Aspetti quantitativi dell’interazione
Farmaco-Recettore
curve concentrazione-risposta e dose-risposta
Curva concentrazione-risposta: descrive la relazione tra concentrazione di un farmaco ed il grado di risposta (esperimenti in vitro)
Curva dose-risposta: relazione tra dose somministrata ed il grado di risposta (esperimenti in vivo)
Da un punto di vista quantitativo le risposte farmacologiche possono essere definite come:
a) Risposte graduali (risposte misurabili in continuo)
b) Risposte del tutto o nulla (quantali) (dose/numero individui in cui si verifica l’effetto)
Curve quantali
La risposta di tipo quantale mette in rapporto la frequenza con cui si verifica una definita risposta, con il valore delle dosi impiegate (risposta del “tutto o nulla”).
Curve dose-risposta GRADUALI
L’effetto di un farmaco è proporzionale al numero di recettori occupati, quindi aumenta all’aumentare della dose.
Curve dose-risposta GRADUALI: Caratteristiche
Effetto massimo o efficacia
• Caratteristica principale del farmaco, è la risposta massima prodotta da un farmaco • Plateau nella curva dose-effetto
• Dipende dalle sue proprietà intrinseche e dal sistema recettore-effettore • Non è correlato alla potenza
Potenza
• Indica quanto farmaco è necessario per indurre il 50% della risposta (EC50). • Più bassa la dose richiesta, più il farmaco è potente.
• Non è giustificata l’opinione che tra due farmaci il più potente sia clinicamente
migliore: una potenza bassa è uno svantaggio solo se la dose efficace è troppo grande ed ostacola la somministrazione
Curve dose-risposta GRADUALI: Caratteristiche
Variabilità (variazione biologica)
• differenze nella risposta tra individui della stessa popolazione a cui è stata somministrata la stessa dose di farmaco
Pendenza (o coefficiente angolare)
• Indica la maneggevolezza del farmaco
• Una forte pendenza indica che un piccolo aumento della dose del farmaco provoca un grande cambiamento della risposta
Curve dose-risposta
Molto utilizzate per definire e confrontare l’attività di farmaci diversi su di uno stesso target biologico
TARGETS DEI FARMACI ATTUALMENTE IN USO
La maggior parte dei farmaci per indurre una risposta deve interagire (legarsi) con uno specifico bersaglio molecolare (proteine).
Non rientrano in questa categoria
! Antiacidi
! Scavengers per radicali liberi ! Lassativi
I principali bersagli molecolari dei farmaci sono: " Recettori di membrana " Recettori intracellulari " Canali ionici " Enzimi " Trasportatori
FARMACI E MECCANISMO D’AZIONE
Caratteristiche del legame con il bersaglio:
" Specificità (riconoscimento specifico)
" Amplificazione e diversificazione della
risposta (secondi messaggeri)
Tipi di RECETTORI
Le cellule distanti tra loro comunicano attraverso molecole (MEDIATORI o NEUROTRASMETTITORI) che si legano a macromolecole nella cellula ricevente (RECETTORI)
1) RECETTORI DI MEMBRANA
•
Legati a canali ionici•
Legati a proteine G•
Legati ad enzimiRECETTORI DI MEMBRANA: RECETTORI CANALE
" Sono dei complessi macroproteici transmembranari che
formano un canale ionico (aperto dal legame con il neurotrasmettitore o con farmaci agonisti)
" La loro attivazione determina dei rapidi cambiamenti delle concentrazioni ioniche intra-cellulari e del potenziale elettrico transmembranario
" Sono recettori canale:
-
Recettori nicotinici-
Recettori GABAA-
Recettori per la glicina-
Recettori per il glutammatoEccitatorio: acetilcolina, glutammato, serotonina
(apertura dei canali Na+ con
conseguente depolarizzazione)
Inibitorio: GABA, glicina
(apertura dei canali Cl- con
conseguente iperpolarizzazione)
I recettori legati a canali ionici possono avere effetto di tipo:
" Le proteine G sono una famiglia di molecole proteiche, chiamate così per la loro interazione con i nucleotidi guaninici
GTP e GDP
" Ogni proteina G è formata da 3 subunità (α, β e γ)
" GTP e GDP si legano alla subunità α, che ha attività GTPasica (GTP → GDP)
" β e γ sono associate a formare un complesso βγ, sono idrofobiche e sono ancorate alla superficie citoplasmatica della membrana
Gq R GTP GDP + - GTP GDP Gi R AC ATP cAMP R Gs GTP GDP PK-A + Ca++ RS + Ca++ Ca++ PL-C PIP2 IP3 + DAG PK-C +
Cascata amplificatrice
1° messaggero 2° messaggero 3° messaggero neurotrasmettitori - ormoni recettori proteine Gadenilatociclasi guanilatociclasi fosfolipasi canali ionici
cAMP cGMP Ca 2+ IP3
proteinchinasi A proteinchinasi C proteinchinasi proteinchinasi Ca-calmodulina fosfatidilserina dipendenti dipendenti
Ca 2+
substrati per le diverse proteinchinasi
effetti biologici
" Il 50% dei farmaci oggi in uso agiscono sui GPCR (G-Protein Coupled Receptors)
" 210 ligandi endogeni agiscono sui GPCR
…ma ci sono ancora circa 800 GPCR da identificare!
