UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI GENOVA
Corso di Dottorato in Scienze Pediatriche
Curriculum Genetica
Correlazione struttura-funzione della proteina TMEM16A:
ruolo delle interazioni intra-dimero
Relatore: Prof. Luis J. V. Galietta
Candidato: Dr. Paolo Scudieri
RIASSUNTO
TMEM16A e TMEM16B sono proteine di membrana con funzione di canali del cloruro attivati da calcio. Attraverso la generazione di canali chimerici, e in particolare, sostituendo la regione carbossi-terminale di TMEM16A con la regione equivalente di TMEM16B, sono stati ottenuti dei canali dotati di una maggiore attività. Il progressivo accorciamento della regione chimerica ha permesso di restringere il “dominio attivante” a una corta sequenza di 14 aminoacidi localizzata vicino all’ultimo dominio transmembrana e ha generato proteine-canale TMEM16A dotate di un’attività molto alta anche a concentrazioni basse di calcio intracellulare.
Per chiarire il meccanismo molecolare alla base di questo effetto, sono stati eseguiti esperimenti basati sulla generazione di doppie chimere, Forster resonance Energy transfer e cross-linking intermolecolare. Inoltre, è stato generato un modello tridimensionale teorico di TMEM16A basato sulla struttura di una proteina TMEM16 del fungo Nectria haematococca. I risultati ottenuti indicano che l’aumentata attività nei canali chimerici è causata da un’alterazione dell’interazione tra il carbossi-terminale e la prima ansa intracellulare di TMEM16A.
L’identificazione di piccole molecole farmacologiche in grado di mimare questa perturbazione potrebbe rappresentare la base di un approccio farmacologico volto a stimolare il trasporto ionico TMEM16A-dipendente. L’attivazione farmacologica di TMEM16A potrebbe essere utile per stimolare la secrezione epiteliale nelle vie aeree, un effetto potenzialmente benefico in patologie quali la fibrosi cistica e altre malattie ostruttive croniche dell’apparato respiratorio.
INDICE
INTRODUZIONE pag. 4
SCOPO pag. 18
MATERIALI E METODI pag. 19
RISULTATI pag. 26
DISCUSSIONE pag. 42
INTRODUZIONE
Caratteristiche generali delle proteine TMEM16
Le proteine TMEM16, conosciute anche con il nome di anoctamine, sono una famiglia di proteine di membrana coinvolte in diverse funzioni fisiologiche.
Nel 2008, i primi due membri di questa famiglia, TMEM16A (ANO1) e TMEM16B (ANO2) sono stati identificati quali componenti fondamentali dei canali del cloruro attivati da calcio (Caputo et al., 2008; Schroeder et al., 2008; Yang et al., 2008). Si tratta di una classe di canali ionici coinvolti in importanti ruoli fisiologici, tra i quali la secrezione epiteliale, la trasduzione sensoriale, la nocicezione, il controllo dell’eccitabilità neuronale e la regolazione della contrattilità della muscolatura liscia (Caputo et al., 2008; Schroeder et al., 2008; Yang et al., 2008; Pedemonte e Galietta, 2014).
Successivamente, la proteina TMEM16F (ANO6) è stata associata all’attività di scramblasi, che consiste nella traslocazione di fosfatidilserina ed altri fosfolipidi dal lato interno al lato esterno della membrana plasmatica (Suzuki et al., 2010). Tale attività è coinvolta in vari processi biologici, quali l’aggregazione piastrinica, l’apoptosi e la fusione di membrane. La proteina TMEM16F, in particolari condizioni, agisce anche da canale attivato da calcio dotato di una scarsa selettività ionica (Scudieri et al., 2015; Yu et al., 2015). Oltre TMEM16F, anche una proteina TMEM16 di fungo è stata associata alla duplice funzione di canale ionico e scramblasi di lipidi (Malvezzi et al., 2013)
La funzione delle altre proteine TMEM16 è meno conosciuta, ma sembra che anche TMEM16C (ANO3), TMEM16D (ANO4), TMEM16E (ANO5), TMEM16G (ANO7) e TMEM16J (ANO9) siano coinvolte nella traslocazione di fosfolipidi di membrana (Suzuki et al., 2013; Griffin et al., 2016; Di Zanni et al., 2017).
Le proteine TMEM16 condividono una struttura simile che consiste di 10 domini transmembrana ed estremità amino- e carbossi-terminali citosoliche (Fig. 1A). Quest’organizzazione è stata confermata anche sulla base della struttura tridimensionale di una proteina TMEM16 del fungo Nectria haematococca, determinata mediante cristallografia a raggi X (Brunner et al., 2014).
Figura 1. Struttura e funzione della proteina TMEM16A. (A) La figura mostra la topologia putativa di TMEM16A, che consiste in 10 segmenti transmembrana ed estremità N- e C-terminali esposte all’ambiente intracellulare. Sono indicati alcuni domini funzionali. (B) Correnti di membrana generate in cellule esprimenti TMEM16A e stimolate dall’applicazione di potenziali di membrana tra +100 e –100 mV. Le correnti sono state registrate utilizzando due soluzioni intracellulari con diversa concentrazione di calcio, 7 nM e 300 nM.
Tutte le proteine TMEM16 sembrano essere regolate dai livelli di calcio citoplasmatico. TMEM16A si attiva quando il calcio raggiunge valori di concentrazione sub-micromolari (Caputo et al., 2008; Schroeder et al., 2008; Yang et al., 2008) (Fig. 1B). TMEM16B richiede, invece, livelli superiori a 1 micromolare (Pifferi et al., 2009). TMEM16F agisce da scramblasi di fosfolipidi a concentrazioni di calcio sub-micromolari, mentre l’attivazione di correnti di membrana avviene a concentrazioni di calcio superiori a 10 µM (Scudieri et al., 2015). Nonostante la diversa sensibilità, la calcio-dipendenza delle proteine TMEM16 sembra dipendere, almeno in parte, da un meccanismo comune che coinvolge il legame degli ioni calcio a specifici residui di acido glutammico e aspartico localizzati nei segmenti transmembrana 6, 7 e 8 e conservati in tutte le proteine TMEM16 (Yang et al., 2012; Yu et al., 2012; Malvezzi et al., 2013; Scudieri et al., 2013; Brunner et al., 2014) (Fig. 1A). Anche la calmodulina è stata implicata nella regolazione dell’attività di TMEM16A (Tian et al., 2011; Jung et al., 2013). Tuttavia, il suo ruolo è ancora poco chiaro, come dimostrano i risultati contrastanti riportati in letteratura (Yu et al., 2014a; Yu et al., 2014b).
Le proteine TMEM16 sono espresse in molti organi e tessuti. TMEM16A è presente prevalentemente nei tessuti epiteliali, dove riveste un ruolo importante nella secrezione anionica. TMEM16B, TMEM16C e TMEM16D sono espresse in cellule neuronali. TMEM16B è il canale del cloruro calcio-dipendente dei neuroni olfattivi e dei fotorecettori (Stephan et al., 2009; Stöhr et al., 2009). Invece, TMEM16C è coinvolto nella regolazione di un canale del potassio attivato da sodio nei neuroni sensoriali (Huang et al., 2013). La proteina TMEM16E è espressa selettivamente in tessuti muscolari e scheletrici. Mutazioni in TMEM16E causano, infatti, due malattie genetiche nell’uomo: una forma di distrofia muscolare dei cingoli e la displasia gnatodiafisaria (Bolduc et al., 2010; Tsutsumi et al., 2004). Le altre proteine TMEM16 mostrano un’espressione più diffusa. In particolare, TMEM16F e TMEM16K sono espresse in quasi tutti i tessuti (Schreiber et al., 2010).
Ruolo fisiologico di TMEM6A
La proteina-canale TMEM16A è particolarmente espressa in cellule epiteliali (Huang et al., 2009; Yang et al., 2008), dove riveste un ruolo importante nella secrezione transepiteliale di anioni. L’aumento dei livelli di calcio citosolico, determinato da agonisti fisiologici, determina l’apertura dei canali TMEM16A presenti nella membrana apicale. Tale evento crea una via conduttiva per la secrezione di cloruro e bicarbonato, che lasciano la cellula generando un gradiente elettrochimico che favorisce il parallelo trasporto di sodio e acqua. In accordo con questo modello, la proteina TMEM16A è stata rilevata sulla membrana apicale di molti tipi di cellule epiteliali (Scudieri et al., 2012; Huang et al., 2009; Huang et al., 2012; Perez-Cornejo et al., 2012; Romanenko et al., 2010). Tuttavia, la proteina TMEM16A è stata anche rilevata nella membrana basolaterale (He et al., 2010; Schreiber et al., 2014), una localizzazione che implicherebbe una differente funzione che rimane da chiarire.
