PREMESSA
La Doxorubicina è un chemioterapico che fa parte della famiglia delle antracicline.Questo farmaco è molto attivo sia per i tumori solidi sia per le leucemie e linfomi. L’uso della Doxorubicina negli ultimi anni è un po’ diminuità perché si sono verificate delle complicanze. Il problema risiede nel fatto che, in genere, i farmaci chemioterapici non riescono a distinguere le cellule maligne da quelle normali, per cui i loro effetti terapeutici spesso non posso essere disgiunti da quelli tossici. Per quanto riguarda la Doxorubicina il problema principale si verifica a livello cardiaco dove abbiamo una cardiotossicità sia acuta che cronica dose dipendente.
Per facilitare la comprensione dei fenomeni fisiopatologici che sono alla base riteniamo opportuno ricordare importanti elementi di biologia del ciclo vitale cellulare.
INTRODUZIONE
Ciclo cellulare
Il ciclo cellulare è un 'ordinata serie di eventi che determinano la crescita della cellula e la sua divisione in due cellule figlie. Viene diviso in: interfase e mitosi. A sua volta l’interfase viene suddivisa nelle seguenti fasi:(Fig.1(
- G1 (gap): le cellule si preparano alla sintesi del DNA
- S: le cellule sintetizzano il DNA e duplicano i proprio genoma
- G2: le cellule si preparano alla divisione e controllano la replicazione con gli enzimi di riparo
[Fig.1] Ciclo cellulare Il processo mitotico è costituito da 4 fasi: Profase: la cromatina comincia a compattarsi per formare i cromosomi, scompare il nucleolo e comincia la formazione del fuso mitotico; Metafase: scompare l’involucro nucleare, il fuso occupa l’intera cellula da un polo all’altro e i cromosomi,
Metafase
Anafase: i cromosomi, legati ai microtubuli mediante il cinetocore, vengono tirati verso i poli in modo che ciascun cromatide migri verso il polo opposto della cellul;.
Anafase
Telofase: i cromatidi costituiscono due gruppi separati ai poli cellulari e comincia la loro despiralizzazione. Il fuso viene degradato e comincia la formazione delle due nuove membrane nucleari intorno ai due gruppi di cromatidi che rappresentano il corredo cromosomico delle due cellule figlie, le quali cominciano a delinearsi per la formazione di una strozzatura al centro della cellula;
Telofase
Regolazione ciclo cellulare
Gli eventi del ciclo cellulare, devono avvenire in una sequenza predefinita che deve essere mantenuta. Il sistema che regola il ciclo, per mezzo di appositi freni molecolari, è in grado di arrestare il processo in diversi punti di controllo (checkpoints), evitando il passaggio alla fase successiva, se la prima deve ancora concludersi. La finalità della modulazione dei diversi eventi, attraverso il sistema di controllo, è quella di avere cellule figlie con massa e corredo cromosomico sempre adeguati. Quasi sempre il sistema di regolazione ha punti di controllo per le dimensioni cellulari, per cui il ciclo si ferma fino a quando la cellula non abbia raggiunto le dimensioni adeguate e dopodichè si ha la replicazione del DNA. Quindi è importante una fornitura adeguata di sostanze nutritive e di altri fattori extracellulari. In G1 la cellula ha modo di verificare se l’ambiente è favorevole alla proliferazione cellulare, prima di impegnarsi nella fase S.
Il secondo checkpoint si ha tra S e G2. In questo punto viene verificato se tutto il materiale genetico è stato replicato correttamente prima che la cellula possa entrare in mitosi. Un ultimo punto di controllo è il checkpoint del fuso, necessario perché venga scongiurata l’aneuplodia. Il sistema di controllo del ciclo cellulare è influenzato anche dall’ambiente che si presenta intorno alla cellula inoltre, negli organismi pluricellulari i checkpoints rappresentano un altro aspetto importante: sono momenti del ciclo nei quali possono intervenire segnali da altre cellule, come fattori di crescita (GF) o altri messaggi extracellulari che hanno l’effetto di promuovere o inibire la proliferazione cellulare.
Il sistema di controllo del ciclo svolge un ruolo basilare nella regolazione del numero di cellule che sono presenti nei vari tessuti attraverso la modulazione della sopravvivenza cellulare e dell’apoptosi, una forma di morte cellulare programmata.[Fig.2]
[Fig.2]Punti di controllo
Regolazione delle proteine di controllo.
Il sistema di controllo del ciclo cellulare governa gli apparati attraverso la fosforilazione di proteine chiave che innescano o regolano la replicazione del DNA, la mitosi e la citochinesi. La fosforilazione (e la defosforilazione) è uno degli strumenti più usati dalle cellule per modificare l’attività delle loro proteine. Le reazioni di fosforilazione che regolano il ciclo cellulare sono catalizzate da un gruppo specifico di proteinchinasi. Nelle cellule in attiva proliferazione le proteinchinasi del sistema di controllo pur persistendo in tutte le fasi del ciclo cellulare sono attive soltanto in momenti precisi del ciclo, mentre vengono disattivate subito dopo questi momenti. L’attività di queste chinasi è quindi presente o assente con una certa periodicità. La regolazione delle proteinchinasi avviene attraverso un’altra famiglia di proteine del sistema di controllo, le Cicline. Esistono vari tipi di cicline e vari tipi di Cdk. Le cicline non hanno attività enzimatica propria ma, legandosi alle chinasi le rendono attive. Per questo nell’ambito del sistema di controllo si parla di proteinchinasi-ciclina dipendenti (cdk cyclin dependent kinases). Le cicline devono il loro nome al fatto che, diversamente dalle cdk, la loro concentrazione varia periodicamente nel corso del ciclo cellulare. [Fig.3]
[Fig.3]
I meccanismi molecolari per mezzo dei quali viene bloccata la progressione del ciclo nei punti di controllo, non sono ancora del tutto conosciuti. Si sa, tuttavia che il ciclo cellulare può arrestarsi attraverso due meccanismi:
Per intervento di proteine inibitrici della CdK che bloccano l’aggregazione di uno o più complessi ciclina-CdK o ne neutralizzano l’azione;
Il controllo del DNA avviene prima della sua duplicazione.
In condizioni di normalità la concentrazione cellulare di p53 è bassa, ma quando si hanno danni
damentale nel mantenimento dell’omeostasi cellulare, al DNA se ne registra un aumento immediato e ciò determina un blocco delle cellule in G1 attraverso l’attivazione della p21, una proteina il cui ruolo è quello di legare ed inibire i complessi caratteristici della progressione del ciclo cellulare: cdk4-ciclina D e cdk2-ciclina E, oppure la loro morte attraverso apoptosi. A tale scopo p53 svolge un ruolo cruciale: la sua mutazione, infatti impedisce l’arresto del ciclo cellulare con una conseguente massiccia ed indiscriminata proliferazione cellulare.
La proteina p53 riveste un ruolo fon
determinante tanto che il 50% delle neoplasie è associato a mutazioni della proteina p53 e il restante 50% da mutazioni dei geni che la regolano.[Fig.5]
Danno cellulare
Il danno rappresenta l’incapacità delle cellule di far fronte ad una modificazione del proprio equilibrio omostatico. Si definisce danno reversibile se l’insulto è temporaneo e quindi l’omeostasi cellulare viene riprestinata con limitate conseguenze funzionali. Si definisce danno irreversibile se l’insulto è persistente si crea un danno strutturale alla cellula con deficit permanente e conseguente morte cellulare.
