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Analisi dell'urea: nuovo metodo in ph-metria differenziale e sua applicazione agli spumanti

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(1)

?,psA

, t+oG/S), P4-,À1,

L'ENoLoco tr LUGLIo/AGosro

2oo4

*Roberto

lqrcher

*Donielq

Bertoldi

"*illqssimo

R. luzzunu

**Dqrio

Aqnellini

*Giorgio

trlicolini

* UO Enologia e Chimica Agraria, Istituto Agrario di San-

Micllele all'Adige x* Dip. Scienze e Tecnologie

Biotnediche, Facoltà di

Medicina, Università di Milano R. Larcher

ANA1ISI

DEll'URE&

NUOUO

METODO

IN PH.IIIIETRIA

DITÍERENZIAIE

E

SUA

APP1ICAZIONE

AO1I

SPUMANII

Viene presentata una nuova metodica di analisi dell'urea con la tecnica

def

la pH-metria differenziale,

valutando le prestazioni

in comparazione

con la usuale metodica enzimatica. Si presentano

inoltre i risultati

di un'indagine sui tenori di urea, potenziale precursore

del carbammato

di etile, in spumanti di Franciacofta,

del Trentino e dell'Oltrepò Pavese.

lntroduzione

B a s s e c o n c e n t r a z i o n i d i carbammato di etile (uretano) sono naturalmente presenti in molti alimenti e bevande fer-mentati. Tale composto, pre-sente normalmente anche nei vini in bassissime concentra-ziom, si è rivelato essere po-t e n z i a l m e n po-t e c a n c e r o g e n o , così da imporre in talune na-zioni I'adozione di limiti alla sua presenza ed in generale l'utlhzzo di particolari atten-zioni tanto nelle fasi di pro-d u z i o n e pro-d e l l e u v e c h e n e i

processi di trasformazione. L'origine della formazione di carbammato di etile nei vini risiede principalmente nella reazione acido-cat alizzata tra urea ed etanolo, anche se pu-re citrullina e carbammilfo-sfato sono dei possibili pre-cursori [Kodama et al., 1994; Monteiro et al., 1989; Ough

et al., l98B; Stevens e Ough,

19931. Diversi fattori posso-no essere anposso-noverati tra quel-li favorenti la formazione di uretano, e tra questi la predi-sposizione di talune cultivar (ad es. i Pinot) ad accumulare

a r g i n i n a [ N i c o l i n i e t a l . , 2 0 0 1 ] , s p e s s o i n c o n c o r s o con particolari condizioni cli-m a t i c o - a cli-m b i e n t a l i o s c e l t e agronomiche [Millery et al., 1 9 8 6 ; V e r s i n i e t a l . , 1 9 9 5 : B e r t a m i n i e t a l . , 1 9 9 8 1 , o I'impiego di attivanti di fer-mentazione azotati [Monteiro e B i s s o n , 1 9 9 2 1 . I c e p p i d i lievito evidenziano specifica capacità di produrre rapidam e n t e u r e a d u r a n t e l a f e r -mentazione a partire dall'ar-ginina, mostrando invece, in generale, maggiore difficoltà nella sua metabolizzazione

(2)

L'ENOLOGO f

LUGLIO/AGOSTO 2oo4

fiq. I . lineoritù delle misure

ollenute operondo

in-lompone

serondo

le modolitù

di qnqlisi "lix

limett è "end poinltt

fiq. 2 . linesritù delle misure ottenute operondo

iilvino se(ondo

le modolitù

di qnulisi "líx lime"

e t'end poinltt

fiq. 3 . Conlenuti

di ures lmg/ 1l misuroti per

Dil.metrio

differenzisle

in tonfronlo (on i (onle'

iruti misuroti per viq enzimqties

[ M o n t e i r o e B i s s o n , 1 9 9 1 ] . La sosta dei vini sulle fecce di lievito è un ulteriore fatto-r e d i p o t e n z i a l e i n c i d e n z a , potendo contribuire, in con-seguenza dei fenomeni di au-tolisi, ad un aumento del con-tenuto di amminoacidi, tra cui I'arginina [Margheri et al.,

r 9 8 4 1 .