È di particolare interesse fisio-patologico il ruolo di TMEM16A nelle cellule epiteliali delle vie aeree. TMEM16A è stato, infatti, trovato espresso in cellule epiteliali bronchiali umane trattate con interleuchina-4 (IL-4) sin dalla sua scoperta quale canale del cloruro attivato da calcio (Caputo et al., 2008). In seguito, altri studi ne hanno confermato l’espressione nelle cellule epiteliali delle vie aeree e il coinvolgimento nella secrezione anionica. In particolare, con la generazione di un modello murino privo di espressione di TMEM16A, è stato dimostrato che la perdita di funzione di TMEM16A causa una riduzione della secrezione transepiteliale e altera la clearance mucociliare nelle vie aeree (Ousingsawat et al., 2009; Rock et al., 2009). Inoltre, il modello murino privo di TMEM16A mostra anche una malformazione della trachea (Rock et al., 2008). Non è chiaro se questo difetto sia causato dalla mancata funzione di TMEM16A nell’epitelio o nel tessuto muscolare liscio delle vie aeree.
Le citochine IL-4 e IL-13 sono particolarmente coinvolte nella risposta immunologica di tipo Th2, caratteristica dell’asma bronchiale. Nell’epitelio delle vie aeree, le citochine Th2 promuovono la metaplasia mucosa, che consiste in un aumento del numero di cellule secernenti muco (goblet cells) e una parallela diminuzione del numero di cellule cigliate (Curran and Cohn, 2010; Park et al., 2007) (Fig. 2A).
Figura 2. Espressione e ruolo di TMEM16A nell’epitelio bronchiale. (A). Metaplasia mucosa indotta da citochine Th2 nell’epitelio delle vie aeree. IL-4 e IL-13 aumentano il numero di cellule secernenti muco (goblet cells) e diminuiscono le cellule cigliate. In queste condizioni si osserva un’aumentata espressione della proteina TMEM16A. (B) Aumentata espressione e funzione di TMEM16A in cellule trattate con citochine Th2. Il trattamento di cellule epiteliali bronchiali umane con IL-4 aumenta la secrezione di cloruro calcio-dipendente come dimostrato dalla maggiore ampiezza del picco di corrente di corto-circuito indotto dall’aggiunta di un agonista purinergico, UTP (pannello a sinistra). Il trattamento con IL-4 aumenta anche l’espressione della proteina TMEM16A, con una particolare co-localizzazione con la mucina MUC5AC, marcatore di goblet cells (pannello a destra). La figura mostra due immagini di microscopia confocale che mostrano la rivelazione mediante immunofluorescenza di TMEM16A (verde), MUC5AC (rosso) e tubulina acetilata (magenta, marcatore delle ciglia), in cellule trattate (in alto) e non (in basso) con IL-4.
L’induzione dell’espressione di TMEM16A da citochine Th2 (Caputo et al., 2008) suggerisce una relazione con la secrezione di muco. Infatti, due lavori indipendenti hanno rivelato che la proteina TMEM16A è particolarmente espressa nelle cellule secernenti muco (Huang et al., 2012; Scudieri et al., 2012) (Fig. 2B). Quest’osservazione è stata effettuata su cellule bronchiali coltivate in vitro e trattate con IL-4 (Fig. 2B), in topi allergizzati sperimentalmente tramite la somministrazione di ovalbumina, e in pazienti asmatici. Inoltre, è stata descritta una riduzione del rilascio di muco in seguito a inibizione farmacologica di TMEM16A (Huang et al., 2012). Queste scoperte suggeriscono che TMEM16A possa rappresentare un bersaglio per il trattamento di patologie delle vie respiratorie caratterizzate da aumentata secrezione mucosa.
La localizzazione della proteina TMEM16A nelle cellule secernenti muco suggerisce un suo ruolo nell’ipersecrezione di mucine che caratterizza le vie aeree nell’asma bronchiale. A tal riguardo, diversi studi hanno evidenziato come la secrezione di anioni, e in particolare di bicarbonato, sia richiesta per supportare il rilascio e l’espansione delle mucine dalla superficie delle cellule secernenti e dalle ghiandole della sottomucosa (Garcia et al., 2009; Gustafsson et al., 2012; Hoegger et al., 2014). Data la permeabilità di TMEM16A al bicarbonato, la sua induzione causata da citochine Th2 può rappresentare un meccanismo compensatorio per aumentare la secrezione anionica parallelamente all’aumento del rilascio di muco.
Nell’epitelio delle vie aeree è espressa anche la proteina CFTR, un tipo di canale del cloruro regolato da fosforilazione AMPc-dipendente, che svolge un ruolo di fondamentale importanza nei meccanismi di difesa innata (Riordan 2008). Nei pazienti con fibrosi cistica, la perdita di funzione di CFTR nelle vie aeree causa l’alterazione della clearance mucociliare, l’accumulo di muco denso e la riduzione dell’attività battericida (Hoegger et al., 2014; Matsui et al., 1998; Pezzulo et al., 2012). Si può ipotizzare che TMEM16A e CFTR abbiano un ruolo affine o complementare nel sistema respiratorio. Tuttavia, ad oggi non è ancora noto se TMEM16A abbia effettivamente un ruolo nella fibrosi cistica. La presenza di una grave malattia respiratoria nei pazienti con fibrosi cistica potrebbe indicare che TMEM16A non possa compensare la mancata funzionalità di CFTR. Tuttavia, la grande eterogeneità che caratterizza il fenotipo respiratorio osservato anche nei pazienti portatori di mutazioni simili di CFTR indica che altri geni, agendo da geni modificatori, possano essere coinvolti. Si può ipotizzare che differenze
nell’espressione e/o funzione di TMEM16A in pazienti con fibrosi cistica possa modulare la gravità della malattia. Infatti, la maggiore secrezione anionica calcio-dipendente, presente nelle vie aeree murine e attribuibile a TMEM16A, potrebbe essere uno dei possibili motivi per cui i topi con fibrosi cistica non mostrano alcuna malattia respiratoria (Grubb et al., 1994). Sarebbe interessante verificare se nel topo la perdita di funzione di TMEM16A determina una condizione patologica simile a quella della fibrosi cistica nell’uomo. Tuttavia, i topi knockout per TMEM16A mostrano un fenotipo molto grave, con morte precoce, che preclude lo studio delle vie respiratorie in animali adulti (Ousingsawat et al., 2009; Rock et al., 2009). Maggiori informazioni si potrebbero ottenere attraverso la generazione di un modello murino con deficit di TMEM16A limitato all’epitelio respiratorio. Tale modello animale potrebbe essere molto importante per lo sviluppo di strategie terapeutiche aventi TMEM16A quale bersaglio. In effetti, non è ancora stato chiarito se sia l’inibizione o l’attivazione di TMEM16A ad essere utile per il trattamento dei pazienti con fibrosi cistica o altre patologie respiratorie croniche, come l’asma bronchiale. Da una parte, la stimolazione della funzione di TMEM16A è teoricamente utile per garantire una maggiore idratazione della superficie delle vie aeree e per supportare la clearance mucociliare. Dall’altra parte, l’inibizione di TMEM16A si è dimostrata in grado di ridurre il rilascio di mucine (Huang et al., 2012), un effetto che potrebbe prevenire l’accumulo di muco nel lume delle vie aeree.
In aggiunta alle cellule epiteliali dell’epitelio respiratorio, anche le ghiandole della tonaca sottomucosa mostrano l’espressione della proteina TMEM16A, più abbondante nelle cellule mucose che nelle cellule sierose (Fischer et al., 2010; Lee and Foskett, 2010; Caci et al., 2015). Anche quest’osservazione evidenzia la relazione tra la secrezione di anioni dipendente da TMEM16A e la secrezione di muco.
TMEM16A è presente anche in diversi tipi cellulari del sistema gastro-intestinale. Nelle ghiandole salivari, la proteina TMEM16A è molto espressa ed è responsabile della secrezione salivare. Il silenziamento di TMEM16A nei topi mediante iniezione di siRNA in vivo causa una forte riduzione della secrezione di fluido salivare (Yang et al., 2008). Inoltre, le ghiandole salivari dei topi knockout
per TMEM16A non mostrano né correnti del cloruro calcio-dipendenti, né secrezione di cloruro indotta da carbacolo (Romanenko et al., 2010).
La proteina TMEM16A è espressa anche nelle cellule epiteliali biliari di uomini, topi e ratti (Dutta et al., 2011; Dutta et al., 2013). La sua attività di canale media la secrezione calcio-dipendente di cloruro e fluido stimolata da agonisti purinergici. Questa funzione contribuisce alla determinazione del volume e della composizione della bile. Inoltre, il trattamento di cellule epiteliali biliari con IL-4 aumenta l’espressione e la funzione di TMEM16A (Dutta et al., 2011), indicando che l’induzione da citochine Th2 non è un evento ristretto all’epitelio respiratorio, bensì un fenomeno più generale.