Cause di danno cellulare:
- Agenti fisici: traumi meccanici temperatura radiazione Agenti infettivi
Carenza di ossigeno (ipossia)
Reazioni immunologiche: ipersensibilità autoimmunità Anomalie genetiche
Disturbi della nutrizione: carenze alimentare carenze vitaminiche
obesità anni cellulari reversibili e irreversibili
tà e le conseguenze di un danno cellulare dipendono a capacità adattive dalla cellula. I sistemi più vulnerabili intracellulari
D
E’ importante ricordare che se la cellula fosse in uno sistema statico e rigido i cambiamento ambientali (stress) avrebbero un profondo effetto sulla funzione dei tessuti, esistono meccanismi omeostatici che consento alla cellula (organismo vivente capace di adottarsi ai cambiamenti) di superare questi stress. La risposta cellulare ad uno stimolo lesivo dipende dalla natura dello stimolo dalla sua durata e dalla sua intensi
mantenimento integrità genetica
ile possiamo avere un adattamento metabolico e un adattamento della crescita delle dimensioni e del differenziamento quando c’è un aumento di volume della cellula con un aumento della loro di un tessuto determinato da un aumento della si intende un adattamento a stimoli ambientali con
lula.
i che sono rilevanti nell’induzione del danno cellulare e della necrosi indipendentemente uesti comprendo:(Fig.6)
ATP. Il fosfato ad alta energia sotto forma di ATP è chiesto in numerosi
intetici e degradativi all’interno della cellula. Questi comprendo il trasporto di , e le reazioni di decilazione-riacilazione
fostato (ADP), una reazione che da origine a riduzione di ossigeno mediante il sistema ATP in assenza di ossigeno usando il glucosio che deriva sia dai fluidi
in seguito a danno. La deplezione di ATP e la Se abbiamo un danno reversib
strutturale che riguardano modificazioni cellulare.
Si parla di ipertrofia capacità funzionale.
Per iperplasia un aumento del numero delle cellule divisione cellulare. Per metaplasia
cambiamenti di differenzazione nella cel
Dal punto di vista biochimico molte tossine causano danno cellulare interferendo con substrati endogeni o enzimatici. La glicolisi, il ciclo dell’acido citrico e la fosforilazione ossidativa nella membrana interna mitocondriale sono particolarmente vulnerabili. Il cianuro,ad esempio, inattiva la citocromo ossidasi, il fluoro acetato interferisce con il ciclo dell’acido citrico, determinando in entrambi casi deplesione di ATP. Alcuni batteri anaerobi, come il Clostridim perfrigens, elaborano fosfolipasi, che attacano i fosfolipidi della membrana cellulare. Esistono però altri comun
dall’agente scatenanti. Q Deplezione di
processi s
membrana, la sintesi proteica, la lipogenesi
necessarie per il ricambio dei fosfolipidi.L’ ATP è prodotta mediante due vie. La principale, nelle cellule di mammifero, è la fosforilazione ossidativa della adesina dis
di trasporto degli elettroni a livello mitocondriale. La seconda è la via della glicolisi, che può generare
corporei che dalla idrolisi del glicogeno. Di conseguenza, tessuti con elevata capacità glicolitica sono avvantaggiati quando i livelli di ATP diminuiscono a causa di una inibizione del metabolismo ossidativo
diminuita sintesi di ATP sono conseguenze comuni del danno ischemico e tossico.
l’ossigeno molecolare ad acqua. Durante questo processo, vengono prodotte piccole quantità di forme reattive, parzialmente ridotte, dell’ossigeno come inevitabili prodotti collaterali della respirazione mitocondriale. Alcune di queste forme sono radicali liberi che possono danneggiare i lipidi, le proteine e gli acidi nuclei. Le cellule hanno dei sistemi di difesa per prevenire il danno causato da questi prodotti. Uno squilibrio fra sistemi di produzione ed eliminazione dei radicali liberi dà origine a danno ossidativo,
atico. Incrementi una condizione che si verifica in molte condizioni patologiche.
(Fig.6)
Calcio intracellulare e perdita dell’omeostasi del calcio. Il calcio libero nel citosol è mantenuto ad una concentrazione estremamente bassa ( minore di 0,1 µM) se confrontato ai livelli extracellulari di 1,3 µM.La maggior parte del calcio intracellulare è sequestrata all’interno dei mitocondri e del reticolo endoplasmatico.Questi gradienti sono modulati da ATPasi assiociate alla membrana, dipendenti da Ca 2+ e Mg 2+ ed energia. L’ischemia e particolari tossine possono provocare un precoce incremento nella concetrazione di calcio nel citosol, grazie all’entrata di Ca 2+ attraverso la membrana plasmatica e rilascio di Ca2+ dai mitocondri e dal reticolo endoplasm
danno alle membrane), protesi ( che distruggono sia le proteine di membrana che quelle del citoscheletro), ATPasi (innescando cosi’ la deplezione di ATP) ed endonuclesi (che sono legate alla frammentazione della cromatina). Il danno cellulare dà luogo ad un aumento del calcio intracellulare e questa a sua volta media diversi effetti dannosi, compreso la morte della cellulula. Tuttavia la perdita dell’omeostasi del calcio non è necessariamente un evevnto precoce del danno cellulare irreversibile.(Fig.7)
(Fig.7)
nenti litiche del com chimici.
Danno mitocondria,le irreversibile. Per la sopravvivenza a lungo termine, le cellule di
Difetti nella permeabilità di membrana .La perdita precoce della permeabilità selettiva di
membrana, che porta alla fine ad un danno di membrana conclamato, è una caratteristica saliente di tutte le forme di danno cellulare. Questi difetti possono essere il risultato di una serie di eventi che coinvolgono la deplezione di ATP e l’attivazione della fosfolipasi modulate dal calcio. Questo tipo di danno può colpire i mitocondri, la membrana plasmatica e altre membrane cellulari. La membrana plasmatica, comunque, può anche essere danneggiata direttamente da particolari tossine batteriche, da proteine virali, da compon
mammifero dipendono obbligatoriamente da un metabolismo ossidativo indipendentemente dalla loro capacità glicolitica. Di conseguenza, un danno irreparabile ai mitocondri porterà a morte la cellula. Direttamente o indirettamente i mitocondri sono importanti bersagli per tutti i tipi di stimoli lesivi, compresa l'ipossia e le tossine. Possono venire danneggiati dall'aumento del Ca`+ citosolico, dallo stress ossidativo, dalla degradazione dei fosfolipidi attraverso le vie della fosfolipasi A2 e della sfingomielina, dai prodotti derivati dalla degradazione lipidica, degli acidi grassi liberi e del ceramide. Il danno si esprime comunemente nella formazione di un canale ad alta conducibilità, (mi.thocondrial permeability transition, transizione di permeabilità mitocondriale), a livello della membrana mitocondriale interna
ono permanenti se lo stimolo iniziale ersiste, precludendo il mantenimento della forza proton-motrice, o potenziale di membrana. oiché il mantenimento del potenziale è critico per la fosforilazione ossidativa mitocondriale, ne deri c morte p nel cito trasport patolog DANNO Il primo zione ce ossigen
Inizialmente reversibili, questi pori non selettivi diveng p
P
va he la transizione di permeabilità mitocondriale transitoria irreversibile è un soffio di er la cellula. Il danno mitocondriale può anche essere associato a perdita di citocromo c sol. Poiché il citocromo c è solubile ma anche un componente integrale della catena di o degli elettroni e può innescare la morte per apoptosi nel citosol, questo evento ico è verosimilmente ritenuto un elemento chiave nel determinare la morte cellulare.
