di chinasi sono stati approvati nell’uso contro il cancro (Wu et al. 2015c), e sebbene molte delle ricerche su nuovi farmaci riguardino
prevalentemente terapie antineoplastiche, gli inibitori chinasici vengono tuttavia classificati come potenziali nuove terapie contro molte disfunzioni del sistema immunitario e processi d’infiammazione cronica.(Cohen,2014). Al momento gli inibitori chinasici fanno parte della più grande categoria di farmaci in via di sviluppo, secondi soltanto ai ligandi per recettori accoppiati a proteine G, rappresentando il 30% dei nuovi studi scientifici da parte delle maggiori case farmaceutiche (Wu et al. 2015c). Essendo sia asma che BPCO fortemente collegate a processi infiammatori nonché all’intervento del sistema immunitario, ci sono stati enormi sforzi per sviluppare nuove terapie a base di inibitori delle chinasi soprattutto in quei campi della medicina dove ancora oggi non esistono cure soddisfacenti(Adcock et al. 2006). Lo sviluppo di questi inibitori si è rivelato molto difficile poichè il sito catalitico delle differenti protein chinasi è ben protetto e la maggior parte degli inibitori ha come target il sito di legame con l’ATP. Molti inibitori risultano quindi scarsamente selettivi, e spesso esplicano la loro azione su chinasi simili rischiando di provocare l’insorgenza di effetti collaterali. Altro problema relativo all’utilizzo di questi inibitori, è la frequente comparsa di meccanismi di resistenza: questo accade a causa di
mutazioni relative al sito di legame con l’ATP. Per quanto riguardano invece le terapie contro le infiammazioni croniche, si registra una perdita di efficacia degli inibitori a
causa dell’insorgergenza del fenomeno di up-regulation che compensa la via di trasduzione chinasica. Ad esempio gli inibitori di p38 MAPK, utilizzati contro l’artrite reumatoide, possono perdere nel tempo la loro efficacia poiché incombono
meccanismi di up-regulation dove intervengono altre chinasi pro-infiammatorie che trasmettono il segnale.(Firestein et al.2008). Ciò potrebbe essere evitato se fossero bloccate più chinasi a monte della risposta infiammatoria, ma allo stesso tempo diverrebbe sempre più concreta la possibilità di ottenere effetti indesiderati.Finora la maggior parte degli inibitori di chinasi è stata somministrata per via orale, di
conseguenza gli effetti collaterali derivanti, erano tutti controllabili e spesso dose-dipendenti.In ogni caso, al fine di ridurre al minimo queste reazioni avverse, si è pensato alla potenziale attività degli inibitori allosterici i quali esplicano la loro funzione su siti bersaglio meno protetti(Wu et al. 2015b). Questi nuovi farmaci non necessitano di essere somministrati a dosi elevate per competere con le alte
concentrazioni di ATP e risultano essere più resistenti alle mutazioni. Inibitori di chinasi allosterici,come ad esempio il Trametinib (figura 1),
Figura 1. Trametinib, struttura chimica
sono oggi in fase di studio clinico per un futuro utilizzo contro il cancro. Altra scoperta molto recente è quella degli inibitori allosterici per le p38 MAPK, i quali riescono ad interagire anche in distretti lontani dal sito di legame con l’ATP. La somministrazione per via inalatoria potrebbe infine ridurre il rischio di reazioni indesiderate, poiché l’azione si manifesterebbe solo a livello delle vie respiratorie. Fino ad oggi è stato difficile sviluppare una somministrazione per via inalatoria con
buona attività topica. Questo a causa del fatto che le protein chinasi, trovandosi a livello intracellulare, necessitano di una diffusione del farmaco attraverso la cellula.
Capitolo 4
Inibizione del fattore nucleare-kappaB
4.1 Ruolo nell’asma e BPCO
Il fattore di trascrizione pro-infiammatorio NF-kB (nuclear factor-kappaB) si attiva nell’asma e nella BPCO e regola l’espressione di molteplici geni infiammatori come citochine, chemochine, proteasi, e inibitori di apoptosi partecipando attivamente alla risposta infiammatoria (Barnes and Karin, 1997). L’attivazione di NF-kb,
caratterizzata dalla migrazione delle sue due subunità costituenti (p65 e RelA) all’interno del nucleo cellulare, avviene prevalentemente nelle cellule epiteliali del tratto respiratorio o nei macrofagi e può essere innescata ad opera di citochine infiammatorie come (TNF-alfa e IL-1beta), da situazioni di stress ossidativo oppure dalla presenza di allergeni o batteri. Sembra che NF-kb abbia un ruolo chiave sia negli aggravamenti della BPCO che nelle crisi asmatiche acute, le quali di solito vengono scaturite da virus che invadono i tratti superiori delle vie respiratorie come i
Rinovirus(Caramori et al.2003). NF-kB può essere attivato direttamente dal rinovirus sempre a livello delle cellule epiteliali respiratorie(Footit et al.2016).Traccie
significative di questo fattore nucleare sono state rinvenute nei polmoni di pazienti deceduti a causa dell’asma (Caramori et al.2009). Il processo di attivazione di NF-kb e la conseguente trasduzione del segnale comporta la partecipazione di più chinasi che sono il vero e proprio obbiettivo dell’inibizione. La via di attivazione classica
(canonica) per gli stimoli infiammatori e le infezioni che comportano l’attivazione dell’ NF-kB, comprende il reclutamento del complesso IKK(kb-chinasi-inibitore) il quale è composto da due subunità catalitiche IKK-alfa e IKK-beta, e una subunità regolatoria IKK-gamma (o modulatore essenziale NF-kB)(Hayden e Ghosh,2012). Il complesso IKK fosforila le estremità dell’NF-kB(IkBs), indirizzandole alla
degradazione ad opera di proteosomi in modo tale da rilasciare i dimeri NF-kB, composti dalle subunità p65 e p50, che migrano verso il nucleo dove si legheranno ai
siti di riconoscimento per kB nelle regioni promotrici dei geni infiammatori e del sistema immunitario al fine di avviare l’attivazione della trascrizone. Questa risposta dipende principalmente dalla subunità IKK-beta(conosciuta anche come IKK2), che effettua la fosforilazione di IkB. Sebbene la via di attivazione canonica sia stata studiata più in dettaglio per l’asma e la BPCO, esiste un’altra via di attivazione alternativa (non canonica) che comporta l’attivazione di una chinasi a monte della cascata infiammatoria (NIK) la quale fosforila gli omodimeri IKK-alfa, rilascia RelB e processa da p100 a p52 in risposta a determinati composti della famiglia TNF come ad esempio la linfotossina beta(Sun,2012). Questo percorso alternativo porta al coinvolgimento di differenti geni e potrebbe quindi mediare altre funzioni del sistema immunitario rispetto a quelle mediate dalla via canonica. IKK-beta inibisce la maggior parte dei meccanismi pro-infiammatori, mentre IKK-alfa risponde soltanto a
stimolazioni da partedei linfociti B. La segnalazione non canonica avviene durante l’azione del sistema immunitario e nelle sue risposte adattative, ma il suo ruolo effettivo nell’asma e nella BPCO non è mai stato approfondito(Figura 2).