Il ruolo fisiologico di TMEM16A nell’epitelio intestinale sembra diverso da quello descritto per gli altri organi. Infatti, due studi hanno trovato evidenze della localizzazione di TMEM16A nella membrana basolaterale e non apicale (He et al., 2011; Schreiber et al., 2014). Tuttavia, i due studi arrivano a conclusioni diverse circa il contributo di TMEM6A alla secrezione di cloruro. In uno studio, l’uso di un inibitore di TMEM16A, CaCCinh-A01, ha provocato l’aumento della secrezione di cloruro (He et al., 2011). Gli autori concludono che l’apertura dei canali TMEM16A presenti nella membrana basolaterale favorisce la secrezione di potassio e limita la secrezione di cloruro. Questo meccanismo spiegherebbe l’effetto apparentemente paradossale dell’inibitore. Nell’altro lavoro, il contributo di TMEM16A al trasporto ionico intestinale è stato studiato attraverso la generazione di un topo knockout condizionale, caratterizzato dal deficit di TMEM16A limitato alle cellule epiteliali intestinali (Schreiber et al., 2014). La secrezione calcio-dipendente di cloruro è risultata diminuita in maniera significativa nell’intestino di questi animali, un effetto causato dalla riduzione della mobilizzazione di calcio indotta da agonisti purinergici (Schreiber et al., 2014). Pertanto, sulla base di questi risultati, la proteina TMEM16A supporterebbe la secrezione di cloruro non attraverso la creazione una via conduttiva nella membrana apicale ma favorendo l’aumento di calcio citosolico necessario all’attivazione dei canali basolaterali del potassio (Schreiber et al., 2014). L’associazione tra la proteina TMEM16A e l’aumento di calcio non viene chiarita, ma gli autori ipotizzano un suo possibile ruolo nel rilascio di calcio dal reticolo endoplasmatico.
La proteina TMEM16A è probabilmente espressa anche nel pancreas esocrino. Quest’assunzione si basa sulla forte espressione che TMEM16A mostra in numerose linee cellulari derivanti dai dotti pancreatici, come CFPAC-1, AsPC-1, BxPC-3 e Capan-1 (Caputo et al., 2008; Wang et al., 2013; Sauter et al., 2015). Nel dotto pancreatico, TMEM16A può garantire una via per la regolazione della secrezione calcio-dipendente di bicarbonato. Tuttavia, le linee cellulari usate in questi studi derivano da tumori del pancreas esocrino e, quindi, non è chiaro se l’elevata espressione di TMEM16A possa essere dovuta, almeno in parte, alla trasformazione neoplastica. Infatti, l’espressione di TMEM16A è stata collegata anche al cancro, dato che sembra avere un ruolo nella regolazione della proliferazione e/o migrazione cellulare (Britschgi et al., 2013; Qu et al., 2014; Sauter et al., 2015).
La proteina TMEM16A è espressa anche in tessuti non epiteliali, quali il muscolo liscio, le cellule interstiziali di Cajal e alcuni neuroni sensoriali.
Per quanto riguarda il muscolo liscio, l’espressione della proteina TMEM16A è stata rilevata nelle vie aeree, nell’apparato riproduttivo e nei vasi sanguigni (Huang et al., 2009; Davis et al., 2010; Manoury et al., 2010; Sones et al., 2010). L’espressione e la funzione di TMEM16A in queste sedi è alterata in condizioni patologiche.
In uno studio, l’aumentata espressione e funzione di TMEM16A è stata associata all’iper-reattività delle cellule muscolari lisce delle vie aeree in condizioni simil-asmatiche (Zhang et al., 2013). Topi sensibilizzati con ovalbumina per indurre uno stato infiammatorio cronico a livello bronchiale, mostravano un aumento della contrattilità della muscolatura liscia associata a un’aumentata espressione di TMEM16A. Lo stesso studio ha evidenziato un difetto di contrattilità in cellule muscolari lisce delle vie aeree isolate da topi knockout per TMEM16A (Zhang et al., 2013). Questi risultati suggeriscono, quindi, che TMEM16A possa rappresentare un bersaglio farmacologico per prevenire la broncocostrizione in pazienti asmatici.
Anche l’ipossia cronica e l’ipertensione polmonare si associano all’aumento dell’espressione e della funzione di TMEM16A, come dimostrato nelle cellule muscolari lisce isolate dall’arteria polmonare di ratti esposti a bassi livelli di ossigeno (Sun et al., 2012) o trattati con monocrotalina (Forrest et al., 2012).
Nel sistema gastro-intestinale, la contrazione della muscolatura liscia è controllata dall’attività elettrica delle cellule interstiziali di Cajal, che si trovano interposte tra le terminazioni dei neuroni enterici e le cellule muscolari lisce (Huizinga et al., 2001). Un’analisi del profilo di espressione genica mediante microarray aveva rivelato che TMEM16A è un gene fortemente espresso in queste cellule ancora prima della scoperta della sua funzione quale canale del cloruro attivato da calcio (Chen et al., 2007). La proteina TMEM16A è considerata un utile marcatore delle cellule interstiziali di Cajal e anche dei tumori stromali gastrointestinali (GIST), che da esse derivano (Gomez-Pinilla et al., 2009). L’elevata espressione di TMEM16A suggerisce un suo ruolo nella regolazione dell’attività elettrica delle cellule interstiziali di Cajal. Infatti, la depolarizzazione lenta e spontanea di queste cellule è prodotta proprio dalla secrezione di cloruro mediata dalla proteina-canale TMEM16A (Zhu et al., 2009). Il ruolo di TMEM16A in queste cellule è stato dimostrato anche mediante studi in topi knockout. Gli animali privi di TMEM16A mostrano, infatti, una notevole riduzione dell’attività elettrica e della contrattilità nell’intestino e nello stomaco (Huang et al., 2009; Hwang et al., 2009). Queste osservazioni dimostrano l’importanza della proteina TMEM16A nella regolazione della peristalsi del sistema gastrointestinale e suggeriscono che alterazioni dell’espressione e/o funzione della proteina TMEM16A possano essere una caratteristica di malattie caratterizzate da disordini della motilità gastrointestinale. Infatti, nello stomaco di pazienti diabetici con gastroparesi è stata descritta la presenza di varianti di TMEM16A, con un dominio N-terminale più corto, che producono canali con funzionalità alterata (Mazzone et al., 2011).
La proteina TMEM16A è espressa anche in specifici neuroni sensoriali dei gangli dorsali, dove riveste un ruolo nella nocicezione (Liu et al., 2010). L’attivazione di TMEM16A in queste cellule neuronali causa l’efflusso di cloruro con conseguente depolarizzazione e scarica di potenziali di azione.
Relazione struttura – funzione di TMEM16A
La proteina TMEM16A è un canale ionico selettivo per gli anioni, attivato dal calcio citosolico e dotato di una voltaggio-dipendenza peculiare. Per concentrazioni intracellulari di calcio di 0.1 – 1.0 µM e ad un potenziale di membrana di riposo (-60 mV), il canale si trova in uno stato di parziale attivazione. Spostamenti del potenziale di membrana a valori più positivi o più negativi determinano, rispettivamente, attivazione o inattivazione del canale (Fig. 1B). La relazione corrente-voltaggio risultante allo stato stazionario è pertanto fortemente rettificante. Per concentrazioni di calcio intracellulare maggiori di 1 µM si ha uno spostamento della voltaggio-dipendenza dell’attivazione verso valori negativi di potenziale. Di conseguenza i canali divengono pienamente attivi a tutti i potenziali e la relazione tensione-corrente diventa lineare. La rettificazione a basse concentrazioni di calcio intracellulare può essere spiegata dalla voltaggio-dipendenza dell’affinità per il calcio (Yang et al., 2008). Questa proprietà può essere attribuita a riarrangiamenti conformazionali dei siti di legame per il calcio, che sono indotti da potenziali positivi, e che favoriscono l’interazione con gli ioni calcio, portando a un aumento della probabilità di apertura del canale.
I meccanismi molecolari che stanno alla base della calcio- e voltaggio-dipendenza dell’attivazione di questo canale sono poco conosciuti.
Alcune informazioni su possibili domini regolatori sono state ottenute dallo studio delle diverse varianti di TMEM16A. Infatti, attraverso lo splicing alternativo del trascritto primario di TMEM16A e/o l’attivazione di un promotore alternativo è possibile la generazione di varie isoforme. Nel lavoro di Caputo et al. (2008) è stata descritta l’esistenza di un’isoforma minima, denominata TMEM16A(0), formata da 840 aminoacidi e contenente tutti i domini transmembrana; questa può essere espansa attraverso l’inclusione di quattro regioni denominate segmenti a, b, c, d, rispettivamente di 116, 22, 4 e 26 aminoacidi. Il segmento a è aggiunto all’N-terminale, il b prima del primo dominio transmembrana, il c e il d nella prima ansa intracellulare, tra il secondo e il terzo dominio transmembrana. L’esclusione del segmento a dipende dall’attivazione di un promotore alternativo. In questo caso, la sequenza corrispondente ai primi 36 codoni è sostituita da una sequenza priva di un ATG. Inizialmente si era ipotizzato che la traduzione potesse partire dal successivo ATG disponibile, in posizione 117,
portando così all’esclusione dell’intero segmento a (Caputo et al., 2008). Tuttavia, è stata successivamente dimostrata la presenza di codoni non canonici di inizio della traduzione, probabilmente CTG, risultante nell’inclusione di una buona parte del segmento a anche in assenza del primo codone (Sondo et al., 2014).
