RIASSUNTO ANALITICO
Nel girasole l’inflorescenza è un capolino, caratteristico della famiglia delle Compositae. I fiori periferici zigomorfici (monosimmetrici, simmetria bilaterale) sono sterili (fiori del raggio) con tre petali allungati, e strutture maschili vestigiali. I fiori del disco actinomorfici (polisimmetrici, simmetria radiale), ermafroditi e protetti da una brattea involucrale, hanno corolla tubulare, ovario infero e sepali trasformati in pappo. Le cinque antere, con filamenti separati ed inseriti alla base della corolla, deiscono longitudinalmente e sono unite a formare un cilindro intorno allo stilo.
In questa tesi sono presentati e discussi i dati relativi alle osservazioni morfologiche e alle analisi genetiche ed istologiche condotte su due mutanti dello sviluppo fiorale Chrysanthemoides (Chry) e tubular ray flower (turf) recentemente isolati in girasole (Helianthus annuus L.).
Il mutante Chry è caratterizzato da una modificazione delle corolle radialmente simmetriche proprie dei fiori tubulari del disco in corolle monosimmetriche simili a quelle dei fiori ligulati. Lo zigomorfismo è molto pronunciato nei fiori del disco situati nei cerchi più periferici dell’infiorescenza, mentre la monosimmetria è meno marcata verso il centro dell’infiorescenza. Sebbene il mutante Chry sia conosciuto da centinaia di anni, gli studi sul suo controllo genetico sono scarsi e contraddittori. I risultati ottenuti dalla nostra analisi genetica indicano che la mutazione Chry è semidominante ed esclude un’influenza materna. I dati raccolti nelle progenie F2, BC1 e F3, supportano un modello genetico che implica il coinvolgimento di un gene maggiore ed un numero indefinito di geni modificatori.
Il mutante turf è caratterizzato dalla trasformazione dalle corolle zigomorfiche tipiche dei fiori del raggio a corolle quasi radialmente simmetriche tipiche dei fiori tubulari. I risultati dell’analisi genetica indicano che un singolo gene recessivo controlla il carattere. Tuttavia la mutazione non è completamente stabile revertendo al tipo selvatico con una frequenza elevata (1,70%) che suggerisce fenomeni di trasposizione o più verosimilmente una natura epigenetica
della mutazione (epimutazione). Le piante revertanti autofecontate segregavano piante normali e mutanti in un rapporto 3:1, indicando che la reversione aveva interessato un solo allele.
L’analisi dettagliata delle caratteristiche morfologiche fiorali dei mutanti Chry e turf, ha dimostrato che entrambe le mutazioni interferiscono sullo sviluppo degli stami e dei carpelli. Molti dei fiori del disco localizzati in cerchi periferici dell’infiorescenza Chry mostrarono una drastica riduzione della lunghezza degli stami, ed allo stesso tempo l’assenza degli ovuli, così come lo sviluppo di stigmi non ramificati. Al contrario nel mutante turf i fiori del raggio modificati in fiori tubulari acquisiscono la capacità di differenziare sia stami che ovuli fertili. Analisi istologiche hanno evidenziato trasformazioni omeotiche sia dei filamenti sia delle antere in strutture petaloidi. Questi risultati ci inducono a ritenere un ruolo fondamentale dei geni CHRY e TURF nella programmazione della simmetria della corolla e suggeriscono l’esistenza di interazioni chiave tra entrambi i geni ed i geni responsabili dell’identità degli organi fiorali.
SUMMARY
The inflorescence of Helianthus annuus is heterogamous, with flower heads bearing two distinct flower types. Zygomorphic flowers (ray flowers), with one plane of reflectional symmetry, are characterized by three elongated petals fused to form strap-like structures surmounting a short corolla tube. They are located in the outermost whorl of the head and are sterile, retaining only filamentous remnants of the aborted stamens and/or style and large flat ovaries with no ovules. The number of ray flowers in H. annuus is genetically determined, and mutant types occur with more than the normal number of ray flowers, and occasionally none. Actinomorphic disk flowers (tubular flowers) are arrayed in arcs radiating from the center of the head to form distinct left- and right-turning spiral rows. They are hermaphrodite, carrying both male and female organs. Each disk flower is subtended by a sharp-pointed chaffy bract, and it consists of an inferior ovary carrying a single ovule, two pappus scales (highly modified sepals), and a five-lobed tubular-like corolla. The five anthers are joined together to form a tube, with separate filaments attached to the base of the corolla tube. Inside the anther tube is the style, terminating in a divided stigma with receptive surfaces in close contact in the bud stage before the flower opens.
In this thesis data on morphological genetic and histological analyses of two floral developmental mutant of sunflower are presented and discussed.
The first, named Chrysanthemoides (Chry), or Florepleno, owes its unusual appearance to the fact that the corolla of disk flowers has become elongated and somewhat quilled assuming a monosymmetric ray-like aspect. This mutant, which looks like a giant chrysanthemum, is very old, for it is illustrated in the herbals, and the mutation that caused it, apparently occurred in the first hundred years after the sunflower reached Europe from North and Central America. The second, named tubular ray flower (turf) is characterized by a shift from the zygomorphic corolla of ray flowers into a nearly actinomorphic tubular-like corolla.
The genetic control of the Chry mutation of sunflower is still debatable. Reciprocal crosses between normal and mutant plants gave F1 plants with a very peculiar intermediate
phenotype. The length of the corolla and zygomorphy progressively decrease from the periphery (2nd whorl) to the center of F1 inflorescences. Indeed, in the center of F1 capitula
(about a quarter of the head) the flowers are nearly actinomorphic. No phenotypic differences were observed between reciprocal crosses, thus excluding maternal influences on the trait. A wide range of intermediate phenotypes was displayed by F2 populations. The progenies had a
continuum of intermediate plants ranging from those with only a single whorl of modified disk flowers to plants with only few tubular-like flowers arranged in the center of the head. Although this distribution resembled those expressed by a quantitative trait, the frequency of normal plants in F2 progenies (one-quarter of all the population) suggested a simple control of
the Chry mutation. By grouping all intermediate types in a single phenotypic class, F2
populations segregated into mutant, intermediate and normal types fitting a 1:2:1 ratio. These data indicated that a single semidominant major gene probably controls the Chrysantemoides trait. The analyses of F3 and backcross (BC1) populations were conformed to single-gene
prediction. The range of phenotypes observed in F2 progenies might be due to modifying
genes activated in presence of a major Chry allele.
In the genetic analysis of the turf mutant F1 progenies consisted of normal plants only,
while F2 progenies segregated into normal and mutant phenotypes fitting a monogenic 3:1
ratio. Therefore, the turf trait appears to be controlled by a single nuclear recessive gene. However, this mutation was not completely stable, occasionally reverting to wild-type or nearly wild-type plants. In fact, several ray flowers of reverted wild-type showed unusual characteristics as well as differentiation of filaments with very small anthers without pollen grains, and petaloid structures attached at the base of the corolla. In addition, the corolla were often contorted and a higher length of the corolla tube confined to the proximal end. Ovules were never detected in these ray flowers. Transposon insertion or epimutation (i.e.
ipermethylation) could be hypothesized for turf and reversion could be correlated to a transposon excision or gene demethylation. Since chimeric plants was not found it is likely that the reversion most occurred during the gametes development. The selfed progenies of these plants segregated into normal and mutant phenotypes fitting a monogenic 3:1 ratio, indicating that the reversion affected a single allele.
It is also report in detail the morphological floral features of Chry and turf. The analyses demonstrate that both mutations also affect the development of stamens and carpels. Most disk flowers found in the peripheral whorls of Chry heads showed drastic reduction in stamen length, as well as the absence of ovules, and developed an unbranched style. In contrast, tubular-like ray flowers of turf achieved the ability to differentiate both fertile stamens and ovules. Homeotic transformations were also identified in the tubular-like ray flowers of turf, affecting both filaments and anthers that displayed petaloid-like traits. The results point to a primary role for TURF and CHRY in the programming of the corolla symmetry and suggest a key interaction of both genes with floral organ identity genes.
PREFAZIONE
SCOPO DELLA TESI
Lo scopo di questa tesi è la caratterizzazione morfologica e l’analisi genetica di alcuni mutanti fiorali di girasole. In particolare è stata effettuata l’analisi genetica sia del mutante Chrysantemoides (Chry) che del mutante tubular ray flower (turf) ed analizzata in modo dettagliato la morfologia dei loro organi fiorali, con una particolare attenzione puntata sullo sviluppo degli stami e dei carpelli.