CELLULARE DURANTE ISCHEMIA/ IPOSSIA
Danno cellulare reversibile
punto di attacco dell'ipossia è la respira
llulare aerobia, cioè la fosforilazione soddidativa mitocondriale. Visto che la tensione di o all'interno della cellula diminuisce, c'è perdita della fosforilazione ossidativa e ridotta
diminuz sodio in accomp
endopla rigonfiamento cellulare nell’ischemia è
della glicolisi anaerobia al fine di mantenere la produzione di energia cellulare, ottenendo ATP
glicogeno. Di conseguenza i depositi di glicogeno vengono rapidamente esauriti. La glicolisi determina accumulo di acido anici che derivano dall’idrolisi dagli esteri del fosfato. Questo porta a riduzione del Ph intracellulare.
ente è la distruzione strutturale dell’apparato di
riduzione della sintesi proteica.
. Il
idici, che promuove la captazione e l’inserimento di ione della concentrazione di ATP e aumento dell’attività ATPasica, causa un accumulo di tracellulare con diffusione del potassio al di fuori della cellula. L’entrata netta di soluti è agnata da acquisto di acqua per osmosi, rigonfiamento cellulare, e dilatazione del reticolo smatico. Un secondo meccanismo che causa
l’aumento della pressione osmotica intracellulare dovuta all’accumulo di cataboliti, come fosfati inorganici, lattato e nucleosidi purinici.
Il metabolismo cellulare energetico alterato. Quando il livello di ossigeno si abbassa, la fosforilazione ossidativa cessa e la cellula si affida alla glicolisi per la produzione energetica.Questo passaggio al metabolismo anaerobio è controllato dall’azione dei metaboliti della via di produzione di energia sugli enzimi glicolitici. La diminuzione di ATP nella cellula e l’aumento associato di adenosin monofosfato stimolano la fosfofruttochinasi e l’attività della fosfotilasi. Questo determina un aumento attraverso il metabolismo di glucosio derivato dal
lattico e fostati inorg
Il fenomeno che si verifica successivam
sintesi delle proteine che si manifesta sotto forma di distacco di ribosomi del reticolo endoplasmatico rugoso e nella dissociazione dei polisomi a monosomi, con conseguente Nel danno cellulare reversibile possono anche verificarsi conseguenze funzionali
muscolo cardiaco cessa di contrarsi entro 60 secondi dalla occlusione coronarica .Si noti tuttavia che assenza di contrattilità non significa morte cellulare.
Se l’ipossia prosegue, l’aggravarsi della deplezione di ATP causa ulteriori danni morfologici. Il citoscheletro si disgrega, con perdita di strutture cellulari fini come microvilli e con la formazione di protuberanze (“blebs”) alla superficie cellulare. All’ interno del citoplasma o a livello extracellulare si possono osservare “figure mieliniche”, che derivano dalla membrana plasmatica cellulare o dagli organelli. Si ritiene che si formino in seguito alla dissociazione di lipoproteine con mascheramento dei gruppi fosfat
mol l solitame notevol sodio,e queste a Se l’isc caratter rimane Danno i Il da o alla mem Dal pun
irrevers i rendere reversibile la disfunzione mitocondriale causata dall m
funzion
consegu a danno di membrana.
eco e di acqua tra gli strati lamellari della membrana. In questa fase, i mitocondri sono nte rigonfi,per incapacità di controllare il loro volume. Il reticolo endoplasmatico è mente dilatata e la cellula intera è rigonfia, con un aumento di concentrazione di acqua, cloruro e diminuita concentrazione di potassio. Se si repristina l’afflusso di ossigeno, tutte
lterazioni sono reversibili.
hemia persiste, si arriva al danno irreversibile. Questo processo ha segni morfologici istici, ma le basi biochimiche dalla transizione del danno reversibile alla morte cellulare non chiaro.
rreversibile
nn irreversibile è associato morfologicamente a rigonfiamento mitocondriale,danno esteso brana plasmatica e rigonfiamento dei lisosomi.
to di vista biochimico due sono gli eventi che rendono che rendono il danno da ischemia ibile : il primo è l’impossibilità d
a arcata perdita di ATP, e il secondo è l’instaurarsi di profonde alterazioni nel amento della membrana plasmatica. La deplezione di ATP contribuisce decisamente alle
enze strutturali e funzionali dell’ischemia e può anche portare
Molti dati indicano che il danno di membrana è un fattore centrale nella patogenesi del danno irreversibile. La perdita di funzione nella membrana mitocondriale, l’aumento della permeabilità alle molecole della matrice extracellulare e i difetti della membrana plasmatica,dimostrabili a livello funzionale si verificano negli stadi più precoci del danno irreversibile.
Diversi meccanismi biochimici possono contribuire a questo danno di membrana.
Disfunzione mitocondriale. L’ aumento di calcio nel citosol associato alla deplezione di ATP dà origine ad un aumento dalla captazione di Ca +2 da parte dei mitocondri, attiva la fosfolipasi mitocondriale e causa accumulo di acidi grassi liberi. Agendo insieme, questi eventi provocano
verosilmente dovuta all’attivazione della fosfolipasi endogena, indotta dall’aumento del calcio citosolico dovuto all’ischemia. La perdita di fosfolipidi può anche verificarsi in seguito a
iminuzione della sintesi ex novo di fosfolipidi.
heletro. I filamento del citoscheletro servono ad ancorare la membrana lasmatici all’interno della cellula. L’attivazione della proteasi dovuta all’aumento del calcio nel
io, il distacco della membrana cellulare
ndendo il posto dei e alterazioni
si resistere agli effetti letali
o riossigenazione e li avvelena definitivamente, d
Anomalie del citosc p
citosol può danneggiare gli elementi del citoscheletro. In presenza di rigonfiamento cellulare, questo danno causa, soprattutto nelle cellule del miocard
dal citoscheletro, rendolo scuttibile a stiramenti e rotture.
Specie reattiva dell’ossigeno. I radicali liberi parzialmente ridottidell’ossigeno sono molecole altamente tossiche che possono causare danno alla membrana cellulare ed altre componenti cellulari. Questi radicolari liberi sono a bassi livelli nel miocardio durante l’ischemia, ma è durante il ripristino del flusso sanguinio che si verifica l’aumento della produzione .
Prodotto della degradazione dei lipidi. Questi comprendono acidi grassi liberi non esterificati, acil carnicina e lisofosfolipidi, prodotti catabolici che si accumulano nelle cellule ischemiche come risultato della degradazione dei fosfolipidi. Essi hanno effetto detergente sulle membrane. Inoltre si inseriscono all’interno del doppio stato lipidicodella membrana o pre
fosfolipidi, causando potenzialmente modificazioni di permeabilità elettrofisiologiche.