L’espressione delle diverse isoforme è tessuto dipendente (Ferrera et al., 2009; Mazzone et al., 2011). L’esone 13, codificante per il segmento c, è presente nella maggioranza dei trascritti; invece, gli esoni 6b e 15, codificanti rispettivamente per i segmenti b e c, presentano una varietà di situazioni di splicing alternativo. Ad esempio, in alcuni tessuti è stata riportata una preferenziale inclusione dell’esone 6b che sembra essere associata all’esclusione dell’esone 15, e viceversa (Ferrera et al., 2009). In un altro studio, è stata osservata un’espressione alterata delle isoforme di TMEM16A nello stomaco di pazienti diabetici affetti da gastroparesi (Mazzone et al., 2011). Questi pazienti mostravano un’aumentata presenza di trascritti codificanti per una proteina TMEM16A dotata di un dominio N-terminale più corto. La complessità delle possibili isoforme alternative di TMEM16A è aumentata con le osservazioni riportate nel lavoro di O’Driscoll e colleghi (2011), i quali hanno descritto l’esistenza di trascritti privi dell’esone 10 o dell’esone 14. L’esclusione dell’esone 10, comportando la delezione di 45 aminoacidi contenenti la sequenza corrispondente al primo dominio transmembrana, produce una variante di TMEM16A dotata di una topologia alterata e quindi probabilmente priva di attività funzionale. L’assenza dell’esone 14 porta, invece, alla delezione di un segmento di 24 aminoacidi nella prima ansa intracellulare della proteina, eliminando un possibile sito di fosforilazione da proteina chinasi C (O’Driscol et al., 2011).
La generazione di diverse isoforme della proteina TMEM16A ha delle implicazioni funzionali. Per esempio, l’inclusione dell’esone 6b, codificante per il segmento b, produce canali del cloruro dotati di una minore sensibilità al calcio citosolico. Il meccanismo molecolare alla base di questo effetto non è noto. Tuttavia, esperimenti futuri dovranno tenere in considerazione l’elevata presenza nel segmento b di residui basici (8 arginine/lisine su 22 aminoacidi), di possibili siti di fosfolirazione e di un dominio non canonico di legame alla calmodulina. L’esclusione del segmento c, un evento che sembra raro nei tessuni umani (Ferrera et al., 2009) genera canali con un’alterata sensibilità sia al calcio citosolico che al potenziale di membrana (Ferrera et al., 2009; Xiao et al., 2011). Un’altra isoforma
di TMEM16A deriva dalla contemporanea esclusione dei segmenti a, b, c e d. Tale isoforma, denominata TMEM16A(0) ed espressa soprattutto nei testicoli (Sondo et al., 2014), è caratterizzata da un’alterazione della voltaggio-dipendenza e della selettività ionica (Ferrera et al., 2011).
Ad oggi, non è stato chiarito il ruolo delle altre regioni alternative nella proteina TMEM16A (O’Driscol et al., 2011). Comunque, si può ipotizzare che l’espressione di diverse isoforme di TMEM16A, anche all’interno della stessa cellula con conseguente formazione di etero-oligomeri, aumenti enormemente la complessità a livello molecolare dei canali attivati da calcio. Tale varietà di canali può avere diversi meccanismi regolatori, proprietà biofisiche e localizzazione subcellulare.
La generazione di diverse isoforme tramite il meccanismo dello splicing alternativo sembra essere un processo comune all’interno della famiglia TMEM16. Infatti, anche per le proteine TMEM16B e TMEM16F sono state descritte varie isoforme che si distinguono dal punto di vista strutturale e funzionale (Stephan et al., 2009; Scudieri et al., 2015).
Altre nozioni interessanti sulla relazione struttura-funzione della proteina-canale TMEM16A sono state ricavate dal confronto con TMEM16B.
Dal punto di vista funzionale, TMEM16A e TMEM16B sono entrambi regolati dal calcio citosolico e dal potenziale di membrana, ma presentano caratteristiche diverse. TMEM16B ha una sensibilità al calcio 10 volte inferiore rispetto a TMEM16A. Infatti, mentre i canali TMEM16A si attivano a concentrazioni citoplasmatiche di calcio sub-micromolari (tipicamente tra 100 e 600 nM), i canali TMEM16B richiedono concentrazioni di calcio micromolari (1-6 µM). Inoltre, le correnti di membrana generate dai canali TMEM16B sono caratterizzate da cinetiche di attivazione e inattivazione molto più veloci rispetto a quelle dei canali TMEM16A (Pifferi et al., 2009; Scudieri et al., 2013).
Dal punto di vista strutturale, TMEM16A e TMEM16B condividono la stessa topologia e presentano un’omologia di sequenza aminoacidica relativamente alta, circa il 60% nella specie umana. Le due proteine hanno in comune regioni molto simili soprattutto nei domini transmembrana, compresi i segmenti 6, 7 e 8 che contengono i residui di acido glutammico e aspartico identificati quali maggiori determinanti della sensibilità al calcio delle proteine TMEM16 (Fig. 1A). La
sostituzione di tali residui in TMEM16A e TMEM16B, così come in TMEM16F e in proteine TMEM16 di fungo, determina una marcata riduzione dell’affinità per il calcio (Yang et al., 2012; Yu et al., 2012; Malvezzi et al., 2013; Scudieri et al., 2013; Brunner et al., 2014). Altre regioni presentano sequenze aminoacidiche maggiormente divergenti e, quindi, potrebbero essere responsabili delle diverse proprietà biofisiche dei due canali.
Al fine di identificare tali regioni, in un lavoro precedente, abbiamo generato delle proteine-canale chimeriche in cui domini di TMEM16A erano sostituiti con regioni equivalenti di TMEM16B (Scudieri et al., 2013). Questi esperimenti hanno individuato la regione compresa tra il sesto e l’ottavo dominio transmembrana quale responsabile della diversa sensibilità al calcio di TMEM16A e TMEM16B, suggerendo che oltre ai residui di acido glutammico e aspartico già noti, altri aminoacidi presenti in questa regione possano modulare il legame al calcio (Scudieri et al., 2013). La parte più carbossi-terminale di TMEM16A, comprendente anche i domini transmembrana 9 e 10, è risultata, invece, implicata nella regolazione dell’apertura e chiusura del canale.
Sorprendentemente, la sostituzione dell’intera regione C-terminale, localizzata a valle dell’ultimo segmento transmembrana, ha conferito un’attività costitutiva al canale chimerico. Più precisamente, ampie correnti di membrana comparivano anche a concentrazioni intracellulari di calcio molto basse, alle quali la proteina TMEM16A selvatica è totalmente inattiva. È importante ricordare che la rimozione della regione C-terminale di TMEM16A non produce lo stesso effetto (Ferrera et al., 2011) e che l’attività costitutiva non rappresenta l’acquisizione di una caratteristica di TMEM16B, dato che questo canale mostra una sensibilità al calcio più bassa di quella di TMEM16A. Pertanto, queste osservazioni suggeriscono che la regione C-terminale chimerica generi una perturbazione della struttura di TMEM6A che facilita l’attivazione del canale.
SCOPO DEL LAVORO
Nel presente studio abbiamo cercato di chiarire i meccanismi molecolari che regolano l’attivazione della proteina-canale TMEM16A. In particolare, abbiamo analizzato in dettaglio la regione C-terminale di una proteina TMEM16A chimerica dotata di attività costitutiva al fine di identificare la precisa localizzazione del “dominio attivante” e le possibili interazioni di questo dominio con altre regioni di TMEM16A.
MATERIALI E METODI
Colture cellulari e trasfezioni
Le cellule HEK-293 e HEK-293 MSR (Life Technologies), coltivate in terreno DMEM/F12 1:1 complementato con 10% di siero bovino fetale, L-glutammina 2 mM, penicillina 100 U/ml, streptomicina 100 µg/ml, sono state utilizzate per trasfezioni transienti con i plasmidi pcDNA 3.1 (Invitrogen) contenenti le sequenze codificanti per le forme selvatica e mutate di TMEM16A.
Per il saggio basato sulla proteina fluorescente gialla sensibile agli alogenuri (HS-YFP) (Caputo et al., 2008), le cellule HEK-293 MSR sono state seminate in micropiastre da 96 pozzetti ad una densità di 25.000 cellule per pozzetto in 150 µl di terreno DMEM/F12 privo di antibiotici. Dopo 24 ore, è stata effettuata la co-trasfezione con plasmidi contenenti la sequenza codificante per TMEM16A (selvatica o mutata) e per HS-YFP. Per ciascun pozzetto, 0.2 µg di DNA plasmidico totale e 0.5 µl di Lipofectamina 2000 (Invitrogen) sono stati prima miscelati in 50 µl di terreno Opti-MEM (Invitrogen) per formare i complessi di trasfezione (60 minuti a temperatura ambiente) e poi aggiunti alle cellule. Dopo 24 ore è stato cambiato il terreno per rimuovere i complessi, mentre il saggio funzionale è stato effettuato dopo ulteriori 24 ore.