Saranno discusse le possibili interazioni tra geni che programmano la simmetria della corolla e quelli che determinano l’identità degli organi fiorali.
L’individuazione di un gene dipende essenzialmente dalle modificazioni fenotipiche prodotte da un allele rispetto ad un altro. Se tutti gli alleli di un gene producessero effetti simili, tale gene non potrebbe essere identificato fenotipicamente ma apparirebbe sempre come parte del fenotipo normale che comprende l’effetto di numerosissimi geni. Nella storia della genetica, quindi l’individuazione di alleli responsabili della comparsa di nuovi effetti fenotipici è sempre stata fondamentale nella comprensione del controllo genetico dei processi di sviluppo.
L’individuazione di una mutazione, la caratterizzazione del suo effetto fenotipico e la sua analisi genetica classica per comprendere i rapporti di interazione con le altre forme alleliche ed, eventualmente, con altri geni, rappresentano il primo passo nella individuazione del gene stesso e della sua funzione all’interno dell’organismo.
Lo studio dei mutanti fiorali ha permesso di isolare e caratterizzare geni che sono di grande interesse, non soltanto per approfondire le conoscenze dei processi di differenziazione,
ma anche perché aprono la possibilità, in un futuro prossimo, di modificare in modo misurato le caratteristiche di singoli fiori o di intere infiorescenze.
Data l’importanza scientifica ed applicativa di comprendere i meccanismi genetici coinvolti nella fioritura, l’importanza specifica del girasole come pianta oleifera ed il suo crescente interesse come pianta ornamentale, abbiamo ritenuto interessante indagare il controllo genetico di alcuni mutanti fiorali di Helianthus annuus con la prospettiva di aggiungere un pur piccolo tassello al grande puzzle dei meccanismi genetici della fioritura.
SOMMARIO
1. INTRODUZIONE... 9
1.3. CONTROLLO GENETICO DELLO SVILUPPO FIORALE ... 35
1.4. CENNI DI GENETICA EVOLUTIVA DELLA SIMMETRIA FIORALE... 40
2. IL GIRASOLE ... 47
2.1. ORIGINE ED IMPORTANZA ECONOMICA DEL GIRASOLE (Helianthus annuus L.) ... 47
2.2. ANATOMIA FIORALE E ANTESI DEL GIRASOLE ... 49
2.2.1. Descrizione dell’infiorescenza ... 50
2.2.2. Iniziazione fiorale ... 51
2.2.3. Antesi... 53
2.3. MUTANTI DELLO SVILUPPO FIORALE DEL GIRASOLE ... 54
3. MATERIALI E METODI ... 60 3.1. MATERIALE VEGETALE... 60 3.2. ANALISI GENETICA... 60 3.3. ANALISI MORFOLOGICHE... 62 3.4. ANALISI ISTOLOGICA ... 63 3.5. ANALISI STATISTICA... 64 4. RISULTATI E DISCUSSIONE ... 65
4.1. ANALISI MORFOLOGICA DEL MUTANTE Chrysanthemoides (Chry). ... 65
4.2. ANALISI GENETICA DEL MUTANTE Chrysanthemoides (Chry) ... 74
4.3. ANALISI MORFOLOGICA DEL MUTANTE tubular ray flowers (turf). ... 84
4.4. ANALISI GENETICA DEL MUTANTE tubular ray flowers (turf) ... 94
4.5. LA MUTAZIONE tubular ray flower (turf) E’ INSTABILE... 95
5. CONCLUSIONI... 101
1. INTRODUZIONE
1.1. FORMAZIONE E SVILUPPO DEI MERISTEMI FLORALI
Una delle più grandi differenze nello sviluppo, tra un organismo vegetale ed uno animale, è la capacità del primo di generare nuovi organi dopo l’embriogenesi, ad opera di un gruppo specializzato di cellule “perpetuamente giovani” che non subiscono processi di differenziamento ma sono unicamente responsabili della produzione di nuove cellule che andranno a formare i diversi tipi di tessuti ed organi (D’Amato, 1985). Questi gruppi di cellule prendono il nome di meristemi e, poiché originano indefinitamente nuove cellule, sono i diretti responsabili della crescita delle piante.
Una delle caratteristiche morfologiche essenziali delle piante superiori è rappresentata dallo sviluppo secondo l’asse longitudinale caulinare-radicale. L’accrescimento delle piante avviene mediante divisioni cellulari in corrispondenza dei meristemi del germoglio e della radice, seguendo uno specifico andamento anche in senso radiale. Il gruppo organizzato di cellule in attiva divisione che costituisce il meristema apicale del germoglio consente alla pianta di accrescersi verso l’alto e di produrre gemme costituite da cellule proliferanti che danno origine alle strutture fogliari e fiorali, mentre il meristema apicale delle radici consente alla pianta di svilupparsi verso il basso e di produrre l’apparato radicale. La differenziazione, in un organismo vegetale di un meristema dei germogli e di uno delle radici avviene durante gli stadi precoci dell’embriogenesi. Infatti dopo la fecondazione, la prima divisione cellulare è asimmetrica e produce una cellula terminale ed una cellula basale di diverse dimensioni. La cellula terminale, più piccola, darà origine in sequenza prima al pro-embrione e poi a
buona parte dell’embrione che, sviluppandosi, produrrà il germoglio della pianta. La cellula basale, più grande, darà invece origine al sospensore. Tale differenziazione interviene allo stadio iniziale di sfera e perciò l’organizzazione della pianta risulta già fissata quando allo stadio successivo di cuore l’embrione è costituito da migliaia di cellule. Il meristema apicale del germoglio si formerà a partire da un gruppo di cellule localizzate tra i cotiledoni, quando l’embrione è allo stadio di torpedo, mentre il meristema apicale della radice si formerà da cellule situate all’estremità opposta dell’asse embrionale.
Durante la fase vegetativa il meristema apicale caulinare determina l’architettura della pianta producendo una serie reiterante di primordi che si sviluppano in foglie, o in germogli ascellari con un proprio meristema apicale. Con l’induzione fiorale molti, o tutti, i meristemi vegetativi subiscono una conversione a meristemi dell’infliorescenza (in specie a fiori composti) che producono i meristemi fiorali (Bernier, 1988).
Già nel 18° secolo è stato ipotizzato che i fiori fossero dei germogli modificati (Goethe, 1790). Infatti, esattamente come i germogli, sono organizzati intorno ad un asse che termina apicalmente con un meristema e porta lateralmente degli organi. Gli organi fiorali sono considerati omologhi alle foglie in quanto la loro anatomia e il loro processo di sviluppo sono sufficientemente simili. Si può così sicuramente affermare che la struttura aerea di una pianta sia generata da tre meristemi omologhi: vegetativo, dell’infiorescenza e fiorale. Questi tre diversi meristemi differiscono per la tipologia degli organi prodotti, nella fillotassi e nella lunghezza degli internodi. Tuttavia ciò che differenzia maggiormente il meristema fiorale da quello vegetativo è il fatto che con la formazione degli organi fiorali la sua capacità organogenetica viene esaurita. La sua crescita è quindi di tipo determinato, anche se sono noti alcuni casi di ritorno alla crescita indeterminata (Stebbins e Yagil, 1966; Feeling e Hake, 1985; Steeves e Sussex, 1989; Ogas et al., 1997).
Dato che l’induzione fiorale comporta la transizione del meristema vegetativo a meristema dell’infiorescenza (o fiorale in specie a fiori singoli) e da questo a meristemi fiorali, un’analisi completa dello sviluppo deve partire dallo studio dei meccanismi che regolano tali passaggi (Blázquez et al., 2006).
Da un punto di vista genetico questi processi sono stati studiati osservando ed analizzando mutanti fiorali, soprattutto prendendo a modello le angiosperme Arabidopsis thaliana (Cruciferae) e Antirrhinum majus (Plantaginaceae) (Fig. 1), riguardo alle quali la genetica classica ha rivelato la presenza di geni che controllano le diverse fasi dello sviluppo fiorale, e le tecniche biomolecolari ne hanno verificato le funzioni ed interazioni (Schwarz-Sommers et al., 1990; Coen, 1991; Lord, 1994; Meyerowitz, 1995; Blázquez et al., 2006).
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Fig. 1.
Infiorescenze di Antirrhinum majus (A) e Arabidopsis thaliana (B).