Figura 2. Schema riassuntivo della via di segnalazine del fattore nucleare-kB. A sinistra la via di segnalazione canonica che si attiva ad opera di citochine infiammatorie come TNF-a, interleuchine, lipopolisaccaride. Segue la fosforilazione del complesso IKK-inibitore che permette, alle subunità effetrici del fattore-kB p50 e p65, la migrazione all’interno del nucleo dove avverrà il legame con il DNA e la conseguente attivazione di citochine, chemochine e geni di proteasi. La via di segnalazione non canonica, nella parte destra dello schema, viene attivata dal CD40 e dalla linfotossina LT-beta che promuovono l’azione della chinasi NIK(NF-kb-inducing-kinase)la quale a sua volta attiverà gli omodimeri del complesso IKK,
permettendo la migrazione all’interno del nucleo e l’interazione con il DNA delle subunità effettrici(complesso RelB/p50). (Barnes, 2016)
4.2 Inibitori
L’inibizione di NF-kb risulta quindi un approccio più che logico per curare
l’infiammazione nell’asma e nella BPCO poiché esiste la prova del suo coinvolgimento così come del coinvolgimento di geni pro-infiammatori. Tuttavia, la soppressione dei geni che codificano NF-kB nei topi è letale, e in altri animali ha portato allo sviluppo di gravi patologie a prova del fatto che inibire l’azione di tale fattore è molto
rischioso. I corticosteroidi inibiscono l’attivazione di NF-kB nell’asma e nella BPCO, ma i pazienti che presentano le due affezioni in uno stadio avanzato,possono sviluppare resistenza (Barnes e Adcock, 2009). Anche la teofillina (figura 3)
Figura 3. Teofillina,struttura chimica
a livello del tratto respiratorio, attraverso l’inibizione di IKK, bloccaquesto fattore,
tuttavia per ottenere l’effetto desiderato sono necessarie dosi ad alte concentrazioni. Moltri altri composti naturali come i polifenoli nelle piante, sembrano avere effetti inibitori sul NF-kB. Ad esempio, il resveratrolo
(Figura 4)
Figura 4. Resveratrolo, struttura chimica
blocca la sua attività e il rilascio di citochine pro-infiammatorie da parte delle cellule epiteliali affette da BPCO in vitro. L’epigallochatechin-3-
gallato (figura 5),
estrattodel tè verde, annulla l’azione di IKK (sia IKK-alfa che IKK-beta) in cellule epiteliali in vitro.
Figura 5. Epigallochatechin-3-gallato, struttura chimica.
Molti altri inibitori IKK appartenenti a differenti classi di composti chimici sono stati sviluppati e hanno dimostrato in vitro di bloccare la traslocazione nucleare di p65, l’attivazione di geni pro-infiammatori nonchè di promuovere gli effetti
anti-infiammatori in vivo sugli animali.(Suzuki et al.,2011). Sono stati sviluppati sia inibitori diretti sia inibitori di tipo allosterico. L’utilizzo in grandi quantità di
oligodesossiribonucleotidi contro NF-kB blocca l’infiammazione allergica nei polmoni dei ratti sensibilizzati da ovalbumina, evidenziando un’importante inibizione del rilascio di citochine da parte dei linfociti T-helper 2. Un inibitore selettivo IKK-beta chiamato IMD-0354 (figura 6)
riduce l’infiammazione allergica e l’iperreattività delle vie respiratorie negli animali, attraverso l’inibizione dei linfociti T in circolo. Un altro inibitore IKK-beta
denominato Bay 65-1942 (figura 7)
Figura 7. Bay 65-1942, struttura chimica.
è risultato anch’esso efficace nel contrastare le infiammazioni allergiche polmonari dei ratti. Abbiamo infine un altro inibitore appartenente alla classse IKK-beta, TCPA-1 che, in sperimentazioni precliniche, ha presentato proprietà curative per le
infiammazioni con coinvolgimento di neutrofili indotte da inalazione di endotossine, ma non è attivo sulle infiammazioni indotte da elastasi. Gli inibitori IKK-beta hanno poi dimostrato una scarsa efficacia negli animali, soprattutto nelle infiammazioni polmonari indotte da fumo di sigaretta. Parecchi inibitori IKK-beta bloccavano il rilascio di citochine e chemochine nelle cellule della muscolatura liscia e nelle cellule epiteliali delle vie respiratorie ma erano ostacolati dalla liberazione di un inibitore IKK-beta mediata da adenovirus. Per evitare eccessive esposizioni sistemiche, è stato creato anche un composto ad uso inalatorio (PF-104), sempre inibitore di IKK che negli animali si è mostrato efficace su tipologie di infiammazioni polmonari indotte da endotossine inalate. Ainsliadimer-A (figura 8),
principio attivo derivante dalla fitoterapia cinese, è stato classificato come un potente inibitore selettivo di IKK-alfa/beta e si è mostrato efficace nel bloccare NF-kB sia nella sua via di segnalazione classica che in quella alternativa.Esso inibisce il rilascio di citochine infiammatorie in modelli di infiammazione sperimentali, e funzionerebbe quindi come potenziale farmaco antinfiammatorio.
Poiché NF-kB svolge un ruolo chiave contro le difese degli agenti patogeni, esistono delle concrete preoccupazioni che l’uso di inibitori possa aumentare l’insorgenza di infezioni. Esiste poi una correlazione non ben definita con le neoplasie: infatti se da una parte NF-kB è coinvolto nella genesi di tumori, la sua inibizione potrebbe portare comunque a proliferazione cellulare, ma tutt’oggi non sono ancora stati eseguiti test clinici soddisfacenti. IMD-1041 (figura 9),
Figura 9. IMD-1041, struttura chimica
profarmaco dell’inibitore IKK-beta IMD-0354, è stato testato su pazienti affetti da BPCO per verificare i suoi potenziali effetti antinfiammatori, ma le sperimentazioni sono state sospese a causa dei suoi effetti collaterali. Ulteriori inibitori IKK-beta sono oggi in fase di sperimentazione, ma non è stato pubblicato ancora nessun risultato e nessun composto è stato approvato.
L’impressione è che per ridurre gli effetti collaterali sia necessario lo sviluppo di un preparato per via inalatoria.
Capitolo 5
Inibizione delle MAP-chinasi
Le MAP-chinasi fanno parte di una grande famiglia di proteine ad attività chinasica implicate nel processo di trasduzione del segnale. Se in un primo momento sembrava fossero attivate esclusivamente da fattori mitogeni, oggi si è scoperto che queste proteine vengono innescate da più stimoli fra i quali citochine, fattori di crescita e più tipologie di stress (osmotico, ossidativo, shock termico) e compaiono in diversi
processi cellulari come proliferazione, differenziazione, mitosi, adattamento, apoptosi ed espressione genica dell’infiammazione. Le MAP-chinasi (figura 10) sono inattive quando la cellula è a riposo e si attivano grazie a meccanismi di fosforilazione solitamente su residui di treonina e tirosina. Interagiscono con diverse proteine strutturali e sembra che dirigano la segnalazione all’interno della cellula indirizzando determinate proteine in compartimenti cellulari e che possano anche modulare il segnale. Di solito queste proteine funzionano grazie a una rete di comunicazione costituita da tre passaggi e regolata da successive fosforilazioni.Inizia con
l’attivazione di MAP3K, successivamente MAP2K e infine MAPK. Le maggiori vie di trasduzione delle MAP chinasi coinvolte nei processi infiammatori sono
ERK(extracellular regulating Kinase), p38 MAPK e JNK(c-jun NH2-terminal kinase), ma in particolar modo è stata studiata la via di trasduzione p38 MAPK: sono state scoperte molte piccole molecole aventi funzione inibitoria, soprattutto gli inibitori di p38 per il trattamento dell’asma e della BPCO.
Figura 10. Schema riassuntivo della via di segnalazione delle MAP-chinasi. MAPK sono di solito attivate da stimoli extracellulari come fattori di crescita e stress ossidativo.
Promuovono una cascata a tre livelli che porta all’ativazione di MAP3K, MAP2K e MAPK. Nei processi infiammatori,la maggior parte delle volte, MAPK reclutano altre chinasi come ERK(extracellular regulating kinase), p38 MAPK e JNK (c-Jun NH2-terminal kinase). (Barnes, 2016.)