Per gli esperimenti di patch clamp, le trasfezioni sono state eseguite su cellule HEK-293 in sospensione. È stata prima ottenuta la formazione dei complessi DNA-lipofectamina ponendo 2 µg di DNA plasmidico e 5 µl di Lipofectamina 2000 in 500 µl di terreno Opti-MEM. Dopo 1 ora i complessi sono stati aggiunti a 2 ml di terreno DMEM/F12 privo di antibiotici contenente 500.000 cellule; quindi, con una pipetta Pasteur sono state depositate 5 o 6 gocce della sospensione su piastre Petri e dopo 6 ore è stato aggiunto il terreno. Il giorno seguente il terreno è stato cambiato per rimuovere i complessi e dopo altre 24 ore sono stati effettuati gli esperimenti di patch clamp.
Le cellule FRT (Fisher rat tyroid), coltivate in terreno Coon’s F12 complementato con 10% di siero bovino fetale, L-glutammina 2 mM, penicillina 100 U/ml, streptomicina 100 µg/ml, sono state utilizzate per generare cloni cellulari con espressione stabile di TMEM16A o C-TERM4. A tale scopo, le cellule FRT sono state seminate su piastre da 6 pozzetti (300.000 cellule per pozzetto). Dopo 24
ore, le cellule sono state trasfettate con i plasmidi contenenti la sequenza codificante per TMEM16A o C-TERM4 (2 µg di DNA plasmidico e 5 µl di lipofectamina per pozzetto). Dopo altre 24 ore, le cellule trasfettate sono state selezionate per 3-4 giorni con 1 mg/ml di G418 nel terreno di coltura. Dopo questa fase iniziale, le cellule sono state staccate con l’utilizzo di tripsina e piastrate in micropiastre da 96 pozzetti alla densità approssimativa di una cellula per pozzetto. La selezione con G418 è proseguita per ulteriori 2-3 settimane fino all’identificazione di colonie cellulari derivanti da singola cellula. I cloni sono stati staccati ed espansi. I cloni esprimenti TMEM16A, forma selvatica e forma mutata, sono stati identificati mediante immunofluorescenza (Scudieri et al., 2012).
Saggio basato su HS-YFP
Le cellule HEK-293 MSR trasfettate con i diversi costrutti di TMEM16A sono state lavate due volte con 200 µl di PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8.1 mM Na2HPO4, 1.5 mM KH2PO4, 1 mM CaCl2, and 0.5 mM MgCl2) e quindi incubate con 60 µl di PBS per 30 minuti. Dopo l’incubazione, la piastra da 96 pozzetti è stata trasferita in un lettore di micropiastre (FluoStar Galaxy; BMG Labtech) equipaggiato con filtri opportuni per la rilevazione della fluorescenza della EYFP (eccitazione: 500 ± 10 nm; emissione: 535 ± 15 nm). Per ciascun pozzetto, la fluorescenza è stata misurata in continuo per 2 secondi prima e 12 secondi dopo l’iniezione di 165 µl di una soluzione PBS modificata contenente 137 mM di KI invece di NaCl (per una concentrazione finale di ioduro per ciascun pozzetto di 100 mM). Dove indicato, questa soluzione conteneva anche ionomicina (1 µM) per provocare un aumento del calcio citoplasmatico. Dopo la sottrazione del background, le registrazioni della fluorescenza sono state normalizzate per il valore iniziale misurato prima dell’aggiunta di I- in ciascun pozzetto. Il decadimento del segnale causato dallo spegnimento della fluorescenza della HS-YFP è stato quindi interpolato con una funzione esponenziale doppia per ricavare il tasso massimo di spegnimento della fluorescenza (quenching rate, QR) che corrisponde all’iniziale influsso di I- nelle cellule.
Esperimenti di patch clamp
La tecnica del patch clamp è stata utilizzata per studiare le caratteristiche funzionali delle forme selvatica e mutate della proteina-canale TMEM16A.
Tali esperimenti sono stati eseguiti in configurazione di whole-cell utilizzando cellule HEK-293 e FRT transfettate, rispettivamente, in transiente e stabilmente. La soluzione extracellulare utilizzata conteneva NaCl 150 mM, CaCl2 1 mM, MgCl2 1 mM, glucosio 10 mM, mannitolo 10 mM, Na-HEPES 10 mM, pH = 7.4. La soluzione intracellulare, contenuta nella pipetta, era costituita invece da CsCl 130 mM, EGTA 10 mM, MgCl2 1 mM, HEPES 10 mM, ATP 1 mM (pH = 7.35) più diverse quantità di CaCl2 per ottenere diverse concentrazioni di calcio libero (indicate nelle parentesi e calcolate con il programma Ca/Mg/ATP/EGTA Calculator v2.2b disponibile sul sito web http:// www.stanford.edu/~cpatton/maxc.html): 1 mM (7 nM), 5 mM (61 nM), 6 mM (92 nM), 8 mM (245 nM), 9 mM (551 nM), 9.5 mM (1.1 µM), 9.71 mM (2 µM).
Le micropipette sono state prodotte da sottili capillari di vetro borosilicato tirati a caldo con un puller (PC-10, Narishige) e forgiati al calore per ottenere una resistenza finale di 1-2 MΩ. Il protocollo di stimolazione, generato con il programma PULSE, era costituito da una serie di impulsi di voltaggio, della durata di 600 ms ciascuno con un intervallo di separazione tra un impulso e l’altro di 4 s. Ogni treno di impulsi partiva da un valore di –100 mV per arrivare a +100 mV con incrementi di 20 mV. Il potenziale di riposo era fissato a –60 mV. Le correnti sono state registrate tramite un amplificatore EPC7, quindi filtrate a 1 KHz e digitalizzate a 5 KHz con convertitore AD/DA ITC-16 (Instrutech). I dati sono stati analizzati con il programma Igor (Wavemetrics) opportunamente programmato (Dott. Oscar Moran, ICB, CNR) e presentati come tracce rappresentative e medie ± sem.
Generazione dei costrutti chimerici e mutanti
La sequenza codificante la forma selvatica della proteina TMEM16A è stata clonata in plasmide pcDNA3.1 come descritto in lavori precedenti (Caputo et al., 2008).
Per generare i costrutti chimerici è stata utilizzata una strategia basata su sintesi genica (GeneCust – Dudelange, Lussemburgo). A tale scopo, è stato introdotto un sito di restrizione BspEI mediante mutagenesi di un singolo nucleotide in posizione 1097 della sequenza codificante TMEM16A(abc). Questa mutazione non cambia la sequenza aminoacidica, l’espressione e l’attività come mostrato da diversi esperimenti (Scudieri et al., 2013). Utilizzando il sito BspEI, un sito EcoRI endogeno localizzato in posizione 1836, e i siti KpnI e XhoI fiancheggianti il sito di clonaggio, è possibile dividere la sequenza codificante TMEM16A in tre parti di lunghezza approssimativamente simile. Pertanto, ogni costrutto chimerico è stato generato progettando la sintesi di un frammento di DNA fiancheggiato da una coppia di siti di restrizione e contenente la combinazione desiderata di sequenze appartenenti a TMEM16A e TMEM16B. Questo frammento è stato poi tagliato e incollato nella sequenza di TMEM16A utilizzando siti di restrizione appropriati.
Gli altri costrutti sono stati generati mediante mutagenesi sito-specifica con il kit QuickChange XL (Stratagene). Per i costrutti tronchi, un codone di stop è stato introdotto in diverse posizioni di C-TERM1: 945 per generare C-TERM3, 932 per TERM4, 928 per TERM5, 923 per TERM6. I costrutti TERM7 e C-TERM8 sono stati, invece, generati mediante l’introduzione, rispettivamente, di una e due mutazioni missenso nel costrutto C-TERM5.
Tutti i plasmidi generati sono stati controllati mediante sequenziamento con metodo Sanger.
La seguente tabella 1 riporta le posizioni degli aminoacidi sostituiti nei costrutti chimerici e tronchi.