Il passaggio dalla fase vegetativa a quella riproduttiva, spesso denominato “evocazione fiorale”, è fortemente influenzato sia da fattori estrinseci che intrinseci, quali temperatura, luce, nutrizione, età, ed è altresì evidente, dall’analisi di mutanti con alterata iniziazione fiorale, che la risposta della pianta agli stimoli induttivi è controllata geneticamente. In Arabidopsis, dove la fioritura è promossa da un fotoperiodo lungo e ritardata da uno corto, lo studio di mutanti che fioriscono tardivamente ha fornito delle indicazioni riguardo ai meccanismi genetici responsabili della percezione ed elaborazione degli stimoli induttivi. Un gruppo di mutanti, tra cui constans (co) e gigantea (gi) subiscono un ritardo della fioritura in condizioni fotoperiodiche di giorno lungo, mentre in condizioni di giorno breve fioriscono contemporaneamente al tipo selvatico. Ciò ha suggerito che i geni CO e GI fungano da mediatori per lo stimolo indotto dal giorno lungo e che operino nell’ambito del meccanismo di induzione fiorale indipendentemente dal fotoperiodo (Koornneef, 1998). In un altro gruppo di mutanti, tra cui ft e fwa, invece, la fioritura posticipata è indipendente dalla lunghezza del giorno, ed è stato quindi proposto che i geni FT ed FWA funzionino nell’ambito di un meccanismo che promuove la fioritura a prescindere dalle condizioni ambientali (Ruiz-Garcia, 1997). E’ probabile che questi gruppi di geni agiscano in maniera concertata per attenuare il passaggio di fase andando ad attivare altri geni coinvolti nel processo di iniziazione fiorale e/o modulando la capacità dei meristemi di rispondere a tali geni (Nilsson, 1998).
Il passaggio di fase si traduce quindi nella trasformazione del meristema vegetativo in meristema dell’infiorescenza, dal quale originano i meristemi fiorali. In Arabidopsis e Antirrhinum il meristema dell’infiorescenza produce, secondo uno schema a spirale, un numero indefinito di meristemi fiorali che mantengono la caratteristica vegetativa di crescita indeterminata. In Antirrhinum, ma non in Arabidopsis, il meristema dell’infiorescenza produce i meristemi fiorali all’ascella di
organi simili a foglie, le brattee. I meristemi fiorali sono a crescita determinata, producendo un numero costante di organi fiorali disposti su cerchi concentrici.
La scoperta di mutanti che hanno perso funzioni necessarie per un corretto programma di sviluppo fiorale ha rivelato l’esistenza di un gruppo di geni che giocano un ruolo fondamentale nel processo di iniziazione. Nella determinazione dell’identità del meristema del fiore particolare importanza sembrano avere LEAFY (LFY) e APETALA1 (AP1) in Arabidopsis (Irish e Sussex, 1990; Mandel et al., 1992; Weigel e Nilsson, 1995) ed i loro presunti omologhi FLORICAULA (FLO) e SQUAMOSA (SQUA) di Antirrhinum (Coen et al., 1990; Huijser et al., 1992a). Osservazioni su mutanti lfy e ap1 mostrano come al posto dei fiori vengano prodotte strutture morfologicamente intermedie tra un germoglio ed un fiore, mentre doppi mutanti lfy;ap1 non formano nemmeno fiori germogliformi (Schulz e Haughn, 1991; Huala e Sussex, 1992; Bowman et al., 1993). Esperimenti di trasformazione di questi geni (che fanno esprimere costitutivamente uno o l’altro sotto il controllo del promotore 35S del virus del mosaico del cavolfiore) evidenziano una modificazione completa o parziale dei germogli in fiori, dimostrando la loro funzione chiave nell’attivare il programma fiorale (Mandel e Yanofsky, 1995; Weigel e Nilsson, 1995). Il fatto che le singole mutazioni lfy o ap1 inducano lo sviluppo di un certo numero di strutture fiorali o simil-fiorali, mentre mutanti doppi lfy;ap1 consentano solo la differenziazione di germogli vegetativi, indica come l’espressione di entrambi i geni (LFY e AP1) sia necessaria per la completa transizione verso la funzione riproduttiva (Schulz e Haughn, 1993). Appare inoltre evidente che AP1 agisce a valle di LFY nel controllo del destino del meristema; infatti, in piante transgeniche per il gene LFY, la trasformazione di germogli laterali in fiori è notevolmente attenuata dalla presenza di mutazioni ap1, mentre piante transgeniche per il gene AP1 con mutazioni lfy non manifestano tale fenomeno (Mandel e Yanofsky, 1995; Weigel e Nilsson, 1995).
Un altro gene che gioca un ruolo fondamentale nel processo di iniziazione florale è CAULIFLOWER (CAL). Mutanti cal non manifestano anormalità morfologiche evidenti, mentre doppi mutanti cal;ap1 sviluppano meristemi fiorali che originano una spirale indeterminata di meristemi apicali privi di organi differenziati, indicando come CAL sia funzionalmente ridondante ad AP1 (Bowman et al., 1993; Pidkowich et al., 1999).
I dati sopra esposti indicano come, nel primordio fiorale, questi geni interagiscano stimolandosi reciprocamente, assicurando così che ognuno sia espresso a livello sufficiente e necessario per garantire il completo passaggio alla fase riproduttiva (Parcy, 1998). Ciò è importante anche alla luce del fatto che le funzioni dei prodotti LFY e, AP1 e CAL, sono essenziali, oltre che per la determinazione dell’identità fiorale dei meristemi, per regolare aspetti diversi dello sviluppo fiorale. Sembra che LFY sopprima lo sviluppo fogliare ed inibisca l’allungamento degli internodi, mentre AP1 e CAL sopprimerebbero la ramificazione. Entrambe le funzioni giocherebbero inoltre un ruolo nell’attivazione di specifici geni che determinano l’identità degli organi fiorali (Weigel et al., 1992; Bowman et al., 1993; Weigel e Meyerowitz, 1993; Albert, 1999; Blázquez et al., 2006).
In Antirrhinum il mutante floricaula (Fig. 2) presenta una crescita vegetativa normale ed attua la transizione a meristema dell’infiorescenza in maniera simile al tipo selvatico, ma all’ascella delle brattee, invece di essere formati fiori, vengono differenziati germogli indeterminati che producono ulteriori brattee, all’ascella delle quali possono essere prodotti altri germogli, e questa sequenza può essere ripetuta indefinitamente. Il prodotto del gene FLO è quindi ritenuto necessario per attuare il passaggio da meristema dell’infiorescenza a meristema fiorale (Coen et al., 1990; Coen, 1991). Sembra inoltre che FLO regoli non solo il passaggio da meristema dell’infiorescenza a meristema fiorale, ma che abbia anche un ruolo nel determinare, ad
uno stadio precoce, lo schema di sviluppo dei futuri organi fiorali, ovvero che abbia un ruolo nell’attivazione dei geni che nel meristema fiorale determinano l’identità dei verticilli del fiore (Coen, 1991).
Fig. 2.
Sulla sinistra infiorescenza del mutante Floricaula; sulla destra infiorescenza “wild-type” di Antirrhinum majus.
Il mutante presenta una normale crescita vegetativa ed attua la transizione a meristema dell’infiorescenza in maniera simile al tipo selvatico, ma all’ascella delle brattee, invece di essere formati fiori, vengono differenziati germogli indeterminati che producono ulteriori brattee, all’ascella delle quali possono essere prodotti altri germogli, e questa sequenza può essere ripetuta indefinitamente.
Un altro mutante con simile espressione fenotipica è squamosa. Il gene SQUA tuttavia, a differenza di FLO, non sembra indispensabile per stabilire l’identità fiorale dei meristemi ascellari dell’infiorescenza. Infatti mentre i mutanti flo non fioriscono mai, i mutanti squa occasionalmente sono in grado di produrre fiori deformati ed incompleti (Schwarz-Sommer et al., 1990; Huijser et al., 1992a). La funzione di squa potrebbe essere quella di esaltare la risposta a presunti segnali di induzione fiorale, coordinando la risposta delle singole cellule del meristema in modo da ottenere una completa conversione a meristema fiorale (Huijser et al., 1992b). L’andamento temporale e spaziale dell’espressione di FLO e SQUA nei primordi delle brattee, dei fiori e degli organi fiorali (con l’eccezione degli stami) suggerisce che le attività dei due geni interagiscano, ed il fatto che ognuno sia espresso normalmente nel mutante per l’altro indica come l’interazione, in questo caso, non abbia come funzione la regolazione reciproca delle rispettive attività ma sembra più probabile che i loro prodotti genici interagiscano in un processo di regolazione post-trascrizionale di geni bersaglio comuni (Huijser et al., 1992a).