5.1 MAPK p38
La famiglia di p38 MAPK comprende più isoforme, tra le quali alfa, beta, gamma e sigma: sono proteine chinasi caratterizzate dal possedere un residuo di prolina altamente conservato, e vengono attivate da moltissimi fenomeni di stress extracellulare, inclusi stress ossidativo e stresso osmotico, oppure da citochine infiammatorie. MAPK p38 si attiva grazie alla fosforilazione dei substrati di treonina 180 e tirosina 182 del complesso appartenente al ciclo di attivazione treonina-glicina-tirosina, che permette a p38 di legare ATP al suo sito di legame catalitico e di
trasferire quindi il fosfato dell’ATP alla proteina bersaglio per la fosforilazione.P38 MAPK è inoltre attivato da proteine chinasi a monte del processo infiammatorio come MKK3,MKK4 e MKK6, le quali sono a loro volta regolate dalle MAP3Ks come ad
esempio ASK1(apoptosis signal-regulatory kinase 1), TAK 1(transforming growth factor-beta-activated kinase 1),MLK 3(mixed lineage-kinase 3) e MEKK3(MAP kinase kinase kinase) e sono attivate dalla presenza di stimoli di natura varia(citochine infiammatorie, fattori di crescita e stress ossidativo). P38 MAPK ha come bersaglio molte proteine, tra le quali, ulteriori chinasi, fattori di trascrizione e proteine del citoscheletro. La sua azione induce molteplici processi infiammatori. Poiché attiva più di 60 composti a valle, potrebbe essere un punto d’inibizione chiave.(Trempolec et al.,2013). Le isoforme p38-alfa e p38-beta sono ampiamente diffuse e hanno come target una proteina chinasi a valle della cascata infiammatoria denominata MK2 (MAP-activated protein kinase 2) che media molti di questi effetti. P38-alfa, attivando MK2, induce un incremento dell’attività infiammatoria stabilizzando le trascrizioni da parte dell’mRNA di alcune citochine come TNF-alfa, oppure fosforilando proteine di legame adenosina-uracile come la tristetraprolina,la quale si lega a regioni non tradotte di mRNA per regolarne la stabilità. MK2 fosforila anche le proteineda shock termico (Chaperonine hsp-27), usate come biomarcatori dell’attivazione di p38. P38 potenzia gli effetti pro-infiammatori di NF-kB fosforilando l’istone H3 sui siti
promotori di geni per citochine e chemochine infiammatorie, aumentando così il legame di NF-kB alle loro regioni promotrici. Le isoforme P38-gamma e p38-sigma presentano una distribuzione più limitata, si trovano soprattutto nei macrofagi, e hanno come target i fattori di trascrizione.
5.1.1.Ruolo nell’asma e BPCO
Esistono prove concrete che MAPK si attivi nelle crisi asmatiche così come nella BPCO. Essa è una tra i promotori principali dell’infiammazione cronica e funziona anche in presenza di corticosteroidi (Chung,2011). La P38-alfa si innesca in seguito a stimoli di lipopolisaccaridi o di fumo di sigaretta nelle cellule epiteliali respiratorie e nei macrofagi, controlla il rilascio di proteine pro-infiammatorie come CXCLS (IL-8), IL-6, TNF-a, e il fattore stimolante le colonie granulocitarie-macrofagiche (GM-CSF). L’uso di inibitori selettivi di p38-alfa blocca l’azione dei macrofagi e di conseguenza tutta la cascata infiammatoria derivante dall’azione di queste protein chinasi.
Tuttavia il solo utilizzo di tali inibitori non raggiunge l’effetto terapeutico desiderato, esistono infatti altre isoforme come le p38-gamma che determinano un’azione importante sui macrofagi. I macrofagi alveolari di pazienti affetti da asma grave presentano una cospicua concentrazione di p38-alfa che spiegherebbe un calo di MAPK fosfatasi-1, inibitore endogeno di p38.Si è osservato che, negli animali esposti al fumo di sigaretta e all’ozono,la risposta infiammatoria derivante è stata
efficacemente bloccata da un inibitore p38-alfa denominato SD-282, mentre l’utilizzo di corticosteroidi non ha portato alcun risultato soddisfacente.Ciò evidenzia
ulteriormente il ruolo determinante di p38-alfa nell’infiammazione polmonare neutrofila scaturita da BPCO. A conferma di tale teoria, osservando sempre pazienti portatori di BPCO, si è notata una considerevole presenza di p38-alfa in stato
fosforilatosia a livello polmonare sia nei macrofagi alveolari, nelle cellule epiteliali e nei linfociti CD4 e CD8.
P38-alfa partecipa inoltre alla risposta infiammatoria causata dalle infezioni
provocate dai virus a livello dei tratti superiori delle vie aeree. Il Rinovirus provoca il rilascio di chemochine da parte dei macrofagi alveolari:questo processo è
strettamente correlato con l’attivazione di p38-alfa e, sempre un inibitore di p38-alfa, inibisce il rilascio di citochine infiammatorie da parte delle cellule epiteliali delle vie respiratorie. Haemophilus Influenzae, batterio che di solito risiede nella parte
inferiore delle vie respiratorie e che causa aggravamento della BPCO, induce l’azione di p38-alfa nelle cellule epiteliali delle vie respiratorie e controlla il rilascio di CXCL8.
Tale chinasi, una volta attivata, è responsabile anchedella secrezione della proteina mucina MUC5AC ad opera delle cellule epiteliali e ciò potrebbe significare che
uneventuale inibizione di questa segnalazione porterebbe a un minor rilascio di muco nei pazienti con BPCO(Shen et al. 2008).P38 è altrettanto determinante nelle
infiammazioni derivanti da risposte allergiche. Durante un test allergenico su topi sensibilizzati all’ovalbumina, un oligonucleotide antisenso di p38-alfa si è dimostrato efficace nel bloccare l’infiammazione eosinofila in corso. Allo stesso modo,un altro inibitore selettivo per p38a (SD-282), anch’esso utilizzato in modelli di esposizione cronica ad allergeni, si è rivelato utile nel contrastare la risposta allergica,
l’iperreattività bronchiale e il conseguente rimodellamento tissutale.
P38-alfa, durante la risposta allergica, attiva il fattore di trascrizione GATA3, il quale regola le citochine rilasciate dai linfociti T-helper 2( IL-4, IL-5 e IL-13). P38 fosforila GATA3 all’interno del citoplasma dei linfociti T-helper2, e questo, una volta attivato, migrerà nel nucleo e darà inizio alla trascrizione dei geni codificanti per le citochine dei linfociti T-helper 2. Un inibitore di p38 quindi, bloccando la fosforilazione di GATA3, riesce a inibire la sintesi di tali citochine.P38 inoltre riesce a prolungare la sopravvivenza degli eosinofili intensificando l’azione di IL-5 e il suo inibitore riesce a sopprimerlo tramite meccanismi diapoptosi.P38-alfa sembra inoltre contrastare l’ azione dei corticosteriodi nell’asma grave e BPCO (Barnes, 2013a). L’azione dei corticosteroidi viene bloccata da IL-2 e IL-4 oppure IL-13 nelle cellule mononucletate del sangue periferico (PBMC) e tale effetto può essere invertito grazie all’uso di inibitori di p38. I corticosteroidi aumentano l’espressione di MKP-1 e di conseguenza inibiscono l’attivazione di p38. Nei modelli murini, tramite delezione diMKP-1,i corticosteroidi non esplicano più la loro azione terapeutica. La presenza di p38-alfa nelle PBMC di pazienti che presentano una condizione di asma grave, resistente all’azione dei corticosteroidi, è strettamente legata alla fosforilazione di
GR-alfa.(Mercado et al.,2012). E’ evidente quindi che un inibitore di p38-afadeve essere in grado di facilitare la funzione antiinfiammatoria dei corticosteroidi. A livello delle cellule mononucleate del sangue periferico quindi si utilizzano inibitori dip38-alfa al fine di ripristinare la funzione dei corticosteroidi. Anche l’azione di p38-gamma permette lo sviluppo di resistenza ai corticosteroidi, poichè anch’esso fosforila il recettore GR-alfa ed ostacola la loro azione(Mercado et al, 2015).Col manifestarsi di asma grave dunque, nelle cellule PBMC,troviamo anche un aumento di p38-gamma
che potrebbe diminuire grazie all’uso del Formoterolo, un beta-2-agonista a lunga durata d’azione che riducela reistenza ai corticosteroidi (Mercado et al,2011b).