L' utrlizzo dell'ureasi tFij i-nawa et al., 1990, 19921è at-tualmente I'unica via per ab-battere eventuali elevati con-tenuti di urea, nella prosPetti-v a d i l i m i t a r e i l r i s c h i o d i produzione di uretano. Come p e r a l t r i e n z i m i d i u t l h z z o enologico, però, i bassi valori di pH nei vini, ed ancor più negli spumanti, e la presenza d i e t a n o l o t e n d o n o a d u n a paruiale limitazione della sua attività. Nel presente lavoro si propone l'utrlizzo innovati-vo della tecnica della pH-me-tria differenziale quale stru-mento per una veloce ed ac-curata quantificazione dell'u-rea nei vini. La tecnica - già applicata per I'analisi degli zuccheri in campo alimentare ed enologico [Larcher, 1998; Luzzana et al., 2001], e per I'analisi dell'urea in campo m e d i c a l e [ B o n u c c h i e t a l . , 19871 e nel settore lattiero-caseario lLuzzana e Giardi-no, 19991 - viene qui validata sui vini in confronto con la tradizionale metodrca enzr-matica. Si riportano inoltre i contenuti di urea misurati in 50 vini spumanti

commercia-li prodotti col metodo classi-co in Trentino, Franciaclassi-corta ed Oltrepò Pavese. Per even-tuali approfondimenti circa le m e t o d i c h e p e r I ' a n a l i s i dell'urea, si rimanda a quanto riportato tra i riferimenti bi-b l i o g r a f i c i [Almy e Ough, 1 9 8 9 ; D o u g l a s e B r e m n e r , 1 9 7 0 ; F r a n c i s e t a I . , 2 0 0 2 ; K o d a m a e S u z u k i . 1 9 9 5 : Matsudo e Sasaki, 1995; Na-gel e Weller, 19891.

lhoteriqli

e metodi

La pH-metria differen-ziale. La tecnica si basa sulla possibilità di correlare varia-z i o n i d i p H , m i s u r a b i l i t r a d u e e l e t t r o d i a v e t r o , a l l a q u a n t i t à d i H + p r o d o t t i o c o n s u m a t i d a u n a r e a z i o n e chimica attivata dall' aggiunta di uno specifico enzrma. L'utllizzo analitico di questo processo richiede di tampo-nare opportunamente il mez-zo al fine di mantenere co-stante, in un intervallo di pH sufficientemente esteso (circa 500 mpH),la relazione tra la variazione di pH del mezzo e la quantità di substrato con-sumato dalla reazíone.

I vantaggi di tale tecnica sono riconducibili principal-mente ai seguenti aspetti:

- trattandosi di una misura differenziale, il segnale rile-vato è unicamente proporzio-nale alla quantità di analita

ff asformato ; eventu ah r eazio -n i a s p e c i f i c h e a v v e -n g o -n o contemporaneamente nei due canali dello strumento, annul-landosi.

- A diffeÍenza delle meto-diche colorimetriche o delle tradiziqnali enzimatiche con misura spettrofotometrica, è esente da interferenze di tipo ottico. Ciò permette di ana-Itzzare, senza preventiva di-luizione, prodotti caratteúz-zati da una elevata assorban-za, come nel caso di campio-ni di vino intensamente colo-rati o di mosti di elevata tor-bidità.

- I tempi di misura sono contenuti.

Ltanalisi. E stata eseguita con il pH-metro differenziale CL 10 Micro Plus controllato dal software dedicato instal-lato su PC. I reattivi sono co-stituiti da un tampone di la-voro a pH 6.2 (crtrato 5 mM, f o s f a t o 5 m M , K C I 0 . 1 M , MgCl2 l0 mM, Trrton 2Vo, NaN3 10 mg/L) e dall'ureasi (3000 U/ml) in glicerolo al 507o. La stabilità delle solu-ziont così preparate è dell'or-dine dei 6 mesi circa.

Come soluzioni di calibra-zione sono state utilizzate sra soluzioni acquose di urea ag-g i u s t a t e a p H 6 . 2 c h e v i n o p r e v e n t i v a m e n t e p r i v a t o dell'urea per via enzímatica

y = 0 . 9 6 5 5 x - 2 . 9 4 8 5 R 2 = o . g g 1

(3)

L'ENOLOGO tr LUGLIO/AGOSTO 2OO4

Tsh. l - Contenuti

di ureo (tqg/ 1l in spumdnti

(ommercioli

itqliqni per zonq dí origine

(aggiunta di ureasi succeisi-vamente inattivata). decarbo-n i c a t o , p o r t a t o a p H 6 . 2 e quindi riaggiunto di urea a diversi livelli di concentra-zione.