RECETTORI ACCOPPIATI ALLE PROTEINE G
Le proteine G:
Gs
istamina, 5-HT, glucagone Ammine β-adrenergiche, ↑ cAMPG
i1, G
i2, G
i3 Ammine α-adrenergiche, Ach (muscar), 5-HT, oppioidi etc. apertura canali K↓ cAMP, + (↓ frequenza cardiaca)G
q Ach (muscar), 5-HT, bombesina etc. ↑ PLC(↑ IP3, DAG, Ca++ citopl)
G
0 Neurotrasmettitori cerebraliRecettori Effettori
RECETTORI DI MEMBRANA: RECETTORI LEGATI AD ENZIMI
I Recettori Tirosina Chinasi (RTK) legano ormoni peptidici e fattori di crescita ( insulina, EGF, IGF, NGF, PDGF, ecc.) e regolano la
RECETTORI DI MEMBRANA: RECETTORI LEGATI AD ENZIMI
I Recettori Tirosina Chinasi (RTK) possono essere:
• recettori dotati di attività enzimatica intrinseca: possiedono attività tirosin-chinasi stimolata dal ligando. Nella maggior parte dei casi il ligando si lega come dimero stimolando la dimerizzazione del recettore e la stimolazione della sua attività chinasica.
Questi recettori autofosforilano residui di tirosina presenti nel loro dominio citosolico e possono fosforilare anche varie proteine substrato.
RECETTORI DI MEMBRANA: RECETTORI LEGATI AD ENZIMI
I Recettori Tirosina Chinasi (RTK) possono essere:
• recettori associati alla tirosina chinasi: sono privi di attività catalitica
intrinseca, ma il legame con il ligando induce la formazione di un recettore dimerico che interagisce ed attiva delle tirosina-chinasi citosoliche
RECETTORI INTRACELLULARI
" Interagiscono con il genoma, modificando l’espressione genica e quindi la composizione proteica della cellula
" Trasducono il segnale portato da ormoni e da altri mediatori lipofilici (ormoni steroidei e tiroidei, acido retinoico, vitamina D, ecc)
Sistemi di modulazione del segnale
Oltre a sistemi di attivazione recettoriale e di amplificazione del segnale sono presenti meccanismi di interruzione del segnale
• Autoregolazione del rilascio del neurotrasmettitore (feedback negativo)
Questo meccanismo si realizza mediante recettori presinaptici che possono essere controllati dallo stesso neurotrasmettitore
(autorecettori) o da un neurotrasmettitore differente (eterorecettori)
• Sistemi enzimatici preposti alla degradazione • Sistemi di recupero del neurotrasmettitore
• Desensitizzazione recettoriale
La desensitizzazione può essere:
• omologa (specifica per un recettore) oppure eterologa (non specifica);
• rapida (~ 20 minuti) oppure lenta (giorni);
• perdita funzione recettoriale (uncoupling) o con diminuzione dei recettori (down-regulation)
• Uncoupling del recettore (desensitizzazione rapida)
La fosforilazione non altera la capacità del recettore di attivare la G-protein ma aumenta l’affinità del recettore fosforilato per la proteina β-arrestina che inibisce l’interazione del recettore con la G-protein determinando il disaccoppiamento).
