Riassunto
Le planarie sono vermi piatti a vita libera appartenenti al phylum dei Platelminti (Lophotrochozoa). Questi invertebrati sono in grado di rigenerare lungo tutti gli assi del corpo e possono ricreare ogni componente mancante, anche a partire da frammenti molto piccoli. Tale abilità è dovuta alla presenza di cellule staminali pluripotenti, i neoblasti. Il reclutamento e la proliferazione dei neoblasti nei siti di lesione sono fondamentali per la rigenerazione, tuttavia i segnali e i meccanismi che producono le risposte dei neoblasti non sono ancora conosciuti. Si ritiene che lo stimolo per l’inizio della rigenerazione sia la ferita. A livello della ferita si attiva un processo complesso che inizia con la perdita di cellule e della matrice extracellulare. Da un punto di vista cellulare, questo rappresenta una forte perturbazione del microambiente. L’attivazione di proteine legate allo stress come le “Heat Shock Proteins” (HSPs) rappresenta un antico e conservato meccanismo di risposta capace di fornire appropriati segnali per il controllo della proliferazione, differenziamento e vitalità delle cellule di piante ed animali. Le HSPs hanno infatti un ruolo centrale nella protezione cellulare preservando la normale struttura proteica e riparando o rimovendo i danni provocati da stress. Durante il periodo di preparazione della tesi, allo scopo di poter analizzare l’espressione di proteine HSPs durante la rigenerazione, ho innanzitutto valutato la possibilità di utilizzare un anticorpo commerciale anti HSP70, verificandone la cross reattività nella planaria Schmidtea mediterranea. L’analisi in vitro, condotta mediante Western blot, ha richiesto l’identificazione preliminare del miglior tampone di lisi per l’estrazione proteica. Come controlli ho utilizzato anticorpi diretti contro proteine che cross-reagiscono in organismi diversi, come l’anti-tubulina beta. L’anticorpo anti HSP70, in condizioni di alta stringenza, produce una banda netta a 70 kDa in estratti proteici di cellule HeLa. Per gli estratti proteici di planaria ho operato in condizioni di stringenza più blanda. In queste condizioni sperimentali, utilizzando estratti proteici di planarie rigeneranti, ho osservato che l’HSP70 un incremento della sua espressione durante la rigenerazione. Questi risultati fanno ipotizzare che il riconoscimento possa coinvolgere una forma indotta di HSP70. Allo scopo di localizzare in quali cellule è espressa questa particolare forma di HSP70, ho condotto estrazioni proteiche su planarie, sia intatte che rigeneranti, irradiate con raggi-X. Dai risultati ottenuti si osserva un netto calo della produzione della proteina, facendo ipotizzare una localizzazione nei neoblasti.
In parallelo all’analisi condotta a livello proteico, ho preso in considerazione la possibilità di analizzare l’espressione spazio-temporale di RNA messaggeri per proteine HSP in S. mediterranea.
In particolare la mia attenzione si è focalizzata su due diverse hsps: hsp70 e hsp90 A questo scopo, grazie alla disponibilità in banca dati di una collezione di ESTs di questa planaria, ho individuato e clonato i cloni ESTs che presentavano similarità con hsp70 e hsp90. Allo scopo di studiarne l’espressione ho condotto esperimenti di ibridazione in situ “whole mount” e su sezioni utilizzando sonde ad RNA specifiche, marcate con digossigenina. I risultati dell’ibridazione in situ “whole-mount” con hsp70 evidenziano un segnale di ibridazione diffuso lungo tutto il corpo dell’animale. Nello specifico, però, si osserva un ridotto segnale di ibridazione nella testa, e la sua assenza nella zona del faringe. Durante gli stadi precoci della rigenerazione è stata osservata, una attivazione nella produzione dei trascritti in prossimità della regione includente il blastema e il postblastema. Il segnale si mantiene alto per tutto il procedere della rigenerazione, ma tende a diminuire negli stadi più tardivi. L’ibridazione in situ su sezioni mostra una marcatura sottoepiteliale nella regione del taglio, ed in particolare il segnale di ibridazione è localizzato all’interno dei neoblasti. Contemporaneamente, ho condotto anche ibridazioni in situ “whole-mount”, con hsp90, sia su planarie intatte che rigeneranti. I risultati di ibridazione mostrano un segnale diffuso in tutto il corpo dell’animale intatto. In particolare è evidente all’altezza del faringe la presenza di piccoli clusters di cellule subepiteliali. Durante la rigenerazione si è inoltre osservata una sovraespressione del gene a livello della regione della ferita.