In Arabidopsis e Antirrhinum non vengono prodotti fiori terminali apicali in quanto il meristema apicale dell’inflorescenza non subisce la transizione a meristema fiorale (Liljegren e Yanofsky, 1996). Tuttavia mutanti quali terminal flower (tfl) di Arabidopsis e centroradialis (cen) di Antirrhinum (Fig. 3), sono in grado di produrre fiori terminali indicando come i prodotti di questi geni siano indispensabili per mantenere l’attività indeterminata del meristema (Shannon et al., 1991; Alvarez et al., 1992; Bradley et al., 1996; Larsson et al., 1997). Studi di ibridazione in situ dimostrano come TFL e CEN agiscano inibendo l’espressione dei geni per l’identità dei meristemi florali (LFY e/o AP1 e FLO) nell’apice del meristema dell’infiorescenza che mantiene così la sua identità (Blázquez et al., 2006).
D’altra parte gli studi di ibridazione in situ confermano ciò che appare evidente anche dall’osservazione dei fenotipi mutanti, che producono si un fiore terminale, ma solo dopo aver differenziato alcuni fiori laterali, e cioè che CEN e TFL sono trascritti dopo l’attivazione di geni che specificano l’identità del meristema dell’infiorescenza (Weigel et al., 1992; Schultz e Haughn, 1993; Gustafson-Brown et al., 1994; Bradley et al., 1996). Infatti, in Antirrhinum, l’espressione di FLO è e necessaria per attivare l’espressione di CEN, che successivamente inibisce l’attività di FLO. In Arabidopsis, l’osservazione che i doppi mutanti lfy;tfl differiscono notevolmente da mutanti singoli lfy indica come l’attivazione di TFL non dipenda interamente dall’espressione di LFY (Shannon e Meeks-Wagner, 1993; Schultz e Haughn, 1993).
In alcune piante se dopo l’inizio del processo riproduttivo vengono a mancare le condizioni induttive i fiori revertono verso lo stadio vegetativo (Battey e Lyndon, 1990). In Arabidopsis e Antirrhinum invece, come in molte altre piante, la fioritura, una volta
Fig. 3.
Infiorescenza del mutante centroradialis.
L’infiorescenza diviene “determinata”;
sull’infiorescenza, che termina con un fiore dalla simmetria alterata (actinomorfica), si sviluppano approssimativamente 9 fiori normali (zigomorfici).
avviata, prosegue anche se le piante vengono poste in condizioni non induttive, suggerendo la presenza di uno specifico meccanismo che garantisce il mantenimento di uno stato induttivo. In queste due specie tale meccanismo è determinato dalle funzioni geniche AGAMOUS (AG) e PLENIFLORA (PLE), responsabili tra l’altro dell’identità degli organi dei verticilli fiorali più interni. Il fatto che fiori di mutanti ag posti in condizioni di giorno corto producano al loro centro una struttura simile ad una infiorescenza, suggerisce che il meristema fiorale di questo mutante reverta, in assenza del segnale induttivo provocato dal giorno lungo, a meristema dell’infiorescenza (Okamuro et al., 1993). Ciò indica come il prodotto AG sia necessario per mantenere all’interno del meristema l’identità fiorale stabilita dai geni precedenti. In condizioni induttive i mutanti ag e ple producono fiori con un numero indeterminato di verticilli interni suggerendo come i geni AG e PLE siano sicuramente anche necessari per specificare l’identità determinata del meristema fiorale (Bowman et al., 1993; Bradley et al., 1993).
Altri geni che giocano un ruolo nella determinazione dell’identità meristematica fiorale e nell’identità degli organi fiorali sono UNUSUAL FLORAL ORGANS (UFO) di Arabidopsis e l’omologo FIMBRIATA di Antirrhinum (Komaki et al., 1988; Levin e Meyerowitz, 1995; Wilkinson e Haughn, 1995). I fenotipi mutanti per questi geni evidenziano caratteristiche sia dei mutanti dell’identità meristematica fiorale che dei mutanti dell’identità degli organi fiorali, presentando ulteriori infiorescenze al posto dei fiori di primo e secondo ordine, dopo i quali vengono prodotti fiori con trasformazione omeotiche più o meno estese degli organi fiorali, soprattutto a carico del secondo e terzo verticillo. Inoltre mutanti ufo e fim mostrano una perdita di organizzazione verticillare che si traduce in un diverso numero e in una posizione alterata degli organi. Studi di ibridazione in situ hanno dimostrato che FIM è espresso in successione, dopo i geni per l’identità fiorale del meristema e prima dei geni per l’identità degli organi; infatti
l’espressione di FIM dipende dall’attività di FLO, e l’attività di FIM è necessaria per l’espressione di almeno due geni per l’identità degli organi fiorali. E’ dunque ipotizzabile che i geni FIM e UFO agiscano come mediatori tra le due classi di geni, anche se è stato osservato come i geni che determinano l’identità fiorale del meristema svolgano essi stessi un ruolo nel suo successivo sviluppo (Shannon e Meeks-Wagner, 1993; Ingram et al., 1995).
1.2. CONTROLLO GENETICO DELL’IDENTITÀ DEGLI ORGANI FIORALI
Tipicamente il fiore di una dicotiledone consiste di quattro verticilli, che internamente si identificano con gli organi riproduttivi maschili e femminili. Gli stami includono infatti le antere ed i carpelli sono spesso fusi e racchiudono il pistillo e gli ovuli. Sebbene l’organizzazione e le funzioni di questi organi siano a maturità totalmente diverse, ognuno dei quattro verticilli all’inizio del proprio sviluppo appare come una protuberanza del meristema fiorale. E’ quindi evidente come le cellule di cui si compone ogni primordio degli organi fiorali debbano seguire un preciso programma di differenziazione e specializzazione (Blázquez et al., 2006).
Nella comprensione del controllo dei processi di organogenesi rivestono fondamentale importanza i mutanti omeotici. Con il termine “omeosi” si intende quel fenomeno per cui un organo di una serie meristica sorge al posto di un altro organo della stessa serie (Bateson, 1894). I primi mutanti di questo tipo ad essere studiati in modo approfondito sono stati quelli di Drosophila. Il loro studio sistematico condotto soprattutto per merito del gruppo del genetista americano Ed Lewis già negli anni 50 ha apportato preziose informazioni sulla genetica dello sviluppo embrionale di organismi
animali superiori, compreso l’uomo (Lewis, 1978). Con il progredire delle conoscenze e con la messa a punto di sempre più precise tecniche biomolecolari numerosi geni omeotici sono stati isolati in organismi diversi, portando alla scoperta che tutti questi geni possiedono una sequenza nucleotidica comune (di circa 50 basi) altamente conservata, chiamata homeobox (HOX). I geni HOX codificano per fattori di trascrizione in grado di regolare l’attivazione di geni che controllano il differenziamento cellulare, legandosi a regioni specifiche del DNA.
Nelle piante, mutanti di tipo omeotico sono noti da tempo. Bateson nel 1894 descrisse il frequente fenomeno per cui dove dovrebbero svilupparsi stami si sviluppano petali (o strutture con vari gradi di somiglianza ai petali). Tuttavia, nonostante questi esemplari abbiano spesso suscitato l’interesse degli allevatori di piante ornamentali come fonte di variabilità utile per selezionare nuove varietà (si pensi alla rosa coltivata con il suo elevato numero di petali rispetto al tipo selvatico, o a numerose varietà di camelie con molti petali che si sviluppano al posto di stami e carpelli), per molti anni il mondo scientifico ha trascurato questo fenomeno.
Nel 1965 Vesta Meyer compilò una raccolta delle anormalità fiorali rivisitando la letteratura esistente, sottolineando anche l’importanza di tali alterazioni per la comprensione dei processi di differenziazione e sviluppo. Infatti, la moltitudine di fiori geneticamente identici prodotti da una Angiosperma, l’ereditabilità di molte anomalie, l’eventuale effetto del citoplasma sull’espressione fenotipica, l’effetto dell’ambiente, sono tutti fattori utili a mettere in luce le condizioni ed i processi che fanno si che l’apice meristematico usi la sua informazione genetica per differenziare una struttura fiorale invece che una foglia. La Meyer descrisse molti tipi di anormalità: le metamorfosi degli organi fiorali (le più frequenti sono la “petaloidia” degli stami e la “carpelloidia”), il cambiamento del sesso in piante monoiche e dioiche e riportò che,
nella maggior parte dei casi, le anormalità citate sono ereditabili e dovute a geni recessivi.
