5. Discussione
L’infezione da FIV del gatto domestico è considerata uno dei migliori modelli non primati per studiare l’AIDS ( Bendinelli et al., 1995, Spanger, 2006). Un’ulteriore evidenza è che attraverso le DC HIV prende contatto con i linfociti T( Steinmann et al. 2003), infatti l’infezione in trans delle cellule T con le DC sembra essere più efficiente dell’infezione con virioni liberi (Arrighi et al. 2004). Nel nostro laboratorio è stato descritto un protocollo per generare DC da sangue periferico (Freer et al., 2005). Dato che, non si sa ancora molto sull’ interazione tra le DC e FIV, abbiamo cercato di infettare culture di DC feline con FIV-Pet appartenente al clade A e FIV- M2 appartenente al clade B, con il protocollo standard utilizzato nel nostro laboratorio per infettare altri tipi di cellule. Con questo metodo abbiamo ottenuto risultati inconsistenti, quindi abbiamo infettato le iDC con la spinoculazione, la cui maggiore efficienza di infezione è stata dimostrata anche in cellule T infettate con HIV (O’ Doherty et al., 2000). Le iDC infettate con FIV mettevano in evidenza un’inequivocabile replicazione virale. Questo includeva la comparsa di p25 nel supernatante già dopo 18h, in accordo con quanto visto con HIV (O’ Doherty et al.
2000) . Non abbiamo cercato di chiarire come la spinoculazione facilitasse l’infezione delle DC, ma sembra plausibile che anche per FIV, come suggerito per HIV (O’
Doherty et al., 2000), la quantità di virus assorbito sulle cellule aumenti. La spinoculazione non solo permette l’infezione delle iDC, ma accelera la comparsa di FIV nel supernatante. Con la spinoculazione e la p25 dipendeva dalla dose di virus impiegata e non dalla quantità di cellule presenti nella coltura. La produzione di virus da parte delle DC si arrestava molto presto, infatti la concentrazione di p25 rimaneva
costante già dopo 24 ore dall’infezione. D’ altra parte dobbiamo tenere presente che FIV cresce bene in cellule in attiva replicazione, mentre le DC essendo cellule molto differenziatele riducono la loro attività replicativa anche quando si trovano in condizioni ottimali. Un problema frequente con le DC è la contaminazione da parte delle cellule T (Frigdor et al., 2004) le nostre DC contenevano tra il 5 e il 15% di cellule T ( i dati non sono stati presentati), noi non abbiamo mai riscontrato un parallelismo, tra il numero di cellule T e il quantitativo di p25 nel supernatante delle colture. Inoltre, il fatto che le iDC marcate per la p25 intracellulare, si comportavano nello stesso modo del controllo MBM, (cellule riconosciute suscettibili al virus), confermava che le iDC erano infette e rilasciavano il virus nel supernatante. La determinazione del DNA virale nelle colture non è stata determinata a causa della contaminazione delle cellule T . Le DC infettate con FIV-Pet producevano più p25 di quelle infettate con FIV-M2 ad ogni tempo analizzato. Sino ad ora è stato visto che il CD134 è un recettore primario di FIV, fondamentale per i ceppi primari come FIV-M2, ma superfluo per virus adattati in coltura come FIV-Pet (de Perseval et al., 2004b; Shimojima et al.,2004). Noi abbiamo voluto vedere se le iDC esprimevano questa molecola usando un anti-CD134 felino (B. Willet, comunicazione personale).