Tabella 1
CHIMERE
REGIONI DI TMEM16A SOSTITUITE DA DOMINI EQUIVALENTI DI TMEM16B
(aa) C-TERM 900 – 982 C-TERM 1 907 – 944 C-TERM 2 945 – 982 C-TERM 3 907 – 944 (945X) C-TERM 4 907 – 931 (932X) C-TERM 5 907 – 926 (928X) C-TERM 6 907 – 922 (923X) C-TERM 7 913 – 926 (928X) C-TERM 8 917 – 926 (928X) CHIMERE DOPPIE
N-TERM + C-TERM 1 1 – 341 and 907 – 944 TMD1-2 + C-TERM 1 347 – 380, 429 – 450 and 907 – 944 TMD3-4 + C-TERM 1 511 – 543, 556 – 583 and 907 – 944 TMD9-10 + C-TERM 1 779 – 816 and 879 – 944
LOOP1 + C-TERM 1 450 – 511 and 907 – 944
Misurazione delle correnti transepiteliali
Le cellule FRT con espressione stabile di TMEM16A selvatica o C-TERM4 sono state seminate su supporti Snapwell 3801 (500.000 cellule per supporto; Corning Life Sciences). Gli esperimenti sono stati eseguiti dopo 7 giorni montando i supporti Snapwell in un sistema simil-camera di Ussing (camere a diffusione verticale). Le correnti transepiteliali sono state misurate utilizzando un gradiente transepiteliale di cloruro. Infatti, le soluzioni basolaterale e apicale contenevano, rispettivamente, NaCl 130 mM e 65 mM. Le due soluzioni contenevano anche KCl 2.7 mM, KH2PO4 1.5 mM, CaCl2 1 mM (2 mM per la soluzione apicale), MgCl2 0.5 mM, Na-HEPES 10 mM (pH = 7.5) e glucosio 10 mM. Durante gli esperimenti, nelle soluzioni in entrambe le camere veniva fatta gorgogliare aria. Le emi-camere sono state connesse all’amplificatore DVC-1000 (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL) attraverso elettrodi Ag/AgCl e ponti agar (KCl 1M, agar 1%). Le correnti transepiteliali sono state digitalizzate utilizzando un sistema di acquisizione PowerLab 4/25 (ADInstruments) e salvate su computer. Tutte le misure sono state eseguite a 37°C.
Generazione del modello tridimensionale di TMEM16A selvatica e C-TERM4
La struttura molecolare della proteina TMEM16A selvatica e del mutante C-TERM4 è stata modellata utilizzando la struttura cristallografica della scramblasi lipidica nhTMEM16 (PDB 4WIS). Per ciascun costrutto, utilizzando il programma Yasara (Krieger et al., 2002; Krieger et al., 2014) sono stati generati 5 diversi modelli in base ai possibili allineamenti alternativi tra le sequenze di nhTMEM16 e TMEM16A. Le parti migliori di ciascuno dei 5 modelli sono state combinate per ottenere un modello ibrido (Z-score = -1.939).
Dinamica molecolare
Gli studi di dinamica molecolare sono stati condotti con il programma NAMD (Phillips et al., 2005) utilizzando il campo di forza Charmm27. Mediante l’uso di programmi disponibili in VMD (Humphrey et al., 1996), il modello è stato inserito in una membrana lipidica di 150 X 150 Å costituita da POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) ed esposta ai due lati a molecole di acqua TIP3. Per neutralizzare le cariche del sistema, nella fase acquosa sono stati aggiunti ioni sodio e cloruro ad una concentrazione di 150 mM. Il sistema è stato minimizzato trattenendo gli atomi pesanti e permettendo alle molecole di acqua di equilibrare le interazioni tra proteina e solvente. Il sistema è stato scaldato gradualmente fino a 300 K ad una pressione costante di 1 atm. Quindi, per equilibrare il sistema a tale temperatura, è stata eseguita una simulazione di dinamica molecolare di 10 ns (intervallo di calcolo = 2 fs). Le interazioni elettrostatiche sono state calcolate con il metodo Ewald. La procedura SHAKE (Ryckaert et al., 1988) è stata impiegata per costringere tutti i legami colleganti atomi di idrogeno. La somma Ewald è stata calcolata utilizzando il metodo Particle-Mesh Ewald (PME) come implementato nel programma NAMD25. Tutte le analisi sono state eseguite usando Yasara, VMD e procedure scritte dal Dott. Oscar Moran (ICB, CNR).
Esperimenti di FRET
Le cellule HEK-293 sono state seminate su vetrini con camerette per microscopia ottica (µ-slide - IBIDI) e co-trasfettate con GFP-TMEM16A e TMEM16A-mCherry oppure TMEM16A-GFP e TMEM16A-mCherry. Gli esperimenti di FRET sono stati eseguiti utilizzando un microscopio confocale
TCS-SP8 (Leica Microsystems) con un obiettivo 63X a immersione in olio. Il donatore (GFP) è stato eccitato a 488 nm e l’emissione acquisita tra 495 nm e 540 nm; l’accettore (mCherry) è stato eccitato a 561 nm e l’emissione acquisita tra 580 nm e 650 nm. La FRET è stata misurata con il metodo basato sullo spegnimento dell’accettore (acceptor-photobleaching FRET) utilizzando il wizard FRET del programma Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF).
Cross-linking e Western blot
Mediante sintesi genica (GeneCust), è stata generata una versione di TMEM16A in cui le cisteine della porzione citosolica della proteina sono state sostituite con serine (costrutto nominato16A-cys(i)-less).
Le cellule HEK-293 sono state seminate su piastre Petri da 35 mm (300.000 cellule per petri) e trasfettate con 16A-cys(i)-less o mutanti contenenti uno o due residui di cisteina nella porzione citosolica (S285C, R494C, K921C, R494C/K921C). Dopo 48 ore, le cellule sono state lavate con PBS, staccate e risospese in 50 µl di PBS. Quindi, 10 µl della sospensione cellulare sono stati miscelati con 20 µl di PBS contenente il cross-linker (1,5-pentanediyl bismethanethiosulfonate; Toronto Research Biochemicals) alla concentrazione di 300 µM. Dopo 15 minuti a temperatura ambiente, la reazione di cross-linking è stata revertita con DTT 33 mM o direttamente interrotta con tampone Laemmli (3% SDS, 10% glycerol, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 e 1 mM EDTA). I campioni così ottenuti sono stati separati su gel di acrilamide Mini-Protean TGX 4-15% e trasferiti su membrane PVDF (Biorad) mediante il sistema Trans-Blot Turbo (Biorad). La proteina TMEM16A è stata rivelata con l’anticorpo SP31 (Abcam) diluito 1:10000 in TBS-T-latte 5%. Dopo i lavaggi e l’incubazione con anticorpo secondario coniugato a perossidasi, le bande proteiche sono state rivelate utilizzando il substrato Super Signal West Femto Maximum Sensitivity (Thermo Fisher Scientific Inc). L’acquisizione della chemiluminescenza è stata eseguita con il sistema Molecular Imager ChemiDoc XRS (Biorad).
Analisi statistica
I dati sono presentati come tracce rappresentative o medie ± SEM. L’analisi statistica è stata eseguita con il programma InStat (GraphPad). La significatività è stata determinata con il test t di Student.
RISULTATI
La prima parte del nostro studio ha avuto lo scopo di identificare la regione minima del C-terminale di TMEM16A che, se modificata, porta all’attivazione costitutiva della proteina-canale.
Il C-terminale di TMEM16A è stato sostituito, totalmente o in parte, con regioni equivalenti di TMEM16B e l’attività funzionale dei risultanti canali chimerici è stata valutata con il saggio fluorimetrico basato sulla proteina fluorescente gialla sensibile agli alogenuri (halide-sensitive yellow fluorescent protein, HS-YFP). La misurazione del decadimento della fluorescenza, che riflette l’influsso di ioduro dipendente da TMEM16A, è stata eseguita in presenza e in assenza di stimolazione con ionomicina, uno ionoforo che provoca l’aumento del calcio intracellulare. La figura 3A mostra le diverse versioni di TMEM16A che sono state utilizzate in questi esperimenti. Oltre a sostituire segmenti del C-terminale di TMEM16A con i corrispondenti segmenti di TMEM16B, sono stati introdotti dei codoni di stop per accorciare il C-terminale a diversi livelli.
La figura 3B mostra i dati funzionali ottenuti con le diverse versioni di TMEM16A espresse in cellule HEK-293 MSR. L’attività dei diversi costrutti è riportata come tasso massimo di spegnimento (quenching rate - QR) della fluorescenza della HS-YFP (Fig. 3C). Per la forma selvatica di TMEM16A, l’attività basale misurata in assenza di ionomicina risulta inferiore al 10% dell’attività indotta dalla stimolazione con lo ionoforo del calcio (confrontare le barre grigie con quelle bianche). In accordo con il nostro lavoro precedente (Scudieri et al., 2013), questa percentuale aumenta al 30% quando l’intero terminale di TMEM16A viene sostituito con la sequenza aminoacidica del C-terminale di TMEM16B (costrutto C-TERM). Abbiamo quindi testato altri due costrutti in cui è stata sostituita solo la prima metà (C-TERM1) o la seconda metà (TERM2) del terminale. Soltanto la modificazione della prima parte del C-terminale ha determinato un aumento dell’attività basale, restringendo così a questa regione la localizzazione del dominio responsabile di tale attività (Fig. 3A,B).