5.2 Inibitori di p38
La ricerca e lo sviluppo di nuovi inibitori di p38 è stata molto incentivata poiché questi farmaci risultano un mezzo concreto per bloccare le infiammazioni croniche (con presenza di neurofili e di eosinofili), per ridurre la resistenza ai corticosteroidi, e anche per contrastare le alterazioni strutturali del tessuto derivanti dalle
conseguenze dell’asma grave e della BPCO. Gli inibitori selettivi per p38 hanno
mostrato la loro efficacia in cellule in vitro e in un secondo momento sugli animali. La maggior parte di questi agisce sulle isoforme alfa e beta (Norman,2015). Questi farmaci sono stati sperimentati in gran parte su pazienti con artrite reumatoide: il risultato non è stato soddisfacente in quanto per evitare l’insorgenza di effetti collaterali venivano usati in quantità minime. Per di più si è osservato che dopo un loro uso prolungato, perdevano di efficacia a causa dell’insorgenza di meccanismi compensatori che promuovevano la nascita di vie di segnalazione alternative. La maggior parte delle ricerche è stata focalizzata sulla BPCO, dove a causa dello scarso effetto terapeutico dei corticosteroidi, è emerso un concreto bisogno di sperimentare nuove terapie antinfiammatorie, e recentemente otto nuovi farmaci selettivi per p38 sono entrati in fase di trials clinici.(Norman,2015).Un inibitore orale di p38-alfa denominato Dilmapimod (figura 11)
ha ridotto significativamente la fosforilazione di hsp-27 (heat shock protein-27), e il rilascio di TNF-a da parte dei leucociti in circolo in pazienti portatori di BPCO,
dimostrando quindi la sua efficacia. (Singh et al.2010). Losmapimod (figura 12)
Figura 12. Losmapimod
è un inibitore orale che agisce sia su p38-alfa che p38-beta ma dai risultati ottenuti da uno studio di fase II durato più di dodici settimane su 300 pazienti affetti da BPCO, non ha svolto nessuna azione contrastante sui neutrofili ,biomarkers nella BPCO. Tuttavia si è osservato che in circa l’11% di loro, ha ridotto la percentuale di hsp-27 fosforilato e la percentuale di fibrinogeno nel plasma. Nel più grande trial clinico (600 pazienti) condotto per più di 24 settimane, tre dosi di Losmapimod si sono rivelate inefficaci al test di tolleranza allo sforzo (camminata di 6 minuti), sebbene abbiano comunque contrastato il decorso della patologia; in ogni caso, la dose più elevata ha manifestato effetti collaterali soprattutto a livello dermatologico. Studi successivi su pazienti con bassa concentrazione di eosinofili nel sangue (inferiore al 2%), hanno portato a una riduzione delle esacerbazioni della malattia e un lieve miglioramento nei valori della FEV1 (volume espiratorio massimo nel 1° secondo). PH-797804 (figura 13)
Figura 13. PH-797804, struttura chimica
è un inibitore selettivo orale per p38 che, in uno studio di 230 pazienti con BPCO della durata di sei settimane, ha portato a miglioramenti sia dei livelli di FEV1 che di
dispnea. L’alta probabilità d’insorgenza di effetti collaterali per gli inibitori p38-alfa somministrati oralmente ad alte dosi, ha fatto sì che le ricerche per lo sviluppo di nuovi farmaci inibitori si focalizzassero sui preparati per via inalatoria, anche se al momento non ci sono stati molti progressi (Millan et al.,2011).
RV-568 è un potente preparato ad uso inalatorio: esso blocca tutte e quattro le isoforme di p38 e tutte le chinasi appartenenti alla famiglia Src e Hck. Viene indicato come inibitore chinasico altamente specifico che, dopo un trattamento di 2
settimane, aumenta significativamente i valori di FEV1 e allo stesso tempo riduce notevolmente l’espettorato.Per quanto riguarda l’asma invece non è stata introdotta nessuna nuova sperimentazione di inibitori p38, e oggi la maggior parte degli studi sui nuovi farmaci anti-BPCO è stata interrotta.
5.3 Inibitori delle chinasi Jun NH2-terminali (JNK)
La funzione principale di JNK è quella di innescare il fattore di trascrizione pro-infiammatorio AP-1 (activator protein-1) il quale regola molti geni infiammatori sia nell’asma che nella BPCO. Alcuni topi, sensibilizzati ed esposti ad un determinato allergene, hanno dimostrato la sua azione in quanto successivamente all’inalazione si è verificato un aumento di JNK nelle cellule epiteliali delle vie respiratorie e nei polmoni. Un inibitore JNK, SP600125 (figura 14),
Figura 14. SP600125, struttura chimica
ha arrestato la cascata infiammatoria in risposta all’allergene ed ha ridotto la secrezione di muco e l’iperreattività delle vie aeree, rivelando quindi il suo ruolo chiave nell’infiammazione allergica. TNF-alfa prolunga la sopravvivenza degli eosinofili nell’uomo grazie all’attivazione di JNK, che è quindi responsabile anche della diffusione dell’infiammazione di tipo eosinofilo(Kankaanranta et al.,2014). JNK potrebbe anche partecipare ai processi di alterazione tissutale dovuti all’asma e BPCO poiché SP600125 riduce anche la proliferazione nella muscolatura liscia delle vie aeree dopo esposizione cronica all’allergene. Nei topi JNK-deficienti, in seguito ad esposizione cronica agli acari da polvere di casa), la fibrosi si riduce drasticamente. Si è detto che JNK regoli la proliferazione della muscolatura liscia delle vie aeree nonché l’aumento della sintesi di collagene che avviene per mezzo del fattore di crescita TGF-beta mediato a sua volta dall’attivazione di AP-1. JNK agisce anche a livello delle proteine CD40 che portano all’attivazione dei linfociti B. SP600125 inibisce pure la formazione di nuove trascrizioni per le IgE nei linfociti B.JNK promuove poi
meccanismi di resistenza ai corticosteroidi in pazienti affetti da asma grave:AP-1 competendo con GR-alfa, provoca l’attivazione di JNK nelle PBMC di pazienti con asma grave resistente ai corticosteroidi. La resistenza ai corticosteroidi per mezzo di IL-2 e IL-4 nelle cellule PBMC, è regolata dalla presenza di JNK che, grazie alla
fosforilazione del residuo di Ser226 su GR-alfa, blocca la sua attività all’interno del nucleo. JNK è responsabile anche della resistenza ai corticosteroidi indotta
dall’infezione di rinovirus nelle cellule epiteliali dell’apparato respiratorio. Questo effetto indesiderato è stato ridotto con l’aiuto di un inibitore di JNK e può essere arrestato grazie a una combinazione tra questo e un inibitore di IKK-beta(Papi et al.,2013). Si pensa che l’azione di JNK possa essere importante anche nella BPCO, non a caso la citotossicità indotta da fumo di sigaretta nelle cellule epiteliali è mediata dalla sua attivazione. In definitiva gli effetti di JNK e di AP-1 nell’asma e nella BPCO, la
loro attività stimolatoria sul rilascio di citochine e di resistenza ai corticosteroidi li rendono un bersaglio terapeutico importante nella cura di queste patologie: i benefici tratti dall’inibitore selettivo per JNK SP600125 danno conferma di tutto ciò.