Le DC feline sono risultate negative per il CD134 ma positive per il CXCR4, che è riconosciuto come la molecola utilizzata da FIV-Pet per entrare nelle cellule (Shimojima et al., 2004). Questa osservazione può spiegare la maggior permissività delle iDC nei confronti di FIV-Pet rispetto a FIV-M2. Siccome nel FIV è stata dimostrata la capacità di fissare il DC-SIGN umano (de Perseval et al., 2004a), non si può escludere che l’omologo felino del DC-SIGN, se esiste, contribuisca a mediare l’adesione del virus alla cellula. A nostra conoscenza questa è stata la prima
dimostrazione che le DC possano essere infettate con FIV e che l’infezione delle DC, ma anche dei PBMC attivati con ConA e delle MBM , è fortemente favorita dalla spinoculazione. Solo il 6, 10% di iDC diventava positivo al virus, quantità molto inferiore rispetto alle MBM infette e ancora minore delle cellule T spinoculate con HIV-1 (O’ Doherty et al.,2000). Ciò ha suggerito che le DC feline non venivano infettate facilmente dal FIV, mentre le cellule T sono le cellule più sensibili a questo virus. Le iDC sono capaci di infettare in trans le cellule T CD4+ indirizzando il virus ai recettori delle sinapsi immunologiche, accrescendo la possibilità di dare origine a eventi produttivamente infetti ( McDonald D. et al.,2003). Siccome questo sembra essere un ruolo chiave delle DC nella patogenesi dell’AIDS, sono stati portati avanti esperimenti per sapere se FIV poteva essere trasmesso dalle DC. Le DC infettate con basse quantità di FIV infettavano in trans le cellule T, come è stato riportato anche da altri autori mentre questo lavoro era ancora in preparazione (Van der Meer et al. 2007), tale tipo di trasferimento è stato dimostrato precedentemente per HIV-1 (Geijtenbeek et al.,2000; McDonald et al., 2003). Prima di dare inizio alla risposta immunitaria, le DC hanno bisogno di maturare e aumentare i livelli di molecole di superficie (Sallusto e Lanzavecchia, 2002, Steinman et al., 2003). È stato messo in evidenza che l’infezione con certi retrovirus interferisce con la maturazione delle DC. Nel HIV-1 e nel SIV l’inibizione della maturazione è stata ipotizzata come uno dei meccanismi che contribuiscono alla deficienza immunitaria durante la fase di AIDS (Fantuzzi et al., 2004, Granelli Piperno et al., 2004). Per le DC umane, la maturazione e la produzione di HIV sono stati trovati mutualmente esclusivi (Cavrois et al., 2006, Granelli-Piperno et al., 2003). Noi abbiamo dimostrato che le iDC feline infettate con FIV rispondevano all’ LPS alzando l’espressione del MHC di classe II
e B7.1 e aumentavano la loro capacità di dare una risposta alloreattiva. Del resto solo una bassa percentuale di iDC erano produttivamente infette.
6. Conclusioni
Dai risultati ottenuti in questa ricerca emerge la possibilità di infettare le iDC e le mDC feline con FIV. L’infezione inoltre non ha alcune effetto sulla maturazione.
Abbiamo visto che l’infezione da FIV sulle DC è mediata da CXCR4. È stata osservata la capacità delle DC di infettare le cellule T in trans. Questo, insieme alla titolazione del virus prodotto dalle DC su MBM, ci ha permesso di dire che il virus prodotto è infettante.
Glossario
1. Ag: antigene
2. APC: cellule presentanti l’antigene 3. ConA: concanavalina A
4. DC: cellule dendritiche 5. DO: densità ottica
6. DI50: dosi infettanti il 50% di colture cellulari
7. ELISA: enzimatic linked immunosorbent assay 8. Env: envelope
9. FACS: fluorescence activated cell sorter 10. FCS: fetal calf serum
11. FITC: fluorescein isothiocyanate 12. FSC: forward light scattered
13. FIV: feline immunodeficiency virus
14. GM-CSF: fattore stimolante colonie di granulociti e macrofagi 15. HIV: human immunodeficiency virus
16. iDC: cellule dendritiche immature 17. IFN: interferon
18. Ig: immunoglobulina 19. IL-2 : interleuchina 2 20. IL-4: interleuchina 4 21. LPS: lipopolisaccaride
22. MBM : linea cellulare T linfoide
23. mDC: cellule dendritiche mature
24. MHC: major histocompatibility complex 25. NK: natural killer
26. PBMC: peripheral blood mononuclear limphocytes 27. PBS: phosphate buffer saline
28. SIV: simian immunodeficiency virus 29. TNFα: tumor necrosis factor
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