Sulla scia delle ricerche della Meyer negli ultimi venti anni c’è stata una rinascita dell’interesse verso i meccanismi di sviluppo delle piante e notevoli scoperte sono state fatte nella comprensione dei processi morfogenetici della fioritura, utilizzando lo stesso tipo di approccio usato in Drosophila, ovvero l’individuazione di mutanti fiorali omeotici, la loro analisi genetica per verificarne il controllo genetico, e l’isolamento dei geni e dei loro prodotti usando tecniche biomolecolari quali ad esempio “transposon tagging”. E’ interessante notare che nei prodotti di molti di questi geni, che pur non contengono l’homeobox, è stato ritrovato un dominio di circa 57 aminoacidi comune a proteine di altri organismi quali i lieviti (la proteina MCM1 che è un fattore trascrizionale importante nel determinismo del sesso) e anche nell’uomo (la proteina con ruolo trascrizionale Serum Factor Responce). La regione altamente conservata di questi geni è stata denominata MADS-box (MCM1-AGAMOUS-DEFICIENS-SRF: acronimo delle iniziali dei primi geni individuati che lo contengono: AGAMOUS di Arabidopsis e DEFICIENS di Antirrhinum, oltre ai geni codificanti le due proteine sopra menzionate). I geni sopra menzionati che la contengono (ad eccezione di MCM1 di lievito) svolgono ruoli fondamentali nello sviluppo e nella differenziazione cellulare. Studi molecolari hanno dimostrato che in queste proteine il dominio agisce come un fattore di legame al DNA sequenza-specifico (Pallock e Trisma, 1991).
Mentre l’homeobox e il MADS-box si sono conservati nel corso dell’evoluzione, si presume che molti processi di speciazione siano avvenuti in seguito a cambiamenti nella collocazione temporale di eventi coinvolti nello sviluppo ontogenetico. Questo fenomeno, definito come eterocronia, è stato ampiamente studiato nel nematode Caenorhabditis elegans. In questo organismo esistono molte mutazioni eterocroniche che causando la precoce interruzione nelle divisioni mitotiche determinano lo sviluppo
di linee cellulari che conducono alla formazione di organi complessi, generando peraltro fenotipi che rispecchiano forme ancestrali. Tali risultati hanno condotto a ritenere l’eterocronia uno dei meccanismi fondamentali nel processo evolutivo di questo nematode.
Nelle piante, piccoli cambiamenti nel determinismo temporale dei processi di differenziazione possono spiegare l’evoluzione di specie autogame e cleistogame (Lord et al., 1989). Studi compiuti sull’evoluzione delle forme fiorali di Delphinium, spiegano come, per mezzo delle mutazioni eterocroniche, un tipo fiorale attuale sia derivato da uno ancestrale (Guerrant, 1982). Tuttavia, allo stato attuale, negli organismi vegetali, gli unici geni eterocronici di cui esista una valida documentazione sono stati identificati nel mais (Poething, 1988). Mutanti per questi geni (teopod) presentano una fase giovanile prolungata dovuta ad alterazioni nel determinismo temporale dello sviluppo (Poething, 1988).
E’ interessante notare che, mentre negli animali i due concetti di eterocronia ed omeosi sono facilmente distinguibili in quanto la differenziazione di tutti gli organi avviene contemporaneamente (ad opera dei geni omeotici che segnalano la relativa posizione di ogni organo durante l’embriogenesi e dei geni eterocronici che segnalano quando questi organi devono svilupparsi), nelle piante, che hanno un tipo di sviluppo aperto e in cui nuovi organi sono continuamente formati, questa distinzione del controllo organogentico in temporale e spaziale può non essere così evidente. Ad esempio il mutante flo può essere considerato omeotico in quanto al posto di una struttura (il fiore) ne produce una omologa (la brattea), ma può anche essere considerato eterocronico in quanto presenta una continua ripetizione dello stesso passaggio della determinazione fiorale (la produzione del meristema dell’infiorescenza).
Storicamente esistono due tipi di modelli per spiegare come sia determinata l’identità degli organi fiorali. Uno si basa su una diversa espressione spaziale dei geni
coinvolti, l’altra su una diversa espressione temporale degli stessi geni (Wardlaw, 1957; Holder, 1979; Schwartz-Sommer et al., 1990; Coen e Meyerowitz, 1991; Lord et al., 1994; Blázquez et al., 2006). Secondo il modello spaziale molto presto nella differenziazione del meristema fiorale sarebbero definite le zone concentriche dei verticilli, indipendentemente dalla sequenza temporale in cui questi appaiono, e successivamente in queste zone sarebbero espressi contemporaneamente quei geni che specificano l’identità del primordio. Secondo il modello temporale, invece, la crescita consecutiva dei primordi sarebbe l’effetto dei diversi domini temporali di attività dei vari geni, ovvero, questi sarebbero espressi in funzione della loro relativa posizione, ma in un modo che rispecchia la sequenza d’iniziazione dei primordi (Coen, 1991).
Nonostante questa sottile differenza, per cui nel primo caso i geni sono definiti omeotici e nel secondo caso eterocronici, il modello dei partenza è lo stesso, ed è stato sviluppato attraverso lo studio di mutanti, soprattutto di Arabidopsis e Antirrhinum, con alterazioni nell’identità di alcuni organi fiorali. L’appartenenza di queste due specie a famiglie sistematiche lontane, ha consentitola di ipotizzare la validità di un’estensione di tale modello a molte dicotiledoni, e con qualche variazione anche alle monocotiledoni (Blázquez et al., 2006).
Nelle angiosperme i fiori sono organizzati in quattro regioni concentriche, i verticilli, ognuno dei quali è occupato da un diverso tipo di organo fiorale: il primo verticillo contiene i sepali, il secondo i petali, il terzo gli stami, il quarto i carpelli. I fiori
di Arabidopsis (Fig. 4) sono costituiti da quattro sepali, quattro petali, sei stami e due carpelli saldati assieme.
Ciò che ormai è appurato è che esistono tre classi di geni che controllano l’identità dei quattro verticilli fiorali. I geni della classe A sono responsabili della formazione dei sepali, quelli della classe B insieme a quelli della classe A sono responsabili della formazione dei petali, e quelli della classe C sono responsabili insieme ai geni B della formazione degli stami, e da soli della formazione dei carpelli. Queste classi di geni sono state scoperte attraverso lo studio di tre fenotipi mutanti ricorrenti nei due generi, dove l’alterazione dell’identità dell’organo interessava sempre due verticilli contigui. Nei mutanti apetala2 (ap2) di Arabidopsis ed ovulata (ovu) di Antirrhinum l’alterazione è a carico degli organi dei primi due verticilli dove si formano non sepali e petali, ma strutture che assomigliano a carpelli e stami (Coen, 1991; Schwarz-Sommer et al., 1990). Nei mutanti pistillata (pi) ed apetala3 (ap3) di Arabidopsis e deficiens (def) e globosa (glo) di Antirrhinum l’alterazione interessa il secondo ed il terzo verticillo che presentano organi rispettivamente sepaloidi e carpelloidi (Hill e Lord, 1989; Carpenter e Coen, 1990; Sommer et al., 1990; Jack et al., 1992; Fig. 5).
Fig. 4.
Fiore di Arabidopsis
E’ evidente la disposizione dei verticilli. Dall’esterno verso l’interno:
1°. sepali (se); 2°. petali (p); 3°. stami (st); 4°. carpelli (ca).
Nel mutante agamous (ag) di Arabidopsis e pleniflora (ple) di Antirrhnum nel terzo e quarto verticillo vengono formati, invece di stami e carpelli, strutture petaloidi e sepaloidi, ed in questo caso l’effetto della mutazione non è limitato a questi due verticilli ma continua, producendo una serie indeterminata di altri verticilli interni in cui lo schema fiorale viene ripetuto in modo indefinito indicando come la formazione dei carpelli segnali la fine dell’attività del meristema fiorale (Fig. 6).
Fig. 5.
Infiorescenza del mutante deficiens.
I fiori di questo mutante hanno un cerchio più esterno che presenta i normali cinque sepali, il secondo cerchio contiene invece cinque sepali individuali piuttosto che la corolla caratteristica del wild-type. Il terzo cerchio è composto da cinque carpelli uniti, il più in alto dei quali forma un anello schiacciato di tessuto ricettivo stigmatico. Il quarto cerchio non si sviluppa. Questo mutante è somaticamente instabile e, sporadicamente, isole di tessuto petaloide si sviluppano nel secondo cerchio sepaloide.