Perdita degli amminoacidi intracellulari. L’aggiunta di particolari aminoacidi,principalmente la clicina, protegge le cellule ipossiche dal danno di membrana irreversibile in vitro. Ciò suggerisce che la perdita di aminoacidi, che si verifica durante la ipossia, predispone al danno strutturale di membrana. Inoltre la glicina permette alle cellule carenti di ATP
dell’elevata concentrazione di calcio e le mantiene in vita.
Qualunque sia il meccanismo di danno di membrana, la perdita dell’integrità di membrane che deriva provoca entrata di calcio dallo spazio extracellulare. Se per di più il tessuto ischemico viene in qualche misura riperfuso, lo scenario si modifica per l’entrata massiccia del calcio. Il calcio è captato avidamente dai mitocondri dop
inibendo gli enzimi cellulari,denaturando le proteine e causando le alterazioni citologiche caratteristiche della necrosi coagulativa.
danno di membrana è critico per lo sviluppo del danno cellulare letale, e il calcio è un importante mediatore dell’alterazione morfologiche e biochimiche che portano alla morte cellulare. (Fig.8)
figurazione instabile viene liberata durante la reazione
a (Fig.8)
DANNO CELLULARE DA RADICALI LIBERI
I radicali liberi sono specie chimiche che hanno un singolo elettrone spaiato in un orbitale esterno. L’ energia creata da questa con
con molecole vicine, organiche ed inorganiche, proteine, lipidi, carboidrati, in particolare con molecole chiave nelle membrane e con gli acidi nucleici. Sopratutto, i radicali liberi iniziano reazioni autocatalitiche là dove le molecole con cui questi reagiscono vengono a loro volt
La reazione di ossido-riduzione che si verifica durante i normali processi metabolici Metalli di transizione
L’ossido d’azoto
Queste specie reattive hanno molti effetti,ma tre reazioni risultano essere particolarmente importanti per il danno cellulare.
Perossidazione dei lipidi di membrana. In presenza di ossigeno i radicali liberi possono pausare perossidazione dei lipidi di membrana degli organelli. Il danno ossidativo inizia quando i doppi legami degli acidi grassi insaturi dei lipidi di membrana vengono attaccati dai radicali liberi derivati dall’ossigeno in particolare da OH. L’interazione radicali-lipidi porta lla formazione di perossidi, che a lora volta sono instabili e reattivi, e fanno si che si instauri una reazione a catena autocatalitica chiamata propagazione che può dare origine a danno esteso a livello della membrana, degli organelli e della catena. La terminazione di questa serie di reazioni si può
,presente all’interno della membrana cellulare.
odificazione ossidative delle proteine. I radicali liberi promuovono ossidazione delle catene terali dei residui amminoacidici, la formazione di legami crociati fra proteine e l’ossidazione ntazione. L’ossidazione aumenta la degratazione i enzimi importanti ad opera del proteosoma, danneggiando profondamente la cellula.
atici e non che contribuiscono o.
rmazione dei radicali liberi dall’inizio o inattivano i radicali,
no come sistemi di disinnesco dei radicali liberi inattivandogli anioni rossido di idrogeno. verificare quando il radicale libero è catturato da uno “spazzino”(scavenger), come la vitamina E
M la
della catena proteica che ne provoca la framme d
Lesione del DNA. Reazioni con la timina a livelli del DNA nucleare e mitocondriale producono rotture nel filamento singolo di DNA sia implicando l’ invecchiamento del DNA sia nella trasformazione maligna della cellula.
Le cellule hanno sviluppato numerosi meccanismi per rimuovere o minimizzare gli effetti dannosi dei radicali liberi. I radicali liberi sono intrinsicamente instabili e di solito decadono spontaneamente. Ci sono comunque diversi sistemi enzim
all’inattivazione delle reazioni da radicali liberi. Questi comprendon Antiossidanti, che bloccano la fo
bloccando il danno.
Il ferro e il rame possono catalizzaze la formazione di specie reattive dell’ossigeno. Diversi enzimi agisco
Apoptosi
La Morte Cellulare Programmata (PCD) è un programma di autodistruzione, controllato da geni specifici, che da’ come risultato la rimozione di una cellula.
La manifestazione morfologica dell’evento è chiamata apoptosi, dalla parola greca usata per descrivere la caduta dei petali dal fiore morente.
Lo studio dell’apoptosi è importante, poiché tale meccanismo è sia un normale fenomeno fisiologico, sia un meccanismo di difesa nell’ambito dei processi patologici. Si ha apoptosi:
durante lo sviluppo dell’organismo;
nel mantenimento dell’omeostasi o delle popolazioni cellulari all’interno di un tessuto; come meccanismo di difesa nelle reazioni immunitarie;
er rimediare a danni cellulari dovuti ad agenti patogeni o eventi lesivi; el controllo della crescita neoplastica.
’apoptosi è un processo attivo in quanto richiede energia, attività trascrizionale e traduzionale a parte della cellula che muore.
processo apoptotico può esser suddiviso in quattro fasi: - Iniziazione;
- Esecuzione;
- Riconoscimento e fagocitosi del corpo cellulare; - Eliminazione.
iversi sono gli stimoli che possono dare inizio al processo tra i quali sono noti quelli munologici (citochine), la diminuzione dei fattori di crescita, il danno severo del DNA senza ossibilità di riparo (p53) e stimoli chimici o fisico Anche la ridotta disponibilità di molecole di
TP può indurre apoptosi.
ono state individuate tre vie diverse che scatenano l’apoptosi:
prima è operata dal sistema immunitario tramite la proprietà del recettore della morte che ostituisce quella che viene detta via di Fas o CD95L.
p nell’invecchiamento; n L d Il D im p A S la c
Fas è il recettore del membro 6 della super-famiglia del TNF (Tumor Necrosis Factor). Esso iene esposto sulla membrana plasmatica dei linfociti e viene attivato qualora leghi il Fas-ligando
l recettore Fas si tratta del Dominio di morte nenti asi “c”,il cui nome deriva dal fatto che il loro sito attivo di acido
domini regolabili negativi;
a via delle Caspasi costituisce quella che è la via effettrice comune dell’apoptosi. Sono state asi 8, o caspasi iniziatrice viene attivata nella via dei recettori a, e tutto ciò determina l’attivazione caspasi, che hanno come target il taglio del DNA.
llulare descritto costituisce la via estrinseca di apoptosi, dove il ruolo superfamiglia dei TNF associati ai propri iglia dei recettori TNF è composta da circa 20 membri, dei quali i più udiati sono quelli coinvolti nell’apoptosi: FAS, TNF e TRAIL. (Fig.10) v
(membro 6 della super-famiglia del TNF) il quale viene liberato da altre cellule del sistema immunitario.
Quando Fas lega al Fas ligando il complesso recettore-ligando oligomerizza e recluta le proteine adattatrici intracitoplasmatiche, che nel caso de
associato a Fas (FADD), il quale permette il raggiungimento in tale sito delle Caspasi; in particolare della pro-Caspasi 8 e della pro-Caspasi 10. Queste ultime sono proteasi apparte alla famiglia di proteasi delle Casp
contenente cisterne è in grado di tagliare i propri target in prossimità di un residuo aspartico.