SP600125 è un inibitore che compete con l’ATP su entrambi i sottotipi di JNK(JNK-1 e JNK-2). Al momento non è ancora stato intrapreso nessun tipo di test su questo inibitore molto probabilmente per motivi di tossicità. Tuttavia si è visto che anche la Curcumina (figura 15), polifenolo vegetale estratto dalla Curcuma, riesce ad inibire JNK e per questo motivo è tutt’oggi in fase di sperimentazione contro patologie che portano a infiammazione cronica come ad esempio la psoriasi. Va comunque
precisato che la Curcumina, non essendo selettiva agisce anche su altri distretti come ad esempio NF-kappaB e il fattore nucleare (erythroid derived 2) like-2.
Figura 15. Curcumina, struttura chimica.
5.4Chinasi di regolazione extracellulare (ERK) / inibitori MAP
chinasi
Molti studi hanno dimostrato il coinvolgimento di chinasi ERK1 e ERK2 nell’asma e nella BPCO. I mastociti infatti potrebbero rilasciare IL-1 e IL-6 tramite segnalazione di queste chinasi. Si è osservato che possono essere bloccate dalla genisteina, un
flavonoide con molteplici effetti terapeutici(Kim et al.,2014).Le ERK possono anche mediare la secrezione di muco indotta dal recettore del fattore di crescita epiteliale e possono essere inibite da un composto selettivo denominato PD-98059 (figura 16)
Figura 16. PD-98059, struttura chimica.
(Li et al.,2012). Sebbene p38 MAPK esplichi un’azione regolatrice dominante sul rilascio di citochine sui monociti, nei polmoni e nei macrofagi alveolari tale posizione viene coperta dalle ERK e pertanto inibitori selettivi di ERK risultano essere molto più efficaci degli inibitori di p38 nel bloccare la secrezione di citochine. La via di trasduzione delle ERK si innesca grazie ad alcuni fattori di crescita e si pensa che sia responsabile anche della proliferazione cellulare della muscolatura liscia delle vie aeree nonché di altre alterazioni strutturali.
Dall’effetto pro-infiammatorio di tale chinasi si evince quindi che un suo potenziale inibitore potrebbe avere degli effetti terapeutici significativi soprattutto sulla
riduzione di emissione di muco. Il composto PD-98059 attivo su MEK1/ERK è molto efficace in questa via poichè è un inibitore allosterico non competitivo ad alta
specificità. Tuttavia tale farmaco non può essere ancora sperimentato in vivo a causa della sua bassa solubilità. Ci sono poi altri MEK1 inibitori come ad esempio il
trametinib o il solumetinib che sono stati testati clinicamente contro il cancro ed hanno mostrato efficacia contro tumori solidi, presentando anche un buon profilo di tollerabilità, ma al momento non è stato intrapreso nessuno studio per verificare i loro effetti sull’asma o sulla BPCO. Altrettanto interessanti sono alcuni antibiotici macrolidi, la cui azione è quella di inibire la secrezione di CXCL8, indotta da fumo di sigaretta nelle cellule epiteliali, funzione mediatea tramite fosforilazione delle ERK chinasi. Tuttavia i macrolidi hanno anche molti altri effetti come l’inibizione di NF-kB.
5.5 Inibizione della chinasi ASK-1
Queste particolari proteine che regolano il segnale di apoptosi,agiscono a monte della cascata infiammatoria(MAP3K) , attivano p38 MAPK e JNK ed entrano in azione in
situazioni di stress ossidativo del reticolo endoplasmatico.Normalmente la
tioredossina è legata a ASK-1 e in questo stato non ne consente l’azione, ma quando a causa di stress ossidativo essa viene ridotta, allora ASK-1 si attiva. ASK-1 media la citotossicità causata dal fumo di sigaretta nelle cellule epiteliali respiratorie e viene inibita dalla Tioredossina quando è legata ad essa, permettendo in questo modo la sua azione antiossidante(Lee et al. 2008). ASK-1 è quindi un potenziale bersaglio terapeutico contro la BPCO, e per tale motivo sono state ricercate e prodotte
numerose molecole ad azione inibitoria. Al momento sono in fase di progresso molte sperimentazioni sugli inibitori ASK-1: un esempio è il composto GS-4997 (figura 17)
Figura 17. GS-4997, struttura chimica.
sperimentato contro la nefropatia diabetica.Tuttavia nessun ASK-1 inibitore è
attualmente in studio per l’asma o per la BPCO. Sebbene la tioredossina sia l’inibitore endogeno di ASK-1, la sua somministrazione a livello intracellulare risulta molto complicata
.
5.6 Inibizione delle chinasi TAK-1
Le chinasi TAK-1, attivate dal TGF-beta, sono un altro particolare gruppo di proteine MAP chinasi (MAP3K7) altamente regolate, che stanno all’inizio delle vie di
trasduzione del segnale. Esse mediano la trasduzione per le ERK, per le p38-alfa MAPK e per NF-kB. Hanno un ruolo essenziale nell’immunità innata in risposta a TGF-beta, TNF-alfa,IL-1b e TLR. Esiste una piccola molecola 5Z-7-oxozeaenol (figura 18)
Figura 18. 5Z-7-oxozeaenol, struttura chimica
ad effetto inibitore su TAK-1 che blocca la proliferazione cellulare della muscolatura liscia delle vie aeree(Pera et al.,2011). L’arresto di TAK-1 impedisce anche il rilascio di CXCL8 da parte delle cellule della muscolatura liscia in presenza di fumo.(Pera et al.,2012). TAK1 è poi attiva sulla segnalazione di NF-kB e p38 MAPK che intervengono in presenza di H.Influenzae a livello delle cellule respiratorie. TAK-1, interagendo con Nf-kB, sembra che possa perfino attivare il sistema immunitarione i linfociti T. Tutte queste molteplici funzioni rendono TAK-1 un target terapeutico molto ambito poiché, bloccando a monte questa proteina, si arrestano tutte le cascate di segnali derivanti dall’innesco di NF-kB e MAPK. Ci sono oggi molte molecole anti-TAK1 in fase di sviluppo(la maggior parte delle quali riguardano principalmente terapie contro il cancro), ma sono stati ottenuti pochi dati relativialla selettività per le chinasi e di conseguenza non sono ancora entrati in sperimentazione clinica.
5.7 Inibizione di MAPKAPK2
MAPKAPK2 (MK2) viene attivata direttamente per mezzo di p38-alfa MAPK:
l’inibizione di questa chinasi in un punto più a valle del processo potrebbe evitare la comparsa di fenomeni di tossicità già riscontrati con gli inibitori di
p38-alfa.(Gaestel,2013). MK2 consente di prolungare l’attività di NF-kB nei linfociti T amplificando quindi la risposta infiammatoria allergica. Anche MK2 regola l’attività del CXCL8 in risposta all’esposizione da fumo di sigaretta nelle cellule della
muscolatura liscia delle vie respiratorie(Moretto et al.,2012). In ogni caso gli inibitori di MK2, che competono con l’ATP necessaria all’attivazione di tale chinasi, presentano scarsa selettività e bassa solubilità. D’altro canto sembrano essere molto più efficaci gli inibitori non competitivi, ragion per cui è oggi in fase di sviluppo una vasta
quantità di molecole appartenenti a questa categoria, anche se al momento nessuna di esse è stata approvata per la sperimentazione clinica.