Figura 3. La modificazione del C-terminale potenzia l’attività di TMEM16A. (A) Rappresentazione schematica dei costrutti utilizzati nello studio. Le parti in blu e rosso indicano rispettivamente le sequenze aminoacidiche di TMEM16A e TMEM16B. Le sequenze precise sono riportate nella tabella 1 nella sezione materiali e metodi. Per ogni costrutto è indicata la presenza o meno di attività basale (trasporto anionico in assenza di un aumento del calcio intracellulare). Il riquadro mostra un allineamento tra le sequenze di TMEM16A e TMEM16B corrispondenti al più piccolo dominio in grado di indurre l’attività basale. (B) Grafico a barre riportante il trasporto anionico misurato con il saggio basato su HS-YFP in cellule HEK-293 MSR trasfettate con i costrutti indicati. I dati sono riportati come quenching rate (QR) calcolato interpolando il decadimento della fluorescenza causato dall’aggiunta di ioduro extracellulare. Barre grigie: trasporto anionico in assenza di aumento del calcio intracellulare. Barre bianche: trasporto anionico in cellule stimolate con ionomicina 1 µM. *** p<0.001 vs TMEM16A selvatica (n = 12-15 esperimenti). (C) Tracce rappresentative degli esperimenti con HS-YFP.
I successivi costrutti, da C-TERM3 a C-TERM6, sono stati generati sostituendo il C-terminale di TMEM16A con versioni progressivamente accorciate del C-terminale di TMEM16B. Tra questi, il costrutto C-TERM4, in cui è stata sostituita una regione di 25 aminoacidi, ha mostrato la massima attività basale (corrispondente al 40% dell’attività indotta da ionomicina). I costrutti più corti sono risultati, invece, meno attivi. Per esempio, C-TERM6, nel quale sono stati sostituiti solo 16 aminoacidi, è dotato di un’attività basale comparabile a quella della forma selvatica di TMEM16A.
Sono poi stati studiati altri due costrutti, C-TERM7 e C-TERM8, nei quali non sono stati modificati gli aminoacidi immediatamente a valle dell’ultimo dominio transmembrana. Soltanto C-TERM7 ha mantenuto l’attività basale, che è invece scomparsa con il costrutto C-TERM8 (Fig. 3A,B). È importante notare che l’attività ottenuta in seguito a stimolazione con ionomicina raggiunge livelli simili per tutti i costrutti analizzati (osservare le barre bianche), suggerendo un’efficienza di trasfezione ed espressione omogenea per tutti i costrutti. Pertanto, i differenti valori di quenching rate osservati in assenza di ionomicina rispecchiano probabilmente delle differenze intrinseche nel processo di attivazione del canale.
Riassumendo, dei 76 aminoacidi che compongono il C-terminale di TMEM16A, è sufficiente la sostituzione dei residui compresi tra le posizioni 913 e 926 per generare una significativa attività in assenza di aumento del calcio intracellulare. In questa regione, soltanto 5 residui sono diversi tra TMEM16A e TMEM16B (Fig. 3A). Per chiarire il contributo di questi aminoacidi, abbiamo sostituito progressivamente ciascun residuo e valutato l’effetto sull’attività di TMEM16A (Fig. 4). Abbiamo iniziato con la sostituzione dell’istidina 920 con la corrispondente lisina di TMEM16B (mutazione H920K; mutante 16A-K nella figura 4). Il saggio funzionale basato su HS-YFP in assenza di stimolazione con ionomicina non ha evidenziato alcun aumento dell’attività basale del mutante 16A-K (Fig. 4B,C). In modo simile, nessun cambiamento significativo è emerso per il doppio mutante H920K/Q917D (16A-DK). Invece, l’introduzione di una terza mutazione, V924S (16A-DKS), ha determinato un aumento dell’attività basale (Fig. 4B,C). L’introduzione di una quarta mutazione, K913T oppure M926L (16A-TDKS e 16A-DKSL, rispettivamente) ha determinato soltanto un piccolo aumento dell’attività rispetto al triplo mutante.
Figura 4. Mutagenesi del dominio attivante. (A) Allineamento delle sequenze aminoacidiche di TMEM16A e TMEM16B nella regione che, se modificata, aumenta l’attività basale. (B) Le tracce rappresentative degli esperimenti basati su HS-YFP mostrano l’attività (spegnimento della fluorescenza) delle diverse varianti di TMEM16A. I mutanti sono nominati con il simbolo dell’aminoacido che è stato sostituito. La freccia indica il momento in cui è stata aggiunta la soluzione contenente ioduro (senza ionomicina). (C) Grafico a barre mostrante l’attività basale delle forme selvatica e mutata di TMEM16A misurata con il saggio basato su HS-YFP. I dati sono riportati come quenching rate (QR) del decadimento della fluorescenza causato dall’influsso di ioduro. ** p<0.01 vs wild type; # p<0.05 vs mutanti con 3 e 4 sostituzioni (n = 12).
Al contrario, la contemporanea sostituzione di tutti e 5 i residui (16A-TDKSL) ha prodotto un significativo aumento dell’attività basale rispetto ai costrutti con 3 e 4 mutazioni (Fig. 4B,C). Pertanto, si può concludere che le proprietà del “dominio attivante” non sono determinate da un singolo aminoacido, bensì sono distribuite tra più residui.
L’effetto della modificazione del C-terminale è stato valutato anche mediante la tecnica del patch clamp nella configurazione whole-cell (Fig. 5). Per tali esperimenti, cellule HEK-293 sono state trasfettate con plasmidi contenenti la sequenza codificante per TMEM16A selvatica, C-TERM o C-TERM4. Le correnti di membrana sono state misurate utilizzando soluzioni intracellulari con diversa concentrazione di calcio libero. In condizioni di alto calcio libero (245 nM), tutti e tre i costrutti hanno mostrato ampie correnti di membrana dotate della tipica voltaggio-dipendenza, cioè attivazione e inattivazione a potenziali di membrana positivi e negativi, rispettivamente. Tuttavia, va evidenziato come le correnti di membrana associate al costrutto C-TERM4 siano di ampiezza notevolmente maggiore (Fig. 5A, notare la diversa scala). Come atteso, in condizioni di calcio libero molto basso (7 nM) la forma selvatica è totalmente inattiva. Alla stessa concentrazione di calcio, i mutanti C-TERM e C-TERM4 hanno mostrato correnti di membrana di ampiezza significativa, ma con proprietà diverse. Come descritto precedentemente (Scudieri et al., 2013), alla concentrazione di calcio di 7 nM, l’espressione di C-TERM ha generato correnti di membrana di ampiezza modesta, dotate di un’accentuata rettificazione e prive di attivazione tempo-dipendente a potenziali positivi (Fig. 5A). Le correnti di coda solitamente osservate quando il potenziale di membrana viene riportato da un impulso depolarizzante (es. +100 mV) al valore di riposo (–60 mV) sono risultate trascurabili. Invece, alla stessa concentrazione di calcio, le correnti associate all’espressione del costrutto C-TERM4 si sono rivelate paragonabili, in termini di ampiezza e forma, a quelle osservate per la forma selvatica di TMEM16A alla concentrazione di calcio di 245 nM (Fig. 5A). Come evidenziato dalle relazioni corrente-voltaggio della figura 5B, il mutante C-TERM4 mostra correnti entranti significative a potenziali negativi di membrana anche a questa bassa concentrazione di calcio libero (7 nM). Invece, quando gli esperimenti sono stati effettuati in condizioni di calcio estremamente basso (<1 nM), nessuno dei costrutti ha mostrato attività.
Figura 5. Correnti di membrana generate da TMEM16A con C-terminale chimerico. (A) Tracce rappresentative delle correnti di membrana registrate in configurazione whole-cell in cellule HEK-293 trasfettate con TMEM16A selvatica o con i mutanti C-TERM e C-TERM4. Le correnti di membrana sono state indotte variando il potenziale di membrana da –100 mV a +100 mV con un ΔV di 20 mV partendo dal potenziale di riposo fissato a –60 mV. Sono indicate le concentrazioni di calcio delle soluzioni intracellulari utilizzate. (B) Relazione corrente-voltaggio per le forme selvatica e chimeriche di TMEM16A. Ogni punto rappresenta la media ± SEM di 9-12 esperimenti.
Le proprietà del costrutto C-TERM4 sono state ulteriormente analizzate in cellule FRT trasfettate stabilmente. Come riportato nella figura 6A, abbiamo innanzitutto valutato il livello di espressione proteica mediante Western blot utilizzando un anticorpo anti-TMEM16A. Il clone di cellule FRT con C-TERM4 ha mostrato un livello di espressione 4 volte più basso se confrontato con le cellule FRT esprimenti la forma selvatica di TMEM16A.