Esse tagliano un set ristretto di proteine attivandole per: Rimozione diretta dei
Inattivazione di subunità regolatorie. L
individuate circa 12 caspasi diverse, sintetizzate come procaspasi e attivate in seguito a taglio proteolitico. Ad esempio, la Casp
della morte tramite una attivazione autocatalitica reciproc della cascata delle
Il meccanismo ce
preponderante è svolto dai recettori appartenenti alla ligandi. La superfam
(Fig.10)
La seconda via che causa apoptosi è conosciuta come “Via del mitocondrio”.
Il mitocondrio è il sito di integrazione fra gli stimoli pro ed anti-apoptotici. E’ possibile che i membri della famiglia Bcl 2 regolino l’omeostasi mitocondriale sia direttamente che indirettamente modulando l’attività di altre proteine mitocondriali, ad esempio: VDAC (canale ionico voltaggio dipendente) che è una subunità del poro di transizione detto PTP, la cui apertura permette il rilascio di vari fattori dallo loro localizzazione usuale, lo spazio intermembrana mitocondriale, quali: il Citocromo c, AIF (Fattore Iniziante l’Apoptosi), SMAC/DIABLO endonucleasi G.
Quando si ha danno al DNA, p53 viene indotto e, oltre a bloccare la cellula in G1, promuove l’attivazione della proteina pro-apoptotica Bax della famiglia Bcl 2.
Bax è una proteina citoplasmatica che, una volta attivata, trasloca sulla membrana mitocondriale in forma di dimero fungendo così da poro di membrana del mitocondrio e potendo permettere la fuoriuscita del Citocromo c .
Il Citocromo c liberato nel citoplasma lega al fattore proteico APAF 1 e alla procaspasi 9 formando così il complesso noto col nome di apoptosoma, il quale, una volta attivato, provoca l’attivazione della Caspasi 3 e di conseguenza la cascata proteolitica che ha come target la frammentazione del DNA.
Il mitocondrio, che da’ la via intrinseca di apoptosi svolge un ruolo cruciale perché la PCD possa verificarsi; infatti un gran numero di proteine determinanti la Morte Cellulare Programmata si trovano a livello dello spazio intermembrana mitocondriale (IMS) e tra queste troviamo: il Fattore Iniziante l’Apoptosi (AIF), Smac/DIABLO e il Citocromo c.
I meccanismi mediante il quale si realizza la permeabilizzazione di membrana sono comunque ancora materia di dibattito. E’ chiaro comunque che alcuni membri della famiglia Bcl-2, come Bcl-2 e Bcl-XL diano stimolo anti-apoptotico stabilizzando la funzione di barriera della membrana mitocondriale, mentre i membri della famiglia di Bcl-2 che danno stimolo pro-apoptico come Bax e Bak tendono a far sì che la membrana mitocondriale risulti permeabile. AIF è una flavoproteina con significativa omologia di sequenza con le ossidoreduttasi di piante e
atina e la frammentazione del batteri che una volta attivata induce la condensazione della crom
[Fig.11]
Un’ultima via di apoptosi è nota come “Via del reticolo endoplasmico”.
Il reticolo endoplasmatico è l’organello cellulare ove le proteine acquistano la loro conformazione corretta grazie alla presenza delle proteine chaperone.
Quando però la cellula subisce danni tali per cui le proteine rilasciate dal reticolo non hanno assunto la corretta conformazione finale entra in gioco una proteina responsabile delle proteine “unfolded” (UPR) che può portare la cellula in apoptosi.
Diversi anni fa fu scoperto che nel topo si ha induzione della Caspasi 12 per stress del reticolo. Il passaggio è mediato dalla Calpaina, una proteasi cisterna citosolica che viene attivata dallo ione Ca2+.
La Caspasi 12 agisce sulla pro-Caspasi 3 e la rende attiva.
Il ruolo della Caspasi 12 nelle cellule umane è tuttora materia di dibattito, in quanto il gene umano della Caspasi 12 è interrotto da un frame shift, inoltre presenta un codone di stop prematuro e una sostituzione aminoacidica critica per l’attività della caspasi.
evidenziato che la forma di Caspasi 12 maggiormente trascritta è quella tronca17. Ciò suggerisce che nelle cellule umane si abbia apoptosi indotta per stress del reticolo tramite l’attivazione di un'altra caspasi, che recentemente è stata individuata nella Caspasi 4, dato che nella forma inattiva è localizzata a livello del reticolo endoplasmatico e che subisce il taglio proteolitico che la rende attiva quando la cellula viene trattata con agenti che inducono lo stress del reticolo, ma non con altri induttori di apoptosi. I linfociti T citotossici mediano un meccanismo alternativo di induzione della fase effettrice dell’apoptosi in quanto sono in grado di rilasciare, all’interno delle cellule da eliminare, una serin-proteasi che attiva direttamente le Caspasi.
Una volta subito il taglio proteolitico che le rende attive, le Caspasi si attivano vicendevolmente e il programma di morte procede mediante rapide e sequenziali attivazioni enzimatiche:
taglio della matrice cellulare e delle proteine del citoscheletro;
aumento dell’attività delle transglutaminasi citosoliche con cross linking delle proteine citoplasmatiche;
ndonucleasi di strizione.
re cambia, esponendo la e calcio, che tra l’altro è
ante, poiché tale molecola rappresenta
o di disfacimento con rilascio del suo contenuto che comporterebbe l’attivazione di una e avviene per necrosi.
clivaggio del DNA in frammenti di 50-300 Kb mediante attivazione di e re
E’ da sottolineare che nei primi stadi dell’apoptosi la membrana cellula
fosfatidilserina, sulla superficie esterna della cellula. La translocazione avviene in una fase molto precoce del processo di apoptosi e necessita della presenza di ion
aumentato in maniera moderata all’interno della cellula che ha intrapreso la via di apoptosi, implicando così un flip-flop aspecifico e bidirezionale dei fosfolipidi di membrana. .
L’esternalizzazione della fosfatidilserina è uno step rilev
un segnale per i macrofagi circolanti che, riconoscendo l’anomalia sulla membrana plasmatica, inglobano la cellula senza lasciarne traccia. In questo modo, la cellula non andrà incontro ad un process
(frammentazione del nucleo);
Formazione di estroflessioni citoplasmatiche (blebs) e frammentazione in corpi apoptotici; - Fagocitosi dei corpi apoptotici.
Da quanto descritto si evince che l’apoptosi e la necrosi rappresentano due processi distinti e ben caratterizzati. La necrosi rappresenta una forma di morte cellulare patologica, conseguenza di un danno acuto alla cellula ed è caratterizzata da alcuni eventi specifici quali il rapido rigonfiamento e la lisi cellulare, la perdita precoce dell’integrità di membrana, la dispersione del contenuto citoplasmatico e l’induzione di una risposta infiammatoria.
Necrosi
Il termine necrosi si riferisce ad una gamma di modificazioni morfologiche cellulari in un tessuto ta irreversibilmente.L’aspetto morfologico della necrosi è il risultato di due ne enzimatica della cellula
-la denaturazione delle proteine
asica
vivente, e che sono in gran parte il risultato il risulatato della degradazione enzimatica della cellula danneggia
processi che essenzialmente agiscono insieme: 1-la digestio
2
Gli enzimi catalitici derivano sia dai lisosomi della cellula morta, nel qual caso la digestione enzimatica è detta autolisi, sia dai lisosomi dei leucociti sopraggiunti, ed è allora chiamata eterolisi.