Capitolo 6
Fosfatidilinositolo-3-chinasi (PI3K)
PI3Ks sono una classe di chinasi lipidiche che danno origine a messaggeri secondari di natura lipidica che mediano numerosi processi cellulari, incluse le risposte
immunitarie innate e acquisite, motilità,sopravvivenza cellulare e scambi intracellulari(Vanhaesebroeck et al., 2012). Queste proteine catalizzano la
fosforilazione dell’anello inositolico presente sui fosfatidilinositoli della membrana cellulare al fine di sintetizzare messaggeri secondari. Sono classificate in tre diverse famiglie contraddistinte ognuna dal tipo di lipide sintetizzato. La prima classe converte PIP2 in fosfatidilinositolo-(3,4,5)-trifosfato (PIP3), composto costituito da eterodimeri che presentano una subunità catalitica p110 con quattro
isoforme(alfa,beta,gamma e sigma) insieme a una subunità adattatrice che può essere o p85 (classe IA) la quale si innesca grazie al recettore tirosin-chinasico (RTKs) e attiva tutte le altre subunità, oppure una subunità p110/p84 (classe IB) che viene attivata soprattutto da recettori accoppiati a proteine G ed innesca la subunità PI3Kgamma (Vanhaesebroeck, 2016). PIP3 si accumula nella membrana cellulare e recluta il dominio PH contenente proteine come la fosfatidilinositolo chinasi-1(PDK1) e la proteina Akt meglio conosciuta come proteina chinasi B. PDK1, una volta attivata dal PIP3, va a fosforilare Akt sul residuo di treosina 308 e insieme alla fosforilazione sul residuo di serina 473 ad opera del complesso mTORC2, consente l’attivazione della proteina Akt.A questo punto la chinasi B fosforilata innesca a sua volta molteplici segnalazioni cellulari. La trasduzione a valle adopera di P-Akt è molto complessa:a questo livello diventa un bersaglio molto importante il complesso mTORC1,che promuove processi di invecchiamento cellulare(Johnson et al 2013).alfa e beta si trovano in molte tipologie di cellule mentre PI3K-gamma e PI3K-sigma le troviamo soprattutto nei leucociti. Riguardo alle classi II e III sappiamo ancora poco. Le chinasi appartenenti alle classe II includono le isoforme PI3K-C2-alfa,PI3K-C2-beta e PI3K-C2-gamma. Le isoforme alfa e gamma, regolando la produzione di fosfatidil-inositolo-3-fosfato, sembrano esser coinvolte in processi di
scambi vescicolari, ma, non essendo stato ancora scoperto nessun tipo di inibitore selettivo per queste proteine, risulta molto difficile studiarne le funzioni. La classe III include soltanto un composto, Vps34 che è coinvolto negli scambi vescicolari, nella via di segnalazione TLR (toll-like receptor) e nell’autofagia tramite sintesi di fosfatidil-inositolo-3-fosfato.La via di segnalazione di PI3K è fortemente regolata dalle fosfatasi, in particolar modo dall’enzima PTEN(phosphatase and tensing homolog deleted from chromosome 10), il più importante inibitore endogeno per questa classe di chinasi. Esso agisce da soppressore tumorale soprattutto nel cancro al polmone, sebbene oggi sia stata evidenziata anche la sua azione fondamentale nel regolare le infiammazioni croniche e la crescita cellulare. Esiste poi un’altra
importante proteina inibitoria denominata SHIP (Src homology 2 domain-containing inositol 5’-phosphatase), che blocca l’azione di PI3K e la troviamo soprattutto a livello delle cellule staminali e dei macrofagi (Backers et al., 2003).
6.1 Ruolo nell’asma e BPCO
Diversi studi hanno dimostrato come PI3K (figura 19) si comporti da agente pro-infiammatorio, provocando resistenza ai corticosteroidi e promuovendo fenomeni di invecchiamento cellulare(Marwick et al.,2010a). Questi meccanismi si attuano grazie all’attività della I classe delle PI3Ks mentre l’azione della classe II è al momento ignota.
Figura 19. Schema riassuntivo della via di segnalazione delle fosfoinositide-3-chinasi(PI3K). L’attivazione delle PI3K porta all’azione della Akt (protein chinasi B), e in successione del TSC1/2( tuberous sclerosis complex), del mTORC1 (mammalian target of rapamycin complex-1) il quale a sua volta attiva S6K (S6-kinase) che promuove l’azione di SIRT1
(sirtuin-1), dell’istone-deacetilasi (HDAC2) e porta infine a processi di autofagia.Si osservano poi altre vie di segnalazione promosse da Akt in quanto essa attiva anche IKKbeta; mTORC1 invece attiva pure JNK. Fenomeni di stress ossidativo promuovono l’attività d PI3K attraverso inibizione di PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted from chromosome 10) e SHIP1 (Src homology 2 domain-containig inositol 5’-phosphatase-1). Nello schema inoltre si possono visualizzare, evidenziati in verde, le classi di inibitori che possono bloccare la via di segnalazione di PI3K (Barnes,2016).
Un inibitore non selettivo LY294002 (figura 20),
Figura 20. LY294002, struttura chimica
somministrato tramite inalazione, inibisce la reazione infiammatoria di tipo allergico scaturitasi in topi sensibilizzati ad un determinato allergene, provocando
diminuzione dei livelli plasmatici di eosinofili, citochine rilasciate dai linfociti T-helper 2 ed iperreattività delle vie respiratorie (AHR). Risultati simili sono stati ottenuti grazie all’utilizzo di un inibitore per la subunita regolatoria p85, suggerendo quindi la classe IA delle MI3Ks come promotrice del passaggio delle citochine da T-helper 1 a T-T-helper 2. In particolare le proteine PI3K-sigma, una volta legate ai
recettori delle IgE, consentono la degranulazione dei mastociti, processo poi arrestato dall’inattivazione delle stesse ad opera di inibitori selettivi come IC87114. Nei modelli animali di asma, una somministrazione intratracheale di IC87114 (figura 21)
Figura 21. IC87114, struttura chimica
blocca la risposta allergica, le citochine dei linfociti T-helper 2 e l’ipereattività bronchiale (AHR). Nei topi sensibilizzati all’aspergillus fumigatus, l’inattivazione di PI3K-sigma ferma la risposta allergica, e questo processo è reso possibile attraverso la riduzione di stress del reticolo endoplasmatico, che nell’asma risulta molto più accentuato ed è provocato dall’azione del fattore Nf-kB(Lee et al.,2016). PI3K potrebbe essere anche un agente scatenante l’aumento di contrattilità della
muscolatura liscia respiratoria nonché la causa di proliferazione cellulare grazie anche all’intervento di fattori di crescita come TGF-b.L’attivazione di PI3K è molto importante anche nella BPCO. L’azione di questa chinasi ,che consente la
fosforilazione di Akt o chinasi B, è molto accentuata nei bronchioli e nei macrofagi di pazienti affetti da BPCO, in particolare troviamo un’elevata concentrazione
dell’isoforma PI3K-sigma.Situazioni di stress ossidativo causano in vitro un aumento di p-Akt soprattutto a livello dei macrofagi alveolari e dei monociti del sangue
periferico, che sono dotati solo di inibitori per l’isoforma sigma e non per l’isoforma gamma(Marwick et al.,2010).I topi con delezione dell’isoforma gamma mostrano sia una ridotta attività neutrofila sia una scarsa presenza di linfociti T e di macrofagi. Non a caso PI3K-gamma è la via di segnalazione principale che media il reclutamento di neutrofili ai polmoni dopo la comparsa delle chemochine. Le PI3K-gamma svolgono una funzione importante nell’infiammazione cronica e nelle patologie
autoimmuni.(Costa et al.,2011). Anche le PI3K-sigma partecipano alla risposta infiammatoria e potrebbero cooperare con l’isoforma gamma all’attivazione dei neutrofili. Entrambi gli inibitori per le PI3K-gamma e PI3K-sigma migliorano l’efficienza della migrazione dei neutrofili nella BPCO. Un inibitore di PI3K selettivo per le isoforme gamma e sigma, somministrato per aerosol e denominato TG100-115 (figura 22)