Il modello spaziale fu inizialmente proposto da Holder (1979) per spiegare con la formazione dei campi concentrici ormonali l’identità degli organi fiorali, va rivisto riconsiderando la teoria sulle informazioni posizionali formulata da Wolpert (1969), sullo sviluppo embrionale di Drosophila. Questo modello è stato ripreso e modificato da Shwarz-Sommer e coll. (1990) e Weigel e Meyerowitz (1994) che interpretando i fenotipi mutanti hanno ammesso che le attività dei geni delle classi A e C si escludono a vicenda: in apetala2 è assente l’attività A (espressione dei geni della classe A) che è necessaria perché si formino sepali nel primo verticillo e petali nel secondo, e quindi l’attività C può esprimersi, facendo si che si formino strutture simili a carpelli nel primo verticillo e strutture simili a stami nel secondo. Nel mutante agamous è assente l’attività C, per cui l’attività A può esprimersi promuovendo la formazione di strutture petaloidi e sepaloidi al posto di stami e carpelli. In questo mutante oltretutto sono presenti altri verticilli interni e quindi l’attività C è ritenuta anche responsabile del blocco dello sviluppo fiorale dopo la differenziazione dei carpelli.
Fig. 6.
Mutante pleniflora (ple) di antirrhinum
Il primo e secondo cerchio dei fiori sono simili a quelli del wild-type, mentre il terzo cerchio è formato da strutture petaloidi che sono unite per la maggior parte della loro lunghezza con i petali del secondo cerchio. Il quarto cerchio è formato da due parti con strutture variabili che mostrano
caratteristiche sepaloidi,
Un modello temporale fu proposto già da Wardlaw nel 1957 ed è stato adottato ed ampliato da Coen (1991) e da Lord e coll. (1994). Con questo modello si è cercato di spiegare la natura a mosaico degli organi differenziati nei verticilli sbagliati, che nel modello spaziale è trascurata. Il gruppo della Lord in particolare ha osservato dettagliatamente l’andamento dello sviluppo degli apici fiorali dei mutanti mediante analisi istologiche accurate (Hill e Lord, 1989; Crone e Lord, 1994). Lo studio ha condotto alla conclusione che non è l’intero processo di sviluppo dell’organo ad essere colpito dalla mutazione, in quanto l’iniziazione degli organi, anche se a diversi livelli, avviene regolarmente, mentre è la successiva differenziazione che devia dal fenotipo normale (Hill e Lord, 1989; Crone e Lord, 1994). L’assunzione di caratteristiche di organi diversi dipenderebbe quindi non da una diversa espressione spaziale dei geni, ma da una diversa espressione temporale degli stessi che si andrebbero esprimendo in modo consequenziale (ed in parte sovrapponendosi) in una maniera che rispecchia la comparsa sequenziale degli organi fiorali (Lord e al., 1994). Ad esempio, nel secondo verticillo del mutante pistillata di Arabidopsis compare un primordio con caratteristiche di un petalo, che però nel momento in cui inizia a differenziarsi non trova l’informazione necessaria sul come continuare a svilupparsi, per cui deve necessariamente usare ciò che è presente in quel momento nella zona circostante, cioè nella fattispecie, i residui dei prodotti dei geni A che hanno appena concluso di esplicare la loro funzione, cioè di indurre i primordi del primo verticillo a differenziarsi come sepali (Hill e Lord, 1989). Al momento della differenziazione degli organi del terzo verticillo i prodotti dei geni A sono ormai terminati, ed i primordi che iniziano lo sviluppo come stami diventano aberranti con proliferazioni casuali. Successivamente, quando si differenziano i carpelli, gli organi del terzo verticillo assumono anche loro caratteristiche carpelloidi, indicando come essi aspettino che compaia un prodotto di differenziazione per poterlo utilizzare (Lord et al., 1994). Questo modello è però valido
solo ipotizzando che la sequenza di formazione degli organi fiorali segua un andamento circolare piuttosto che lineare, solo così infatti si può spiegare come nel mutante apetala2 compaiano al posto dei sepali organi con caratteristiche non solo di foglie ma anche di carpelli (Crone e Lord, 1994). Analogamente, con questo modello si può spiegare come nel mutante agamous al posto dei carpelli si sviluppino organi sepaloidi, e come, mancando C, il ciclo si ripeta formando fiori all’interno di fiori.
Riassumendo la funzione A in Arabidospis è controllata da due geni differenti, APETALA1 e APETALA2 (AP1 e AP2), così la funzione B è specificata dai geni APETALA3 (AP3) e PISTILLATA (PI), mentre la funzione C è determinata da un solo gene, AGAMOUS (AG). In Antirrhinum la funzione B è controllata dai geni DEFICIENS (DEF) e GLOBOSA (GLO), mentre la funzione C è specificata dal gene PLENA (PLE). Riguardo alla funzione A, in questa specie, l’ortologo di AP1 è il gene SQUAMOSA (SQUA), che determina l’identità del meristema fiorale. La caratterizzazione di questi geni ha evidenziato che tutti codificano per fattori di trascrizione , suggerendo che i prodotti dei geni A, B, e C controllino la trascrizione di altri geni i cui prodotti sono a loro volta coinvolti nella formazione o nella funzione degli organi fiorali. Ad eccezione di AP2, questi geni condividono una sequenza di DNA di circa 180 pb (MADS-box). Tutti i geni omeotici delle piante codificano proteine attive come fattori di trascrizione. L’espressione di questi geni nei primordi delle gemme fiorali dovrebbe attivare l’espressione di altri geni specifici più direttamente coinvolti nella formazione di sepali, petali, stami e carpelli (Blázquez et al., 2006).
Circa la spiegazione del modello classico, è necessario comunque sottolineare che la dicitura ABC può essere usata in modo diverso. A, B, e C denotano infatti: i) tre regioni del meristema fiorale, cioè i domini di espressione dei geni omeotici fiorali, con A che rappresenta i due verticilli più esterni (1 e 2), B il secondo e terzo verticillo (2 e
3) e C i due verticilli più interni (3 e 4); ii) tre classi di mutanti omeotici, con la classe A che influisce sul primo e secondo verticillo, la classe B che agisce sul secondo e terzo verticillo e la classe C che influisce sul terzo e quarto verticillo; iii) tre classi di funzioni omeotiche regolatrici, con A che da solo specifica i sepali, A e B insieme i petali, B e C insieme gli stami, e C che da solo determina i carpelli; iv) tre classi di geni omeotici fiorali, con i geni delle singole classi A, B e C che controllano rispettivamente le funzioni omeotiche A, B e C. le interpretazioni secondo il modello classico ABC praticamente coincidono. Per esempio, un gene della classe C è responsabile della funzione omeotici fiorale C ed è espresso nella regione C del meristema fiorale. Le mutazioni di questi geni determinano mutanti di classe C, che implicano trasformazioni omeotiche degli organi della regione C, cioè stami e carpelli, in organi del perianzio, cioè petali e sepali, rispettivamente (Blázquez et al., 2006).
Il modello genetico ABC è stato sviluppato attraverso lo studio di mutanti indotti in due specie filogeneticamente abbastanza distanti, per cui l’estensione del modello ad altre angiosperme è stata considerata plausibile (Weigel e Meyerowitz, 1994). Esistono però casi di mutazioni omeotiche spontanee e processi di speciazione dovuti ad omeosi non spiegabili con questo modello; per esempio numerosi mutanti per un solo verticillo sono stati ripetutamente descritti nel corso degli anni (Sauders, 1912; Renner, 1959; Meyer, 1966; van Tunen e Angenent, 1991; Smith-Huerta, 1992; Lehmann e Sattler, 1994; Van der Krol e al., 1994). Per conciliare questi mutanti con modelli di sviluppo fiorale esistenti sono state formulate varie ipotesi. Una di queste si basa sull’eterocronia come reale causa delle trasformazioni omeotiche, e sul fatto che lo sviluppo di alcuni organi è ritardato rispetto ad altri, per cui, in funzione del momento in cui inizia a manifestarsi l’azione del gene mutato, alcuni organi potrebbero essere più colpiti rispetto ad altri. Un’altra ipotesi è che tali mutazioni non siano a carico dei geni bersaglio dei geni ABC. E’ stato infatti postulato che i geni per l’identità fiorale siano
regolatori e che la loro azione si esplichi attivando dei geni strutturali; quali siano però e come avvenga l’attivazione è ancora poco noto, mentre la comprensione di questo meccanismo potrebbe fornire dati utili a spiegare fenotipi di molti mutanti ad oggi non facilmente comprensibili. Un’altra ipotesi si basa su eventi di duplicazione genica e/o duplicazione genomica (in specie di origine polipoide) dei geni ABC che sarebbe stata seguita da un’assunzione di funzione genica divergente. Ciò avrebbe determinato che l’attività dei geni delle varie classi non si sovrapponesse nei diversi verticilli fiorali rimanendo piuttosto confinata in un singolo verticillo (Smith-Huerta, 1992).