Le cellule necrotiche mostrano: aumento dell’eosinofilia
-aspetto cellulare uniformante più trasparente di quello delle cellule normali Citoplasma vacuato
Calcificazione della cellula morta
La modificazione nucleare si presenza in uno dei tre tipici aspetti, tutti quanti dovuti alla rottura non specifica del DNA:
cariolisi perdita della basofilia della cromatina, una modificazione che probabilmente riflette l’attività DNA
piccosi caratterizzata da riduzione di dimensione del nucleo e aumento della basofilia. In questo caso il DNA si presenta sottoforma di masse solide basofile
carioressi il nucleo picnotico o parzialmente picnotico va incontro a frammentazione Con il passare dei giorni il nucleo della cellula necrotica scompare completamente [Fig.12]
[Fig.12]
lla clinica
dizioni patologiche. llule di andare incontro alla morte tramite apoptosi, rappresenta un elemento
malattie dell’uomo, così come una eccessiva morte cellulare sso o difetto di apoptosi è qui di seguito riportato.
Importanza dell’apoptosi ne
L’apoptosi riveste un ruolo importante nella fisiopatologia di molte con L’incapacità delle ce
patogenetico importante in varie
programmata è responsabile di malattie caratterizzate da perdita cellulare. Un sommario elenco di patologie legate ad ecce
Malattie associate ad incremento dell’apoptosi: AIDS;
Malattie neurodegenerative; indromi mielodisplastiche; Danno ischemico;
Malattie epatiche indotte da tossine.
Qui di seguito sono descritte alcune patologie nelle quali la morte cellulare programmata riveste un ruolo significativo e dove la possibilità di quantificare e monitorizzare tale processo sarebbe importante per misurare l’effetto della terapia oltre che per avere un valido indicatore di prognosi. Rigetto di organi trapiantati
Il rigetto degli organi trapiantati è mediato dai linfociti T dell’ospite i quali inducono apoptosi nell’organo donato.Questo si verifica ad esempio nel polmone trapiantato, dove vasi, bronchioli e epitelio alveolare divengono bersaglio della azione citotossica dei linfociti T. Ma accade anche nel cuore trapiantato ed impone l’adozione di una terapia immunosoppressiva. L’efficacia di questa immunosoppressione viene attualmente valutata attraverso metodiche invasive come biopsie endomiocardiche seriali ed i pazienti nel primo anno vengono sottoposti a questo tipo di
rocedura ripetutamente fino a 15-17 volte.
uore
ome nel cervello anche i cardiomiociti vanno incontro ad apoptosi in risposta ad un danno
osi è un processo favorito da noti fattori di rischio quali ipertensione, diabete, -resistenza, caduta degli estrogeni e infiammazione. Monociti e macrofagi al danno all’endotelio vascolare locale e dalla attivazione del complemento, S
p
C
Infarto del miocardio e danno da riperfusione C
ipossico-ischemico che è insufficiente ad indurre una franca necrosi (regioni periferiche ad un infarto o infarto seguito da riperfusione). Risulta chiaro che agenti in grado di inibire selettivamente l’attivazione della cascata enzimatica dell’apoptosi riducono il grado di infarto, sia nel cuore che nel cervello, in risposta ad un danno ischemico.
Malattia coronaria e aterosclerosi
L’ateroscler
iperlipidemia, insulino attivati, attratti d
infiltrano la parete arteriosa. Con il continuare del processo infiammatorio si realizza la ione di lipidi nel sito danneggiato, formazione di cellule schiumose(macrofagi carichi di
All’interno della placca c’è una significativa involuzione apoptotica ltranti la lesione e cellule muscolari lisce alla base della lesione e, bili,le cellule endoteliali formano il cappuccio della placca. Quest’ultimo n quanto le cellule endoteliali in apoptosi che esprimono PS
ione di proteine e collagene della matrice processi che sono quindi
perdita di sostanza grigia e bianca, è dovuto alla poptosi. Poiché la reale perdita cellulare, in questi pazienti, è graduale (ritardata rispetto
lto) può esserci una finestra terapeutica per inibire (o invertire) precocemente il processo locco farmacologico.
ne periventricolare (leucomalacia eriventricolare), mentre i nati a termine sviluppano la malattia nella sostanza bianca deposiz
lipidi) e infine di un ateroma. di monociti e macrofagi infi nelle placche insta
evento è particolarmente pericoloso i sulla loro superficie hanno trombogeno.
L’angiotensina è un fattore che potenzia l’effetto dei precedenti fattori, ma che agisce anche in modo autonomo. Infatti, esercita effetti diretti sulla proliferazione cellulare, l’ipertrofia, l’apoptosi, sintesi e degradaz
alla base dello sviluppo, della progressione e della stabilità della placca. Altri studi hanno mostrato il ruolo dell’apoptosi nell’insorgenza delle ristenosi suggerendo che essa rappresenti un possibile modulatore di cellularità nelle lesioni che producono una ostruzione vascolare.
Sistema nervoso centrale Ictus
Il danno ipossico-ischemico nell’adulto, con a
all’insu
di morte cellulare programmata attraverso un b
Danno da ischemia/riperfusione in bambini pretermine/termine
Il danno ipossico-ischemico nei bambini pretermine è una delle principali cause di paralisi cerebrale. A causa della immaturità della circolazione cerebrovascolare, i neonati pretermine e a termine manifestano il danno ipossico-ischemico in modo diverso dall’adulto. I bambini pretermine tendono a subire il danno con una distribuzio
travaglio difficile o ritardato potrebbero essere valutati nel sospetto di danno ipossico-ischemico, per identificare i pazienti che possono beneficiare di terapia.