• Uncoupling del recettore (desensitizzazione lenta)
Molti sistemi recettoriali sono fosforilati dai loro stessi enzimi
effettori PKA e PKC
Questo tipo di fosforilazione è un feedback diretto negativo che al tempo stesso sopprime l’attivazione dell’enzima effettore PKA.
Questo meccanismo di desensitizzazione è eterologo in quanto l’attivazione di PKA o PKC è sufficiente a determinare la fosforilazione del recettore.
La desensitizzazione da PKA è più lenta ma è molto più sensibile alla concentrazione di agonista.
Si definisce AGONISTA un farmaco che si lega ad un recettore e genera una risposta biologica. Generalmente un agonista riproduce gli effetti dei ligandi endogeni.
Un ANTAGONISTA è un farmaco che interagendo con un recettore non produce da solo alcuna risposta ma modifica l’interazione dell’agonista
con il recettore diminuendone la risposta.
Agonisti e Antagonisti
Agonista endogeno (Ormone,
neurotrasmettitore, ecc)
Farmaco
Agonista Antagonista Farmaco
Risposta
Attivazione dei recettori: valutazione degli agonisti
Teoria di Clark per l’interazione farmaco-recettore
L’assunzione più importante di questa teoria è la proporzionalità lineare tra la risposta provocata e il numero di recettori occupati.
R + F
RF
Ne consegue che:
• La risposta massima (Emax) si ottiene con l’occupazione di tutti i recettori
• La risposta osservata (E) ad una data concentrazione di farmaco ([F]) corrisponde all’occupazione dei recettori all’equilibrio ([RF])
[R] [F] [RF] K D =
E
E
max=
[RF]
[R
T]
all’equilibrio:Dobbiamo esprimere diversamente sia [RA] che [RT] in modo tale da poter inserire grandezze note o ricavabili sperimentalmente.
[R] [F]
K
D[RF] =
[R
T] = [R] + [RF]
Attivazione dei recettori: valutazione degli agonisti
poichè Sostituendo avremo: e E E max = [R] [F] K D [R] + [RF] E = Emax [F] K D + [F] che diviene:
E
E
max=
[RF]
[R
T]
Si ottiene un effetto pari al 50% dell’effetto massimo quando [F]= Kd La concentrazione di agonista che determina il 50% dell’effetto massimo viene definita EC50.
Attivazione dei recettori: valutazione degli agonisti
La maggior parte delle interazioni farmaco-recettore può essere descritta con un’equazione analoga all’equazione di Michaelis-Menten usata per descrivere le interazioni enzima-substrato
Relazione teorica tra concentrazione del farmaco e concentrazione del complesso farmaco-recettore (FR) secondo la teoria dell’occupazione.
E = Emax [F] K D + [F] Effe tto % Emax
• L’interazione farmaco recettore è saturabile
• Il legame tra il Farmaco e Recettore aumenta all’aumentare della dose.
Attivazione dei recettori: valutazione degli agonisti
Effe
tto
%
• la curva dose-risposta sigmoide è lineare tra 20 e 80% dell’effetto • il punto di flesso corrisponde alla KD
Per la teoria di Clark quindi KD = EC50.
Cioè la costante di dissociazione di un agonista KD può essere calcolata direttamente dalla curva dose risposta.
La teoria di Clark non può spiegare gli agonisti parziali né gli antagonisti.
Attivazione dei recettori: valutazione degli agonisti
EC50
Teoria di Ariëns
La risposta biologica dipende da due fattori:Affinità
E’ la capacità di un farmaco di legarsi al recettore ed è espressa dalla costante di dissociazione KD
Attività intrinseca
E’ la capacità del farmaco di indurre una risposta biologica (α)
La risposta biologica allora sarà:
E
AE
max=
[A]
K
A+ [A]
α
Secondo questa teoria, fermo restando che la risposta biologica dipende ancora dal numero di recettori attivati, l’interazione viene studiata sotto due aspetti:
affinità (capacità di legare il recettore).
attività (capacità di indurre una risposta biologica).