I campioni di vino da sot-topoffe all'analisi devono es-sere adeguatamente decarbo-nicati ed il loro pH preventi-vamente portato al valore di 6.2 con NaOH lM. Tale cor-rezione di pH, oltre a ad

otti-mrzzare I' attività dell' enzi-ma, permette di ottenere la migliore sensibilità analitica. L a p r o c e d u r a d i a n a l i s i prevede I' introduzione ma-nuale del campione mediante micropipetta in una cella, ove avviene la miscelazione auto-matica con il tampone. Dopo 30 secondi, necessari per la termo stat azrone, una piccola aliquota del campione tampo-nato viene automaticamente

trasferita verso i due elettrodi di pH per una misura prima della reazrone. Successiva-mente si aggiungono 8 FL di soluzione di ureasi al cam-p i o n e , s i o m o g e n e i z z a , e d un'aliquota viene trasferita per la misura al secondo elet-trodo (il primo eletelet-trodo ri-mane immerso nel campione tamponato, ma senza aggiun-ta di enzima). Il progredire della cinetica di reazione è v i s u a l i z z a t o a s c h e r m o i n tempo reale come differenza d e l p H a g l i e l e t t r o d i . C i ò consente un controllo visivo diretto del profilo della rea-zione per una immediata va-lutazione di eventuali anoma-l i e n e anoma-l anoma-l a c i n e t i c a , q u a anoma-l i a d esempio quelle dovute a tea-genti esauriti, alla non corret-ta introduzione del campione o ad una eventuale inibizione della reazione enzimatica. La misura di un secondo valore di pH al secondo elettrodo, dopo un tempo dr reazione opportunamente fissato, con-sente di definire un delta di pH (pH finale - pH iniziale) direttamente correlabile con la concentazione di urea nel campione. L'analisi di solu-zioni a titolo noto consente la creazione di un modello di taratura per la quantificazio-ne di campioni a titolo inco-gnito.

NIel presente lavoro sono state valutate sia condizioni di misura dopo un tempo di r e a z r o n e o p p o r t u n a m e n t e predefinito (Fix point), sia a completamento della reazio-ne e conseguente stabrlizza-zione del pH (End point). Al t e r m i n e d i o g n i m i s u r a l a strument azione viene lavata con una soluzione di HCI 25 m M p e r I ' e l i m i n a z i o n e d i ogni residuo di enzima o di campione.

Risultoti

dellq ricerrq

Operando su soluzioni ac-quose di standard opportuna-mente tamponate in un range d i c o n c e n t r a z i o n e d a 0 a 1500 prM di urea (Figura 1), la metodica ha evidenziato livelli di linearità simili tra le

tecniche in "end point" (Rt =

0 . 9 9 6 5 ) e " f i x t i m e " ( R 2 =

0 . 9 8 2 1 ) , c o n u n a m a g g i o r e sensibilità per la prima (pen-d e n z a (pen-d i 0 . 2 7 6 5 c o n t r o 0.1379 mpFV pM).

Operando su campioni di v i n o s p u m a n t e a g g i u n t i d i urea (Figura 2),la metodica ha confermato la linearità sia in "end point" che in "fix ti-me", evidenziando una limi-tata diffetenza di sensibilità tra le due tecniche (pendenza d i 0 . 2 3 4 2 c o n t r o 0 . 1 6 4 4 m p H / FrM), tuttavia meno marcata rispetto a quanto os-servato operando in tampo-ne.

La risposta strumentale os-servata, sia operando in fix time che in end ooint. sia su soluzioni acquose che su vi-no, peffnette di ritenere adot-tabile un modello di calibra-zione lineare, operativamente detinibile con I'analisi di un campione di bianco (acqua) e di un solo campione a titolo noto (soluzione acquosa o vi-no). In considerazione dei li-velli di sensibilità analitica richiesti per la quantificazio-ne dell'urea quantificazio-nei vini, si prop o n e d i o prop e r a r e c o n I ' a prop -proccio "fix time" così da ot-tenere un significativo rispar-mio nel tempo d'analisi.