Figura 22. TG100-115, struttura chimica
si è dimostrato efficace nel contrastare sia l’infiammazione da esposizione al fumo di sigaretta nei top,i sia l’infiammazione allergica nonostante la resistenza ai
corticosteroidi. La PI3K-sigma agisce anche come promotore per la resistenza ai corticosteroidi in caso di stress ossidativo. In questa situazione gioca un ruolo fondamentale l’enzima HDAC2 (istone deacetilasi-2) che media il processo. Gli
inibitori PI3K-sigma potrebbero intervenire positivamente aumentando l’espressione di HDAC2. L’utilizzo del farmaco PI3K-sigma-inibitore IC87114 (figura 23)
Figura 23. IC87114, struttura chimica
contrasta la resistenza ai corticosteroidi nei topi esposti al fumo di sigaretta(To et al.,2010) . I topi che presentano delezione di PI3K-sigma non manifestano resistenza ai corticosteroidi dopo esposizione al fumo mentre quelli con inattivazione di PI3K-gamma mostrano resistenza ai corticosteroidi. L’isoforma alfa promuove la
proliferazione e la sopravvivenza cellulare anche nei tumori precoci del polmone e quindi potrebbe essere determinante nello sviluppo delle neoplasie nei pazienti affetti da BPCO. L’attivazione di queste proteine consente l’innesco della protein chinasi mTOR, coordinata dalla fosforilazione della chinasi S6K, la cui presenza aumenta notevolmente nella BPCO(Mitani et al.,2006). Quest’ultima non solo riduce l’attività di HDAC2, ma determina anche l’attivazione della chinasi JNK e della proteina AP-1 anch’essa promotrice della resistenza ai corticosteroidi. L’attivazione di PI3K incentiva l’invecchiamento cellulare sempre attraverso il reclutamento della chinasi mTOR, responsabile principale della senescenza cellulare(Johnson et
al.,2013). Il tutto si traduce nella riduzione di sirtuina-1,molecola con effetti antiaging che viene a mancare nei pazienti affetti da BPCO. La stessa via di segnalazione PI3K-mTOR potrebbe incentivare la nascita di patologie annesse alla BPCO come infarto cardiaco, diabete di tipo II, osteoporosi, insufficienza renale e demenza. Ad esempio, le cellule EPC, note per ricostituire i danni al tessuto endoteliale, al fine di mantenere una normale funzione circolatoria, mostrano un invecchiamento precoce collegato alla diminuzione di quantita di Sirtuina-1 relativo all’attivazione delle PI3K (Pashalaki et al.,2013).
6.2 Inibizione di PI3K-Akt-mTOR
La via di segnalazione Pi3K-Akt-mTOR è sicuramente uno dei principali sistemi di comunicazione cellulare che provoca risposta infiammatoria, non c’è quindi da stupirsi se rappresenta uno dei target terapeutici più ambiti da raggiungere attraverso la ricerca e lo sviluppo di nuovi farmaci. Fin oggi questo meccanismo cellulare ha interessato soprattutto settori di ricerca come le terapie antitumorali: PI3K è un importante promotore della proliferazione cellulare e l’intero percorso è uno dei sistemi di comunicazione più soggetti a perdita di controllo durante la crescita dei tumori solidi.
Questa via di comunicazione è stata molto studiata perché è anche uno dei principali riferimenti per lo sviluppo di malattie croniche degenerative e per i processi di invecchiamento precoce(Johnson et al.,2013). L’interesse per questa via di segnalazione è aumentato ulteriormente da quando si è osservata la sua attività anche in caso di asma e BPCO. Di conseguenza sono stati progettati molti farmaci inibitori di questa via.
6.2.1 Inibitori di PI3K
Gli inibitori non selettivi della fosfatidil-inositolo-3-chinasi della classe I come la Wortmannin (figura 24)
Figura 24. Wortmannin, struttura chimica
e LY294002 si sono rivelati efficaci in vitro e in vivo sugli animali, ma non sono entrati in fase di sperimentazione clinica a causa della loro scarsa biodisponibilità e della loro alta tossicità. Molti di essi sono stati sviluppati per contrastare sia il progredire dei tumori solidi che il progredire dei tumori del sangue, ma al momento
nessuno di questi è stato ancora approvato per la sperimentazione clinica sempre per via della loro tossicità(Dienstmann et al.,2014). Si è provato quindi a sviluppare farmaci più selettivi per le varie isoforme, ma anch’essi sono risultati poco efficaci in quanto, inibendo una isoforma, si attivano automaticamente le altre due che,
attraverso processi a feedback, sviluppano meccanismi di compensazione per
contrastare l’isoforma soppressa. Ad esempio, somministrando un inibitore selettivo per PI3Kb, si induce un aumento di attività di PI3K-alfa. Gli inibitori di PI3K-alfa sono stati sintetizzati al fine di ridurre le masse tumorali solide, ma possono provocare iperglicemia poichè vanno a interferire con i meccanismi di segnalazione per il rilascio di insulina. Sono stati presi in considerazione anche gli inibitori PIK3-gamma ritenuti potenziali agenti antiinfiammatori, ma al momento nessun composto è stato approvato per la sperimentazione clinica. Sono stati creati altri
PI3K-gamma-bloccanti per combattere le neoplasie delle cellule B,in particolare l’inibitore idelalisib(CAL-101)(figura 25)
Figura 25. Idealisib, struttura chimica
è entrato in fase di studi clinici per alcune forme maligne delle cellule B
(Vanhaesebroeck and Khaja, 2014). Tuttavia l’uso di idelalisib nel trattamento della leucemia cronica può provocare reazioni avverse come leucopenia, colite e rash cutaneo(Brown, 2015). E’ possibile poi alternare l’utilizzo di PI3K- inibitori per le rispettive isoforme sigma e gamma; non a caso ci sono molti farmaci inibitori per entrambi i sottotipi in via di sviluppo. Ne è un esempio IPI-145(duvelisib) (figura 26),
Figura 26. Duvelisib, struttura chimica
che risulta molto efficace in disturbi autoimmuni e infiammatori negli animali e ha raggiunto le prime fasi di sperimentazione clinica. Per risolvere il problema della comparsa di reazioni avverse, sono stati studiati inibitori da somministrare per via inalatoria. Un inibitore combinato, efficace su entrambe le isoforme,TG 100-115 ha mostrato effetti positivi su topi con asma allergica e infiammazione indotta da fumo di sigaretta ma non è ancora in fase di sperimentazione clinica. Il motivo per il quale questi inibitori sono considerati efficaci sta nel fatto che gli inibitori per il sottotipo gamma sono agenti antiinfiammatori che bloccano la risposta immunitaria nei polmoni mentre gli inibitori per il sottotipo sigma ripristinano l’efficacia dei corticosteroidi nell’asma grave e nella BPCO. I preparati per via inalatoria
comprendono anche gli inibitori PI3K-sigma: il composto GSK2269557 (Figura 27)
Figura 27. GSK2269557, struttura chimica
è ancora in via di sviluppo per il trattamento dell’asma e della BPCO. Altro metodo per inibire le chinasi PIK3-sigma è il ricorso a terapie già esistenti: la teofillina è nota per le sue proprietà antiinfiammatorie in quanto favorisce l’attività di HDAC2 e ristabilizza l’attività dei corticosteroidi nei macrofagi di pazienti affetti da BPCO. Essa inoltre
,
esplica la sua funzione inibitoria verso PI3K-sigma a dosi moltopiù basse rispetto a quelle utilizzate per ottenere l’effetto broncodilatatore (To et al.,2010). Unnuovo farmaco a base di teofillina a basse concentrazioni insieme a un corticosteroide somministrato per inalazione, è in fase di studio clinico per il trattamento della
BPCO(Barnes,2013c). Tra i farmaci che ripristinano l’attività dei corticosteroidi attraverso l’inibizione di PI3K-sigma ci sono anche la nortriptilina (antidepressivo triciclico) e la solitromicina( antibiotico).