Agonisti pieni: Attività intrinseca (α) = 1
Agonisti parziali: Attività intrinseca (α) compresa tra 0 e 1
Antagonisti: Attività intrinseca (α) = 0
In base all’attività intrinseca i farmaci sono classificati in:
Attivazione dei recettori: valutazione degli agonisti
Possiamo determinare anche di un agonista parziale la KD e definire la sua attività intrinseca disponendo di un agonista pieno:
Attivazione dei recettori: valutazione degli agonisti
Emax B Emax A
α =
EmaxA EmaxB KDA KDB A= agonista pieno B= agonista parzialeDalle teorie di Clark e Ariëns si evince che la risposta massima si ottiene quando tutti i recettori sono occupati ma questo non è sempre
Agonisti inversi:
! hanno azione opposta a quella degli agonisti e riportano il
sistema recettoriale costitutivamente attivato allo stato basale.
! Possono essere utili in alcune malattie caratterizzate da
anomalie funzionali del recettore dipendenti, ad esempio, da mutazioni
Attivazione dei recettori: valutazione degli agonisti
Modello recettoriale a due stati:
R R* FR FR* R: recettore inattivo R*: recettore attivo FR FR* Agonista FR FR* Agonista inverso
Curve dose-risposta di un agonista pieno, parziale,
inverso e di un antagonista
Antagonismo competitivo
Gli antagonisti possono interagire con lo stesso sito dell’agonista e quindi competere nell’interazione con il recettore. log [agonista] Ef fe tto p er ce ntu al e
Attivazione dei recettori: attività degli antagonisti
Farmaco
Agonista Antagonista Farmaco
Se in presenza di un antagonista si osserva uno spostamento parallelo verso destra, senza che venga alterata la risposta massima dell’agonista, l’antagonismo viene definito sormontabile.
Antagonismo competitivo
Gli antagonisti possono interagire con lo stesso sito dell’agonista e quindi competere nell’interazione con il recettore. log [agonista] Ef fe tto p er ce ntu al e
Attivazione dei recettori: attività degli antagonisti
Farmaco
Agonista Antagonista Farmaco
Se in presenza di un antagonista si osserva una diminuzione della risposta massima dell’agonista, l’antagonismo viene definito
insormontabile.
In realtà ci sono situazioni intermedie:
a basse dosi l’antagonista irreversibile può dare un antagonismo sormontabile (vedi recettori di riserva)
Generalmente l’antagonismo sormontabile è legato all’antagonista competitivo mentre quello insormontabile a quello irreversibile.
Attivazione dei recettori: attività degli antagonisti
log [agonista] Ef fe tto p er ce ntu al e log [agonista] Ef fe tto p er ce ntu al e
In alcuni tessuti veniva evocata la risposta massima con agonisti pieni. In presenza di un antagonista irreversibile veniva osservato il seguente comportamento: log [agonista] Ef fe tto p er ce ntu al e (% )
Invece di osservare subito la risposta dell’antagonismo non competitivo (curve rosse) si ha lo spostamento parallelo verso destra delle curve dose risposta (curve nere).
Questo si spiega con il blocco di un gran numero di recettori prima di ottenere la risposta attesa. Secondo Clark ed Ariëns questo non sarebbe spiegabile.
Questi risultati vengono spiegati postulando la presenza nel tessuto dei recettori di riserva.
I recettori di riserva spiegano l’ottenimento della risposta massima di un agonista ad una concentrazione al di sotto di quella necessaria ad occupare tutti i recettori.
Ricordando quanto prima detto per la determinazione della KD degli agonisti (KA = EC50) si può dedurre che tale stima non è più corretta in presenza di recettori di riserva.
Calcolo della costante di dissociazione degli antagonisti
Le interazioni dell’agonista e dell’antagonista competitivo, all’equilibrio, dipendono:
- dalle rispettive costanti di dissociazioni (KA e KB)
A
+
B
+ R
R —
A
+
B
R —
B
+
A
K
AK
B- dalle concentrazioni (aumentando la concentrazione di agonista, si può superare l’occupazione da parte dell’antagonista).
Schild ha verificato che le curve dose risposta dell’agonista in presenza di dosi crescenti di antagonista risultano spostate verso destra in modo parallelo.