Figura 6. La modificazione del C-terminale altera la sensibilità al calcio intracellulare. (A) Analisi dell’espressione di TMEM16A in cellule FRT trasfettate stabilmente con la forma selvatica o con il costrutto chimerico C-TERM4. In alto: esempio di esperimento di Western blot. In basso: analisi densitometrica (n = 3). (B) Analisi della sensibilità al calcio intracellulare di TMEM16A in cellule FRT. Il grafico mostra la conduttanza di membrana misurata in esperimenti di whole-cell alle concentrazioni di calcio indicate. La conduttanza di membrana è stata calcolata dalle correnti di coda. (C) Registrazioni della corrente transepiteliale in cellule FRT. In alto: tracce rappresentative della risposta all’applicazione di UTP (100 µM) sul lato apicale degli epiteli. In basso: grafici a barre riportanti le proprietà delle correnti generate in cellule esprimenti la proteina selvatica o C-TERM4 (Ipeak: picco di corrente; IAUC: area sotto la curva; t/50: tempo necessario al decadimento della corrente al 50% del suo valore massimo). ** p<0.01; *** p<0.001 vs proteina wild type (n = 9 esperimenti).
Nonostante la minore espressione, C-TERM4 è risultato associato alla comparsa di correnti di membrana molto ampie come indicato dagli esperimenti di patch clamp condotti utilizzando diverse concentrazioni intracellulari di calcio (Fig. 6B). Per valutare l’affinità per il calcio della forma selvatica e della forma chimerica di TMEM16A sono stati misurati i valori di picco delle correnti di coda
che vengono generate dopo il ritorno del potenziale di membrana dal potenziale test di +100 mV al valore di mantenimento (–60 mV). I valori di picco delle correnti sono stati utilizzati per calcolare la conduttanza secondo la relazione g = I / (Vm - Vrev). In figura 6B i valori di conduttanza sono stati riportati in funzione della concentrazione intracellulare di calcio. I dati ottenuti sono stati interpolati con l’equazione di Hill. Risulta evidente come la calcio-dipendenza dei due costrutti sia significativamente diversa, con C-TERM4 che appare dotato di una maggiore sensibilità al calcio rispetto a TMEM16A selvatica.
Le cellule FRT sono in grado di formare epiteli quando vengono seminate su supporti porosi (inserti Snapwell). Pertanto, le cellule FRT esprimenti la proteina selvatica e mutata sono state studiate anche in esperimenti di registrazione della corrente di corto-circuito in cui l’attività dei canali TMEM16A genera correnti transepiteliali. Le cellule sono state stimolate con l’aggiunta di UTP (100 µM) per indurre l’aumento dei livelli intracellulari di calcio. La figura 6C mostra come i due canali rispondano diversamente alla stimolazione. Sebbene la corrente indotta da UTP raggiunga valori massimi simili in entrambi i cloni cellulari, la risposta è più prolungata nelle cellule che esprimono C-TERM4, come evidenziato da due parametri analizzati: l’area sotto la curva (AUC) e il tempo necessario per il decadimento della corrente al 50% del suo valore massimo (Fig. 6C).
Nel proseguimento del nostro lavoro, abbiamo ipotizzato che il C-terminale di TMEM16A interagisca normalmente con un altro dominio della proteina e che la modificazione della sua sequenza aminoacidica possa perturbare questa interazione. Questo potrebbe essere il meccanismo che sta alla base del potenziamento dell’attività osservato nei mutanti con C-terminale modificato. Abbiamo anche ipotizzato che la generazione di costrutti con più domini chimerici, in cui sia il C-terminale che l’ipotetico dominio con cui esso interagisce derivino entrambi da TMEM16B, possa ripristinare la normale interazione e, quindi, attività. La figura 7A,B mostra i dati ottenuti con il saggio basato su HS-YFP ed effettuato su cellule HEK-293 MSR trasfettate con costrutti in cui oltre al C-terminale anche un altro dominio derivava da TMEM16B. In accordo con la nostra ipotesi di lavoro, abbiamo osservato come l’attività basale associata alla modificazione del C-terminale scomparisse solo quando veniva modificata anche la regione corrispondente alla prima ansa intracellulare (LOOP1). Questi risultati sono stati confermati in esperimenti di patch clamp, dove le correnti di membrana misurate
utilizzando una soluzione con concentrazione intracellulare di calcio di 7 nM erano assenti nelle cellule trasfettate con il costrutto LOOP1 + C-TERM1 (Fig. 7C).
Figura 7. Attività di canale associata a costrutti di TMEM16A con 2 domini chimerici. (A) Grafico a barre mostrante l’attività basale (barre grigie) e stimolata con ionomicina 1 µM (barre bianche) misurata con il saggio basato su HS-YFP effettuato sui costrutti indicati. I dati sono riportati come quenching rate (QR) del decadimento della fluorescenza causato dall’influsso di ioduro. # p<0.05 vs C-TERM1 (n = 6-9 esperimenti). (B) Tracce rappresentative degli esperimenti in A. (C) Tracce rappresentative e relazioni corrente-voltaggio ottenute da esperimenti di patch clamp in configurazione whole-cell. Sono state utilizzate soluzioni intracellulari con diversa concentrazione di calcio libero, 7 nM e 245 nM. n = 6-9 esperimenti per ciascuno dei costrutti indicati.
Recentemente, è stata determinata la struttura tridimensionale di una proteina TMEM16 mediante cristallografia a raggi X (Brunner et al., 2014). In accordo con studi biochimici precedenti, questa struttura mostra che le proteine TMEM16 formano omodimeri. Abbiamo pertanto utilizzato queste informazioni per generare un modello della struttura di TMEM16A. La figura 8A ne mostra un’ipotetica vista laterale (parallela alla membrana plasmatica) e dal basso (dal versante intracellulare). Ciascuna subunità del dimero contiene 10 domini transmembrana ed estremità N- e C-terminali citoplasmatiche.
Figura 8. Modello della struttura di TMEM16A. (A) Vista dal lato e dal basso di TMEM16A in forma omodimerica. I monomeri sinistro e destro sono colorati rispettivamente in magenta e blu. I C-terminali di ciascuna subunità si incontrano al centro della struttura (regioni colorate in rosso e indicate dalle frecce rosse) per poi estendersi verso il lato opposto del dimero, dove prendono contatto con la regione N-terminale della subunità controlaterale (frecce blu). (B) Dettaglio delle due regioni C-terminali e delle due prime anse intracellulari. È indicata la posizione dei residui R494 e K921 successivamente sostituiti con cisteine.
eliche, di cui la più prossimale (Fig. 8A, frecce rosse) appare essere in stretta prossimità della prima ansa intracellulare delle subunità ipsilaterale e controlaterale. Invece, le altre due α-eliche, come già mostrato per la proteina nhTMEM16, prendono contatto con il dominio N-terminale della subunità controlaterale (Fig. 8A, frecce blu). Nella figura 8B viene mostrata con maggior dettaglio la regione di prossimità tra il C-terminale e la prima ansa intracellulare. Inoltre, viene mostrata la posizione dei residui (R494 nella prima ansa intracellulare, K921 nel C-terminale) successivamente utilizzati per esperimenti di mutagenesi. È importante sottolineare come l’α-elica prossimale del C-terminale, che si trova in vicinanza della prima ansa intracellulare, contenga la sequenza aminoacidica corrispondente al “dominio attivante” di TMEM16B.
Per analizzare la possibile interazione tra il C-terminale e la prima ansa intracellulare di TMEM16A, sono state effettuate delle simulazioni di dinamica molecolare utilizzando i modelli della proteina selvatica e della forma mutata C-TERM4. Innanzitutto, è stata esaminata la distanza media tra i residui della prima α-elica del C-terminale e della prima ansa intracellulare delle subunità ipsi- e contro-laterali (Fig. 9 e 10). Tale analisi ha identificato una serie di possibili siti di contatto (distanza tra residui delle due regioni minore di 6 Angstrom), sia nella forma selvatica che mutata, soprattutto tra la prima ansa intracellulare e il C-terminale di subunità opposte (Fig. 9A e 10A). Come secondo parametro, è stata valutata la varianza della distanza tra i residui delle due regioni. Per la proteina selvatica, le simulazioni di dinamica molecolare hanno rilevato delle fluttuazioni della distanza tra C-terminale e prima ansa intracellulare molto piccole (Fig. 9B e 10B). Al contrario, per il mutante C-TERM4 sono state evidenziate variazioni della distanza molto più ampie, soprattutto tra il C-terminale e i residui 492-498 della prima ansa intracellulare della subunità ipsilaterale (Fig. 9B e 10B).
Figura 9. Prossimità tra C-terminale e prima ansa intracellulare della subunità ipsilaterale. (A) Mappe di calore riportanti la distanza media tra i residui della prima α-elica del C-terminale (asse x) e della prima ansa intracellulare (asse y) della subunità ipsilaterale di TMEM16A selvatica o C-TERM4. (B) Mappe di calore riportanti le fluttuazioni della distanza (varianza della distanza inter-residuica) tra la prima α-elica del C-terminale (asse x) e la prima ansa intracellulare (asse y) della subunità ipsilaterale di TMEM16A selvatica o C-TERM4. I dati sono stati ottenuti da simulazioni di dinamica molecolare come descritto nei Materiali e metodi.