AIDS dementia e malattie neurodegenerative
La progressiva perdita regionale di neuroni è alla base di varie patologie cerebrali come nell’AIDS, nelle encefaliti con o senza demenza AIDS-correlata e nelle malattie neurodegenerative. L’apoptosi neuronale è la caratteristica cardine di malattie come quella di Parkinson, di Huntington e di Alzheimer. Il meccanismo nella gran parte dei casi rimane
a distruzione del tessuto polmonare, associata a gravi malattie acute e croniche, è in parte l’incremento dell’apoptosi delle cellule epiteliali ed endoteliali, che la one della stessa a carico delle cellule infiammatorie, risultano associati a danno acuto
ranuli producendo danno ai si dai fagociti, senza determinare sconosciuto ma nuove scoperte sono state fatte. Nella malattia di Alzheimer ad esempio recenti studi hanno suggerito un legame tra le placche amiloidi e i corpi neurofibrillari e l’apoptosi, precedentemente considerati separati. La (-amiloide sembra infatti capace di attivare le caspasi con tutto ciò che ne consegue
Malattie polmonari infiammatorie
L
mediata dall’apoptosi. Sia riduzi
polmonare/sindromi respiratorie acute, malattie polmonari ostruttive croniche, asma e fibrosi polmonare. I granulociti presenti nel sito infiammatorio possono essere eliminati tramite necrosi o apoptosi. Nel primo caso essi disgregandosi svolgono un effetto chemiotattico su altre cellule infiammatorie ed inoltre rilasciano il contenuto citotossico dei loro g
tessuti. Nel secondo caso invece vengono semplicemente rimos
effetti negativi nel parenchima e nello stroma circostante. Una alterazione nei meccanismi che controllano il tipo di morte cui devono andare incontro queste cellule, risulta cruciale nella patogenesi di questo tipo di patologie infiammatorie.La tomografia computerizzata ad alta risoluzione accresce il riconoscimento e la caratterizzazione di molte patologie di questo tipo come la fibrosi polmonare idiopatica, la polmonite interstiziale desquamativa, la polmonite da pneumocystis carinii, la polmonite interstiziale linfocitaria, la fibrosi in collagenopatie vascolari, la sarcoidosi, le reazioni allergiche o a farmaci, la bronchiolite obliteranteche possono essere così identificate. Queste entità tuttavia necessitano di conferma bioptica per definire il grado di infiammazione necessario per una ottimale gestione del paziente. A questo scopo sono effettuati
ripetuti test di funzione polmonare, lavaggi broncoalveolari e radiografie seriali. Altre circostanze nelle quali l’imaging dell’apoptosi giocherebbe un ruolo importante includono:ARDS, displasia geno nei neonati, fibrosi cistica, asma. In ogni caso
o patologie eterogenee dal punto di vista della prognosi, infatti lcuni pazienti sviluppano solo anemia e mostrano una lunga sopravvivenza con o senza terapia ppano pancitopenia fatale o cambiamenti leucemici con una broncopolmonare, tossicità polmonare all’ossi
l’estensione dell’apoptosi indicherebbe l’efficacia della terapia.
Patologie mielodisplastiche
Le sindromi mielodisplastiche (MDS) sono un gruppo di patologie caratterizzate da pancitopenia periferica con midollo osseo normo o ipercellulato. Si ritiene che questo sia dovuto all’apoptosi delle cellule ematopoietiche del midollo da cui risulta una ematopoiesi inefficace. Molti studi hanno confermato la presenza di un elevato tasso di apoptosi e uno stato proliferativo a livello del midollo. Tuttavia le MDS son
a
di mantenimento, mentre altri svilu
pessima prognosi. La valutazione dell’entità dell’apoptosi dopo terapia rappresenta un valido strumento per stabilire l’efficacia della terapia stessa e un importante indicatore prognostico.
Terapia antineoplastica
L’apoptosi rappresenta il meccanismo con cui si realizzano gli effetti citoriduttivi di alcuni tipi di trattamento come la chemioterapia, la radioterapia,l’immunoterapia. Attualmente la risposta al trattamento viene valutata settimane o mesi dopo il suo inizio in quanto si considera, come parametro di risposta, una modificazione delle dimensioni del tumore parametro che è possibile valutare solo ad una certa distanza dalla fine del trattamento. Questo modo di valutazione dell’effetto terapeutico non consente di stabilire precocemente l’efficacia del trattamento ed il paziente viene esposto, indipendentemente dal risultato, ai pesanti effetti avversi che spesso si accompagnano a queste terapie. Metodi di imaging in vivo, volti a visualizzare precocemente l’apoptosi, potrebbero avere un ruolo importante nella guida terapeutica. Ugualmente, terapie
Recenti evidenze hanno mostrato che esistono vari processi riguardo le modalità di morte cellulare indotta dalla terapia, in relazione alla mitosi e alla progressione del ciclo cellulare. A questo proposito Halicka e il suo gruppo hanno riportano l’esistenza di 3 tipi di apoptosi, distinti in relazione al danno iniziale della cellula, in base alla fase del ciclo cellulare in cui La cellula si ova al momento dello stimolo apoptogeno. Il primo tipo di morte cellulare è l’apoptosi
lule subiscono l’apoptosi durante la stessa fase del ciclo cellulare in
eine d enzimi citoplasmatici, fosfolipidi di membrana e così via. In questo caso si realizza morte per
riodo di tempo; tr
omofasica, nella quale, le cel
cui sono colpite dal danno. Il secondo è l’apoptosi omociclica dove le cellule vanno in apoptosi durante il medesimo ciclo cellulare in cui vengono danneggiate, cioè prima o durante la mitosi. Il terzo tipo è l’apoptosi postmitotica, nella quale, le cellule subiscono l’apoptosi nel ciclo cellulare successivo a quello in cui sono state danneggiate, verosimilmente nella fase G1 o G2 di tale ciclo. Il danno iniziale può essere diviso in 4 gradi di genotossicità e il destino delle cellule è diverso in base all’estensione di questo insulto. Quando le cellule subiscono un grave danno al DNA possono essere indotti diversi tipi di morte cellulare:
Trattamenti con dosi estremamente alte di farmaci antitumorali o radiazioni ionizzanti, non solo inducono danno al DNA, ma hanno effetto anche sulla funzione di altre molecole, come prot e
necrosi entro un breve pe
Se il danno è più debole del precedente, ma comunque irreparabile, la cellula non può continuare a lungo la sua attività vitale e interviene una precoce morte cellulare programmata;
Al contrario, se il danno non è così importante da indurre direttamente la morte cellulare, la progressione del ciclo cellulare si interrompe per ripararlo. Le cellule che non riescono a completare la riparazione o accumulano danni al DNA possono, in entrambe i casi, andare incontro ad apoptosi ritardata, nello stesso ciclo.
In caso di minimo danno al DNA, nessun effetto precoce è evidente e successivamente, un efficace riparazione conduce alla ripresa della normale progressione del ciclo cellulare
Nel trattamento delle neoplasie vengono spesso usate combinazioni terapeutiche che, in base al tipo di interazione farmacologia, possono essere distinte in tre ampie categorie:
Combinazioni basate sull’effetto cooperativo dell’attività dei farmaci;
Combinazioni in cui l’efficacia del farmaco attivo è incrementata dalla concomitante somministrazione di uno inattivo;
Combinazioni di un farmaco attivo con un agente capace di ridurre selettivamente la tossicità del primo.
Queste interazioni possono modificare l’entità del fenomeno dell’apoptosi indotto dalle terapie. Ad esempio la gencitabina e il cisplatino sono farmaci comunemente usati in chemioterapia, tuttavia essi possono causare gravi effetti avversi. La teofillina è un farmaco comunemente usato come anti-asmatico. L’uso di teofillina, nel trattamento del NSLC, consente di aumentare la suscettibilità delle cellule neoplastiche all’apoptosi indotta dal cisplatino e la gencitabina e consente, quindi, di ridurre gli effetti citotossici dei due farmaci, riducendone le dosi.
Alcuni farmaci hanno un ruolo controverso. I glicocorticoidi, ad esempio, sono capaci di indurre apoptosi nelle cellule maligne B linfoidi e per questo sono usati a scopo terapeutico. Sono anche ottimi antinfiammatori e anti-emetici impegati di frequente prima, durante e dopo la chemioterapia dei tumori solidi, per ridurne la tossicità acuta, (nausea, vomito, flogosi). Esistono dati in colture cellulari da cui si evince un possibile effetto anti-apoptotico sulle cellule
altro. Ad esempio, nei linfomi, vari trattamenti hanno
ise, ma certamente invasive poiché necessitano neoplastiche. Gli effetti della chemio e radioterapia sui tumori solidi possono essere, quindi, fortemente antagonizzati dall’effetto antiapoptotico dei GC.