Sulla base delle ricerche condotte in Petunia hybrida, il modello classico ABC è stato rielaborato ed esteso fino a formularne uno nuovo, noto come modello ABCD, poiché comprende una nuova funzione, quella D, connessa a geni principali che controllano lo sviluppo degli ovuli. Infatti, quando espressi in maniera ectopica, i geni D, che codificano per prodotti noti come FLORAL BINDING PROTEINS (FBP7 e FBP11), inducono la formazione di ovuli sugli organi che formano il perianzio dei fiori delle piante transgeniche. Analisi di similarità delle sequenze aminoacidiche hanno evidenziato che il gene omologo corrispondente in Arabidopsis è AGAMOUS-LIKE11 (AGL11). FB7, FB11, e AGL11 sono geni MADS-box strutturalmente molto simili al gene AG. Risultati ottenuti recentemente hanno evidenziato che i geni AGL2-LIKE costituiscono una sottofamiglia del MADS-box formata da diversi membri estremamente conservati nelle dicotiledoni e che verosimilmente regolano funzioni molto importanti ai fini della identità degli organi fiorali. Ad esempio, i geni AGL2, AGL4 e AGL9 sono espressi nei primordi del secondo, terzo e quarto verticillo fiorale e quindi sono richiesti per lo sviluppo di petali, stami e carpelli. La notevole similarità tra le sequenze e i modelli di espressione pressoché uguali suggeriscono che questi geni possano codificare per proteine aventi funzioni ridondanti, spiegando così il motivo dell’assenza di mutanti per i singoli geni. Tuttavia, l’ottenimento di mutanti tripli ha
messo in evidenza fenotipi aventi unicamente e in abbondanza sepali, tanto che per questi geni sono stati coniati nuovi termini SEPALLATA1, 2 e 3 (SEP1, SEP2, SEP3). Questi mutanti sono inoltre risultati morfologicamente molto simili ai mutanti doppi mancanti delle funzioni associate ai geni di classe A e B. Ulteriori informazioni sui geni AGL2-LIKE sono state ottenute da ricerche condotte in alcune monocotiledoni, come mais e riso appartenenti alla sottofamiglia delle Poaceae. Queste specie possiedono stami e carpelli, ma mancano di sepali e petali che sono sostituiti da lodicole, palee e lemma, a rivestimento degli organi riproduttivi. In queste specie i geni omologhi di AGL2 hanno evidenziato modelli di espressione notevolmente diversificati, che farebbero ritenere possibile una relativamente rapida diversificazione funzionale durante la speciazione delle graminacee. In mais sono stati individuati parecchi membri,denominati geni Zea mays MADS-box (ZMM). Ad esempio, ZMM6 è espresso in uno della coppia di primordi delle spighette e determina la formazione di spighette pedicellate anziché sessili, mentre ZMM8 è espresso nel fiore superiore si ogni spighetta e non in quello inferiore. In riso è stato clonato un gene omologo di ZMM8, denominato Oryza sativa MADS-box1 (OOSMADS1) che svolge un ruolo importante nella determinazione del meristema apicale durante lo sviluppo delle spighette. Alcune mutazioni missenso di questo gene producono fenotipi con palea e lemma fogliose, un ridotto numero di stami e un numero di pistilli superiore a quello tipico (Theissen, 2001; Blázquez et al., 2006).
Sulla base del fenotipo mutante, per i geni SEP era stata inizialmente proposta una nuova classe combinata A-B che tuttavia avrebbe reso il modello classico ABC non più soddisfacente. Così, in alternativa, venne proposta una nuova classe di geni, chiamata D, che però avrebbe creato confusione con la funzione D responsabile dell’identità dell’ovulo. Dal momento però che l’identificazione dei geni SEP ha fornito una funzione omeotica addizionale, recentemente Theissen (2001) ha suggerito
l’introduzione della funzione E, coniando un modello alternativo chiamato ABCDE o modello A-E (Fig. 7). oltre alle funzioni A, B, e C del modello classico, è prevista la funzione D che specifica gli ovuli, forse insieme alla funzione C, e la funzione E, che è invece richiesta per la formazione di petali, stami e carpelli, e forse anche ovuli (Blázquez et al., 2006).
Nel complesso, la specificazione dell’identità delle strutture fiorali in relazione alla combinazione dei prodotti dei diversi geni omeotici sembra rispondere a un modello cosiddetto a quartetti. Il modello prevede che quattro diverse combinazioni di quattro diverse proteine omeotiche possano determinare l’identità dei quattro organi fiorali: sepali, petali, stami e carpelli. In Arabidopsis, queste combinazioni sono basate sulla formazione di quattro distinti complessi proteici: i) sepali: AP1-AP1-SEP-SEP; ii) petali: AP1-AP3-PI-SEP; iii) stami: AP3-PI-AG-SEP; iv) carpelli: AG-AG-SEP-SEP. Assumendo che questi complessi proteici rappresentino fattori di trascrizione, potrebbero esercitare la loro funzione specificando il legame con i promotori di geni definiti che sarebbero pertanto attivati o repressi in modo appropriato per lo sviluppo dei singoli organi fiorali. In particolare, si ritiene che l’antagonismo tra le funzioni A e C possa essere controllato attraverso la repressione del gene AG o del gene AP1 da parte di complessi proteici che contengono i prodotti, rispettivamente, di AP1 o di AG.
E:
SEP1 – SEP2 – SEP3 – SEP4
D:
STK
– SHP1
– SHP2
C:
AG
A:
AP1 – AP2
B:
AP3 - PI
Ovuli Carpelli Stami Petali Sepali4b
4a
3
2
1
VERTICILLI ORGANI FIORALI FUNZIONI GENICHE QUARTETTI PROTEICIAP1 AP3 AP3
AP1 AP1
SEP
SEP SEP SEP SEP SEP
SEP SEP
A+E A+B+E B+C+E C+E D+E
PI PI
AG AG
AG STK
SHP
Fig. 7.
Lo studio dei geni omeotici fiorali rappresenta un settore di fondamentale importanza al fine comprendere la differenziazione sessuale nelle piante. Una delle maggiori difficoltà connesse alla comprensione dell’origine degli organi fiorali concerne la ricerca di omologia tra le angiosperme e gli ancestori putativi. Al momento non è affatto nota la serie di trasformazioni morfologiche che hanno portato all’origine e all’affermazione degli organi fiorali tipici: sepali, petali, stami e carpelli. Evidenze molecolari suggeriscono che l’ultimo ancestore comune alle felci ancora esistenti e alle fanerogame non possedeva ortologhi dei geni omeotici fiorali. Ciò indica che l’origine dei geni omeotici fiorali deve ricondursi al periodo in cui prese avvio la differenziazione delle angiosperme e delle gimnosperme, circa 300 milioni di anni fa. Ricostruzioni filogenetiche basate sui membri della famiglia genica del MADS-box delle angiosperme hanno evidenziato che nelle gimnosperme (ad esempio, nel genere Gnetum e in conifere come Picea abies e Pinus radiata) sono presenti gli ortologhi dei geni responsabili della funzione omeotica B. La questione logica che tale scoperta ha sollevato è connessa all’assenza di petali e stami in questo raggruppamento tassonomico. Tale scoperta ha permesso di ipotizzare che una funzione principale dei geni B potrebbe essere quella di determinare l’identità degli organi riproduttivi maschili, quando i geni B sono espressi, e l’identità degli organi riproduttivi femminili, quando i geni B non sono attivi. In sostanza, l’espressione differenziale dei geni B può rappresentare il meccanismo principale di determinazione del sesso nelle piante. Dal momento che sono stati evidenziati ortologhi funzionalmente conservati anche dei geni responsabili delle funzioni A e C, è verosimile ritenere che il sistema per la specificazione dell’identità degli organi riproduttivi fosse già presente nell’ancestore comune a tutte le fanerogame.