La metodica enzimatica in pH-metria differenziale è sta-ta messa inoltre a confronto con il tradizionale metodo enzimatico per via spettrofo-t o m e spettrofo-t r i c a B o e h r i n g e r -Mannheim. I risultati ottenuti su campioni di vino con ag-giunta di urea in un range da 0 a 3 0 m g / L s o n o r i s u l t a t i ben correlati (R2 = 0.981; Fi-gura 3) con una buona corri-spondenza ta i valori misu-rati, come indicato dalla pen-d e n z a pen-d e l l a r e t t a ( 0 . 9 6 5 5 ) molto prossima all'unità. Le misure effettuate su 50 vini s p u m a n t i p r e s e n t a v a n o u n o scarto medio tra le due tecni-che pari a 0.9 mg/L in larga parte riconducibili alla scarsa sensibilità (l-2 ppm) della metodica enzrmatica Boeh-ringer-Mannheim [Fuj inawa et al., 19901. I metodi enzi-matici tradizionali quantifi-cano infatti I'urea come dif-fercnza tra i contenuti di am-monio prima e dopo tratta-mento con ureasi. Ciò richie-de ulteriori diluizioni nel ca-so di presenza di maggiori

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(4)

L'ENOLOGO tr LUGLIO/AGOSTO 2004

velli di ammonio nel cam-pione, come nel caso del vin o s p u m a vin t e , c o vin c o vin s e -guente perdita di sensibilità e precisione.

Urea nei vini spumanti. Nella figura 4 è riportata Ia distribuzione dei valori di concentrazioni di urea misu-rati con la tecnica della PH-metria differenziale nei cam-p i o n i d i s cam-p u m a n t e m e t o d o classico. Nella tabella I sono riportati gli stessi valori ri-partititi per zona di produzio-ne. Tutti i valori riscontrati n e i c a m p i o n i d i v i n o s p u -mante analizzati rientrav ano n e l c a m p o d i l i n e a r i t à d e l metodo in pH-metria diffe-renziale, tra 0 e 60 mgil. In particolare si può osservare c h e , i n l 1 d e i 5 0 c a m P i o n i anal.izzati. il contenuto di urea superava i 2 mg/I- e, tra questi, in 4 casi venivano su-perati i 5 mg/L, livello rite-nuto da FDA di rischio Per la produzione di carbammato di etile. Due campioni presenta-vano contenuti tra i 17 ed i 20 mg/L ca.

Consideruzioni

condusiue

L ' a p p r o c c i o i m p i e g a t o n e l l a d e t e r m i n a z i o n e d e l -I'urea nel vino mediante la pH-metria differenziale è ri-sultato essere specifico e suf-ficientemente sensibile. La c o r r e z i o n e i n i z i a l e d e l PH del campione e la decarboni-cazrone sono le sole opera-zioni preparative all' analisi. Il limite di rilevabilità è sti-mabile a 5 mM, corrisPon-denti a 0.3 mg[I- di urea, si-. gnificativamente più basso di quello riportato per la tneto-dica enzimatica tradizionale B o e h r i n g e r - M a n n h e . i m . L'analisi del campione viene completata in circa due mi-nuti.

L'approccio di pH-metria differenziale, quantificando direttamente 1'urea, non ri-sulta essere interferito dalla eventuale presenza di elevate concentrazioni di ione am-monio.

L' utrhzzo della metodica in pH-metria differenziale ha c o n s e n t i t o d i p o r r e i n l u c e

come il livello dei contenuti d i u r e a a n c h e i n p r o d o t t i commerciali di ottima qualità possa talora essere abbastan-za elevato e comunque tale da far meditare circa le scelte viti-enologiche aziendali e le loro ricadute in termini di potenziale produzione inde-s i d e r a t a d i c a r b a m m a t o d i etile. T

Sumnqry

U r e a a n a l y s i s : n e w method by differential

PH-metry and its application to sparkling wines. The sPonta-n e o u s r e a c t i o sPonta-n i sPonta-n w i sPonta-n e o f urea with ethyl alcohol can form ethyl carbamate with aging. As this compound has been recognized as potential-ly carcinogenic and limits ha-ve been established to its con-c e n t r a t i o n i n w i n e i n U S A and Canada, the availability of effective methods for the analysis of urea, main Poten-t i a l p r e c u r s o r , is w e l c o m e . A n i n n o v a t i v e m e t h o d b Y Differential pH Technique is presented for the quantitative determination of urea in wi-ne, and compared with Boeh-ringer's traditional enzymic m e t h o d . T h e n e w m e t h o d was applied to the measure-ment of the content of urea in 50 "classic method" sPark-ling wines from the most re-nowned Italian areas: Trenti-no, Franciacorta and OltrePo' Pavese.

Ringraziamenti. Si ríngra-zia la dottoressa Claire Vic-toria Marchitti per la fattiva collaborazione.

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Riferimenti

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