Le risposte ottenute con un agonista in assenza o in presenza di un antagonista risulteranno uguali solo quando l’agonista occuperà lo stesso numero di recettori.
Calcolo della costante di dissociazione degli antagonisti
log [agonista] Ef fe tto p er ce ntu al e (% )
[R] ed [RB] si possono ricavare dai rispettivi equilibri:
K
B=
[B]
[R]
[R
B
]
da cui[R
B
]
=
[B]
[R]
K
BK
A=
[A]
[R]
[R
A
]
da cui[R]
=
K
A[R
A
]
[A]
sostituendo avremo:K
A[R
A
]
[A]
[R
T] =
+
[R
A
]
+
[B]
K
A[R
A
]
K
B[A]
La frazione recettoriale occupata da un agonista [RA] / [RT] in presenza di un antagonista può essere così calcolata:
Mettendo in evidenza [RA]:
[R
T] =
[R
A
]
K
B[A]
K
A[A]
+ 1 +
K
A[B]
la frazione recettoriale occupata dall’agonista sarà:
[RT ] [RA] = 1 KB [A] KAKB + KB [A] + KA[B]
[R
T]
[R
A
]
=
[A]
K
A1 +
[B]
K
B+
[A]
[A] è la concentrazione dell’agonista in presenza dell’antagonista [B]
Per [B] = 0 avremo:
[R
A
]
[R
T]
=
[A]
[A]
+
K
AIn presenza di [B], l’agonista darà la stessa risposta che si otterrebbe in assenza di [B] solo quando verranno occupati lo stesso numero di recettori.
Definiamo [A] la concentrazione di agonista che fornisce la stessa risposta di [A] in assenza di antagonista:
[R
T]
[R
A
]
=
[A]
K
A1 +
[B]
K
B+
[A]
A questa concentrazione di [A] il numero di recettori occupati è lo stesso di quando non è presente l’antagonista, quindi avremo eguagliando le due equazioni:
[A]
K
A+
[A]
=
[A]
K
A1 +
[B]
risolvendola in funzione di [A] / [A]:
[A]
[A]
- 1 =
[B]
K
BPonendo [A] / [A] = X e passando ai logaritmi avremo:
log
(X - 1) = log
[B]
- log
K
BRiportando in grafico (Analisi di Schild) avremo:
log (X - 1)
log [B]
(n = 1)
Se X = 2 avremo cheQuando la retta ha pendenza = 1 l’antagonismo è competitivo
L’intercetta viene chiamata pA2 e rappresenta il logaritmo negativo della concentrazione di antagonista competitivo che determina il raddoppiamento della concentrazione dell’agonista per l’ottenimento del medesimo effetto in assenza di antagonista.
pA2 = - log KB
Solo quando la regressione di Schild è lineare ed ha uno slope = 1
Antagonisti allosterici
Un antagonista viene definito allosterico quando interagisce con un sito differente ma connesso al sito dell’agonista.
Gli antagonisti allosterici spostano, come gli antagonisti competitivi, verso destra e parallelamente le curve dose risposta degli agonisti. Inoltre possono dare nella regressione di Schild un valore pari a 1.
Però per concentrazione elevate si ha una marcata deviazione dall’antagonismo competitivo (saturazione del sito allosterico).
log (x - 1)
log [B] log KB
Farmaco
Come evidenziare un antagonismo allosterico?
Si possono effettuare esperimenti in presenza di un antagonista competitivo
noto. Se l’antagonista in esame è competitivo noteremo che l’effetto prodotto dai due antagonisti sarà additivo.
Gli antagonisti non competitivi competono con l’agonista per lo stesso recettore ma non per lo stesso sito.
I due siti sono tra loro indipendenti e l’inibizione provocata da B non è influenzata dalla concentrazione dell’agonista A.
La curva dose risposta non viene spostata verso destra ma si ha un abbassamento della risposta massima ottenibile con l’agonista.
log [agonista] Ef fe tto m as si m o pe rc en tu al e A B C D A: nessun Antagonista
B: Antagonista competitivo noto (S) C: S+Antagonista competitivo
Un metodo semplice per calcolare la potenza di un antagonista consiste nella determinazione della concentrazione che determina l’inibizione del 50 % della risposta massima dell’agonista.