1.3. CONTROLLO GENETICO DELLO SVILUPPO FIORALE
I geni ABCDE determinano l’identità dell’organo, ma non determinano se gli organi si formeranno o meno ne controllano il loro numero. L’assunto che lo schema fiorale sia già fissato prima dell’espressione dei geni per l’identità fiorale è dimostrato da mutanti che hanno organi simili a foglie disposti come se fossero organi fiorali e che perciò rispettano lo schema di base dell’organizzazione fiorale.
L’individuazione e la caratterizzazione di una serie di mutanti di Arabidopsis ha così permesso di identificare molti dei geni coinvolti nella determinazione del numero di organi fiorali e nel loro sviluppo, tra cui CLAVATA1 (CLV1), ETTIN (ETT), FILAMENTOUS (FIL), MGOUN (MGO), PERIANTHIA (PAN), REVOLUTA (REV) e TOUSLED (TSL) (Clark et al., 1993; Roe et al., 1993; Okada e Shimura, 1994; Talbert et al., 1995; Session et al., 1997; Laufs et al., 1998; Chuang et al., 1999). In alcuni casi le modificazioni sono dovute a mutazioni a carico dei geni che controllano le dimensioni del meristema, modificando il numero di cellule indifferenziate della zona centrale dell’apice meristematico. Ad esempio, mutazioni del gene CLAVATA1, che inducono una dimensione maggiore del meristema, causano nel fiore la produzione soprannumeraria di carpelli (Clark et al., 1993; Crone e Lord, 1993). Un gene con funzione antagonista rispetto a CLV è SHOOTMERISTEMLESS (STM), un gene KNOTTED1-like di classe I, il cui prodotto è necessario per la formazione del meristema apicale e per il mantenimento della zona indifferenziata centrale (Barton e Poething, 1993; Clark et al., 1996). Doppi mutanti stm;clv1 formano meristemi che sono stocasticamente più grandi o più piccoli rispetto al normale, mostrando come STM non sia assolutamente indispensabile per la formazione del meristema, ma come la corretta attività di entrambi i geni sia necessaria per mantenere l’omeostasi tra le diverse
zone del meristema, condizione necessaria per assicurare la corretta dimensione del meristema e, di conseguenza, il corretto numero di organi da esso prodotto (Liljegren e Yanofsky, 1996; Meyerowitz, 1996). Mutazioni in questi geni influenzano sia il meristema vegetativo che riproduttivo, confermando la loro similarità strutturale.
E’ stato visto come l’identità fiorale del meristema sia determinata dai geni chiave LFY e AP1 di Arabidopsis e FLO e SQUA di Antirrhinum, e come questi inducano l’attivazione dei geni che determinano la specifica identità di ogni organo fiorale. In Arabidopsis sono stati individuati dei geni che hanno un ruolo specifico nella regolazione del numero di tali organi: PAN e SUPERMAN (SUP), i cui fenotipi mutanti presentano, rispettivamente, un aumento nel numero di sepali e petali e di stami (Bowman et al., 1992, Clark et al., 1993). In realtà solo PAN ha questa specifica funzione, agendo indipendentemente dall’attività dei geni a monte (che specificano l’identità fiorale del meristema) ed a valle (che determinano l’identità dei singoli organi), mentre SUP sembra agire confinando l’attività dei geni della classe B ai due verticilli interni. I fiori dei mutanti pan sono caratterizzati da un incremento del numero di organi nei primi due verticilli e da un decremento nel numero di organi del terzo verticillo. A differenza di CLV1 il gene PAN controlla in modo specifico il numero degli organi fiorali senza alterare il numero di cellule del meristema mediante una azione diretta sulla spaziatura delle cellule dei primordi (Chuang et al., 1999). Sempre in Arabidopsis, un altro gene FLORAL ORGAN NUMBER (FON) regola l’attività del meristema fiorale interferendo sul numero di organi (Huang e Ma, 1997). I mutanti fon sono analoghi al selvatico per quanto riguarda le caratteristiche vegetative e la loro peculiarità consiste in una prolungata attività del meristema fiorale, che risulta in una produzione continua di stami internamente al terzo verticillo ed in un numero incrementato di carpelli. L’osservazione dei doppi mutanti fon;clv1, che presentano un fenotipo caratterizzato da una produzione soprannumeraria di organi fiorali rispetto ai
mutanti singoli indica come FON e CLV1 regolino percorsi metabolici diversi. Altri test di allelismo dimostrano che FON non interagisce con TFL, AP1, AP2, o UFO, ma con SUP e sia positivamente controllato da LFY. Contrariamente a fon, la mutazione mgoun dà luogo ad un fenotipo caratterizzato, otre che da un ridotto numero di organi fiorali, anche da un minor numero di foglie. L’organizzazione del meristema in questi mutanti risulta normale ed analisi microscopiche hanno chiarito che la mutazione interessa direttamente la differenziazione dei primordi degli organi, sia fogliari che fiorali (Laufs et al, 1998).
Un altro mutante in cui si osservano alterazioni a carico degli organi fiorali che pur mantengono la loro identità è tousled (tsl) di Arabidopsis, che presenta una riduzione casuale di tutti gli organi fiorali, i quali risultano peraltro deformati ed inibiti nello sviluppo senza subire metamorfosi verso un organo diverso (Roe et al., 1993). Come in mgoun, la perdita della funzione del prodotto TSL si ripercuote anche sulle foglie prodotte in numero leggermente maggiore nel mutante, e caratterizzate da lievi alterazioni morfologiche. Nei mutanti tousled il momento della fioritura è peraltro ritardato, mentre la struttura dell’infiorescenza non sembra essere influenzata, sia per quanto riguarda il numero di fiori prodotti che la loro disposizione. Tali osservazioni dimostrano come TSL sia necessario durante lo sviluppo dei meristemi, sia vegetativi che riproduttivi, e dei rispettivi organi, pur non determinando la loro identità. E’ probabile che TSL abbia un ruolo nella determinazione dello schema di iniziazione degli organi fiorali e fogliari. E’ stato ipotizzato che TSL, che codifica per una chinasi, partecipi in eventi che determinino i siti di iniziazione dei primordi all’interno del meristema fiorale, assegnando il corretto numero di cellule alle regioni appropriate, oppure coordinando le divisioni cellulari (Roe et al., 1993).
Il mutante tso1 di Arabidopsis presenta uno sviluppo più abnorme rispetto a tsl delle strutture florali, che in questo caso sono addirittura limitate ad una proliferazione
callosa (Liu et al., 1997). In questo mutante il meristema fiorale è privo della organizzazione in tre strati ed i nuclei delle cellule sono irregolari per forma e dimensioni. Analisi microscopiche hanno evidenziato che difetti nella mitosi e nella citochinesi sono alla base di questo fenotipo.
Un altro gene che è ritenuto responsabile dell’architettura dell’inflorescenza e del fiore è FILAMENTOUS FLOWER (FIL), in quanto mutanti fil di Arabidopsis presentano notevoli anormalità nelle strutture dell’inflorescenza e nello sviluppo dei fiori (Komaki et al., 1998; Okada e Shimura, 1994). Gli effetti pleiotropici delle mutazioni fil a carico dell’inflorescenza sono rappresentati dalla frequente mancanza di ramificazioni terziarie e da un anticipo nel passaggio di fase. Il ruolo di FIL nella determinazione dell’entrata nella fase riproduttiva non sembra però fondamentale, in quanto mutazioni fil in combinazione con mutazioni che provocano un ritardo nella fioritura, quali ft e fwa, esprimono lo stesso fenotipo dei mutanti singoli ft e fwa (Sawa e al., 1999). E’ stato osservato che la mancanza di ramificazioni terziarie nell’infiorescenza è causata non da un blocco dello sviluppo del meristema ascellare ma da una sua completa assenza. Non è ancora noto se questi fenotipi siano controllati dallo stesso percorso genetico, ma è ritenuto probabile che FIL agisca separatamente su meccanismi distinti. L’alterazione delle strutture fiorali in mutanti fil è drastica e diversificata: i fiori di tali mutanti possono essere distinti in due tipi e, a seconda di quando sono formati, si possono distinguere tre fasi di sviluppo (Okada e Shimura, 1994). In una prima fase vengono prodotti fiori i cui organi sono aberranti in numero, forma e disposizione; in una seconda fase vengono prodotte delle strutture costituite solamente da un filamento portante talvolta un sepalo; in una terza fase vengono prodotte contemporaneamente le strutture fiorali del secondo tipo e del primo, che in questo caso presentano un decremento maggiore nel numero degli organi fiorali. Osservazioni microscopiche dei filamenti prodotti dai mutanti fil indicano come questi