6.2.2 Inibitori Akt – mTOR
La proteina Akt è un bersaglio a valle dell’attivazione di PI3K, non a caso sono stati progettati molti inibitori orali per la cura contro il cancro. Uno tra tutti è sicuramente la Perifosina, molecola inibitrice della p-Akt, al momento in fase di sperimentazione, non agisce solo a questo livello ma interessa altre vie di trasduzione. Di conseguenza la ricerca si sta spostando verso la produzione di inibitori molto più selettivi
(Alexander,2011). La Rapamicina (Sirolimus), macrolide che ha come funzione principale l’inibizione del complesso mTORC1,viene oggi utilizzata come immunosoppressore nei trapianti e, sebbene anch’essa presenti molti effetti collaterali che ne limitano l’uso cronico, è tutt’oggi oggetto di studio. L’obiettivo è quello di trovare nuovi farmaci analoghi meno tossici, con un profilo farmacocinetico migliore e che, bloccando i meccanismi di senescenza e autofagia cellulare
esattamente come la Rapamicina, possano prolungare la vita dei mammiferi. Gli studi riguardo una sua possibile attività antitumorale non hanno portato a buoni
risultati(Chiarini et al.2015): l’inibizione di mTOR riduce l’attivazione della proteina chinasi S6 ottenendo un circuito a feedback di tipo inibitorio che ha come risultato finale l’attivazione della via di segnalazione PI3K-Akt nelle cellule tumorali. Tuttavia il suo effetto inibitorio sull’autofagia cellulare potrebbe condurre all’innesco di processi anticancerogeni. Sicuramente più efficaci potrebbero essere gli inibitori ad azione selettiva per mTORC1 e mTORC2 come il composto AZD2014 (figura 28):
Figura 28. AZD2014, struttura chimica
questa molecola blocca il circuito a feedback dove mTORC2 attiva Akt(Dienstmann et al.,2014). Dalle ricerche si evince che la doppia inibizione di PI3K e di mTOR è
sicuramente più efficace poiché in questo modo si disabilita il circuito a feedback PI3K-Akt. Le due chinasi hanno omologie strutturali significative a tal punto da incentivare lo sviluppo di nuovi farmaci a doppia inibizione.(Chiarini et al.,2015). Al momento nessuno di questi è stato ancora testato contro le patologie delle vie respiratorie nonostante sia certo che la Rapamicina, disattivando mTOR e bloccando meccanismi di resistenza ai corticosteroidi, possa portare effetti curativi anche nella BPCO (Mitani et al.,2015). Inoltre la Rapamicina sopprime le infiammazioni allergiche nei topi e inibisce i processi di differenziazione eosinofila.
6.2.3 Attivatori degli inibitori endogeni
La protein chinasi attivata dall’adenosina monofosfato (AMPK) è un importante regolatore della via di segnalazione PI3K. Essa infatti, fosforilando il complesso di soppressione tumorale TSC1/2, inibisce mTOR e svolge importanti funzioni nella regolazione del metabolismo cellulare. Si pensa inoltre che possa promuovere effetti antiaging aumentando i livelli di Sirtuina-1 e innescando processi antinfiammatori. Si è osservato quindi un grande interesse per la ricerca e lo sviluppo di nuovi farmaci che funzionassero da attivatori per le AMPK, in particolare per quelli che avessero più effetti contro l’asma e la BPCO(Scarpulla,2011). La Metformina, farmaco utilizzato per il trattamento del diabete di tipo 2 appartenente alla classe delle biguanidi, funziona in parte da attivatore AMPK. Essa infatti, promuovendo particolari mutazioni a livello
dei nucleotidi, prolunga la vita nei topi e presenta anch’essa proprietà
antinfiammatorie. La Metformina e in particolare lo specifico attivatore di AMPK (5’-amminoimidazolo-4-carbossiammide-1-beta-4-ribofuranosio) riducono le
infiammazioni allergiche nei topi. Questo composto inoltre inibisce il rilascio, indotto da fumo di sigaretta, di CXCL8 da parte delle cellule epiteliali delle vie respiratorie A549. In particolare, in alcuni topi AMPK-deficienti, si è osservata la comparsa di enfisema dopo esposizione al fumo di sigaretta, a conferma del fatto che l’attivazione di questa via ha un potenziale effetto terapeutico nella cura dell’asma e della
BPCO(Lee e tal.,2015). Ulteriori attivatori di queste chinasi sono sicuramente i flavonoidi come la quercetina e il resveratrolo. Quest’ultimo sembrerebbe
promuovere effetti antiinfiammatori nelle cellule epiteliali affette da BPCO attraverso molteplici meccanismi non ancora definiti. Attualmente sono in fase di sviluppo e di sperimentazione diversi tipi di attivatori di AMPK con selettività maggiore: il
composto A-769662 (figura 29) ad esempio,
Figura 29. A-769662, struttura chimica è entrato in fase di test clinici per il diabete.
Un altro tipo di approccio terapeutico consiste nell’attivazione delle fosfatasi PTEN e SHIP che, una volta stimolate, inibiscono la propagazione del segnale alle PI3K. Non è stato facile trovare molecole selettive che attivassero le fosfatasi PTEN, e questo sottolinea la comprensione dei suoi complessi meccanismi di regolazione e di
interazione. La fosfatasi SHIP presenta invece processi di attivazione più semplici che hanno portato alla sintesi di una piccola molecola denominata AQX-1125 (figura 30).
Figura 30. AQX-1125, struttura chimica
Essa, attivando le SHIP, riduce i livelli di p-Akt, inibisce l’attivazione dei mastociti, la chemiotassi leucocitaria in vitro e infine riduce in vivo sia le infiammazioni allergiche che quelle indotte dal fumo. Un recente trial ha evidenziato come questo composto, in risposta a un’esposizione allergica, sia in grado di ridurre al minimo i sintomi
dell’asma lieve.Tuttavia tali ricerche hanno riportato anche una scarsa riduzione dei livelli di markers infiammatori. AQX-1125 presenta comunque un ottimo profilo farmacologico e potrebbe quindi essere utilizzato nel trattamento dell’asma e BPCO. Altro soppressore a valle della segnalazione di PI3K è la
glicogeno-sintasi-3beta(GSK3b). E’ una proteina di tipo costitutiva ovvero sempre presente e attiva all’interno delle cellule. Essa viene inibita in seguito a stress ossidativo attraverso processi di fosforilazione da parte di Akt e ERK1/2. Livelli di GSK3b-inattivata aumentano considerevolmente all’interno di PBMC, macrofagi e celulle epiteliali di pazienti portatori di BPCO, specialmente in quelli che manifestano la patologia in uno stadio avanzato. Tale deficit è strettamente collegato con la resistenza ai
corticosteroidi in conseguenza a una diminuzione della concentrazione di HDAC2 in queste cellule.Questo fa intuire come degli attivatoridi GSK3b potrebbero essere fondamentali per debellare la resistenza ai corticosteroidi, anche se al momento risulta molto difficile identificare tali composti. Inoltre si è osservato come queste sintasi, partecipando alla regolazione di piu trasduzioni, inclusa quella del fattore nucleare kb, possano amplificare i processi di infiammazione una volta attivate.