In fine, nei pazienti oncologici, la capacità delle cellule tumorali, di rispondere alla chemioterapia, varia da un tessuto ad un
mostrato essere efficaci, attraverso apoptosi chemio-indotta, sulle cellule tumorali bersaglio.
Metodi di valutazione dell’apoptosi
L’apoptosi può essere valutata in vitro e in vivo.
In vitro:le metodiche di studio in vitro sono prec
del tessuto da studiare che deve essere prelevato.
DNA-elettroforesi: consente di stabilire l’avvenuta frammentazione del DNA che si realizza durante l’apoptosi, separando i vari frammenti su gel in base alle loro dimensioni;
qualsiasi cellula ed anche l’apoptosi.Cambiando parametro da monitorare otteniamo altre informazioni. L’apoptosi può essere ad esempio valutata con l’annessina V, molecola che lega la fosfatidilserina precocemente esposta sul versante esterno della membrana citoplasmatica delle cellule che vanno incontro ad apoptosi. Usando una doppia marcatura (annessina V per legare la fosfatidilserina di membrana ed ethidium bromide che lega il DNA) è possibile riconoscere solo le cellule in apoptosi in quanto esse divengono positive all’annessina V prima di legare l’EB; le cellule negative per entrambe sono cellule integre, mentre quelle positive solo per EB sono cellule morte, ma non tramite apoptosi.
Microscopia elettronica: consente di apprezzare direttamente le modificazioni morfologiche cui vanno in contro le cellule durante l’apoptosi;
TUNEL: consente di visualizzare la frammentazione del DNA delle cellule apoptiche mediante microscopio. L’estremo 3’ terminale del frammento di DNA viene legato ad una molecola dUTP-biotina tramite l’enzima TdT ed a sua volta la dUTP-biotina viene legata all’enzima streptavidina. Aggiungendo il substrato dell’enzima si realizza la reazione tra i due e le cellule in apoptosi si colorano;
In vivo: i metodi di studio in vivo consentono di studiare in maniera non invasiva il processo di
apoptosi nell’animale e nell’uomo.
Allo stato attuale due diverse modalità di studio RM (studio di diffusione e spettroscopia con M) sono state impiegate con successo nello valutazione in vivo dell’apoptosi.
sequenze RM pesate in diffusione sono in grado di rnire preziose informazioni di carattere metabolico, risultando di particolare utilità nello
ffusione è una tecnica di risonanza magnetica in ca si basa sull’impiego di sequenze ultrarapide cazione di tali R
Recenti studi dimostrano che l’impiego di fo
valutazione in vivo dell’apoptosi. Lo studio di di
grado di studiare la diffusività dell’acqua, cioè il movimento casuale microscopico delle molecole d’acqua indotto dall’energia termica. Tale metodi
(eco-planari) ottenute mediante l’impiego di due veloci e potenti gradienti di diffusione bipolari applicati in modo simmetrico all’impulso di radio-frequenza. In virtù dell’appli
gradienti, vi è dapprima un defasamento con successivo rifasamento dei protoni, variabile in rapporto alle variazioni di diffusività dell’acqua che si traduce in variazioni di intensità di segnale. Utilizzando tale tecnologia, Hakumäki e collaboratori hanno dimostrato che in presenza di apoptosi indotta da terapia, si osserva una marcata riduzione del coefficiente di diffusione dei
metaboliti della colina intracellulare ed un significativo incremento della diffusione rapida della componente di acqua extracellulare. Tali risultati, sono probabilmente riferibili sia ad una riduzione numerica e dimensionale delle cellule sia ad una diminuzione del grado di viscosità intracellulare tipico delle cellule apoptotiche.
Recentemente, Hortelano e collaboratori hanno ottenuto risultati simili mediante l’impiego di tecniche di risonanza magnetica spettroscopica (MRS) avvalorando l’ipotesi che la riduzione del volume intracellulare e del numero degli elementi cellulari siano responsabili delle modificazioni osservate nella diffusione di acqua. La MRS è lo studio in vivo di alcune tappe del metabolismo o, ha una propria ed unica frequenza di risonanza e
qua, il più semplice segnale individuabile con tecniche di spectroscopia RM, è sentano il 4-16% del totale e il 20-50% della massa cellulare
microambiente tissutale. Essa si basa sul principio che il nucleo di ciascuna specie chimica 1H, 31P o 13C, anche in assenza di un gradiente di campo magnetic
può, pertanto, essere riconosciuto. La metodica è pertanto in grado di identificare alcuni metaboliti presenti in ambito tissutale, caratterizzati da un basso peso molecolare, sottoforma di uno spettro la cui morfologia dipende essenzialmente dalla loro concentrazione (superiore a 0,1-1 mM).
Dopo l’ac
rappresentato dalla frequenza di risonanza dell’idrogeno del gruppo metile e metilene degli acidi grassi dei trigliceridi. I lipidi rappre
secca in molti tessuti. Tuttavia, le attuali tecniche di spettroscopia RM non sono in grado di rilevare il segnale di risonanza proveniente dai lipidi contenuti in un
sostanzialmente ristretto come la membrana cellulare. Viceversa, la MRS è stata impiegata con buoni risultati per una valutazione del segnale di risonanza proveniente dagli acidi grassi dei tessuti in apoptosi. Studi in vitro dimostrano che l’insorgenza dell’apoptosi è tipicamente associata ad un marcato incremento dei livelli dei gruppi CH2 dei lipidi di membrana rispetto ai gruppi CH3. Tuttavia, tali alterazioni del profilo spettrale lipidico sono sostanzialmente aspecifiche e difficilmente differenziabili rispetto a quelle indotti da processi neoplasitici, fenomeni di attivazione cellulare, proliferazione, necrosi o arresto di crescita.
La PS in condizioni normali è localizzata all’interno della cellula, sul lato citosolico della membrana plasmatici. E’ presente in circolo nei soggetti sani a basse concentrazioni (1 - 6 ng/ml) ed aumenta notevolmente durante la gravidanza. Un tempo chiamata proteina placentare anticoagulante(PAP), perché originariamente isolata nella placenta umana, l’Annessina V è stata
gulante ai normali livelli circolanti e la sua azione fisiologica è sconosciuta. Studi sugli
99mTc attraverso in seguito isolata anche nella muscolatura cardiaca, nell’endotelio vascolare, negli eritrociti, nei linfociti, nei trombociti, nelle cellule gliali, negli oligodendrociti, nelle cellule di Schwann, negli epatociti, nei condrociti, negli osteoblasti e nelle cellule muscolari scheletriche. La struttura di questa molecola è stata scoperta nel 1987: è composta da 319 aminoacidi, ha un peso di 36kDa e contiene quattro ripetizioni interne ciascuna delle quali presenta il sito di legame Ca2+ dipendente con la PS. E’ stato postulato che gli ioni Ca2+ inducono una conformazione della molecola di Annessina V con la formazione di una tasca che è il sito di interazione specifico con la PS. L’Annessina V è stata identificata come anticoagulante che agisce tramite il legame dei fosfolipidi anionici di membrana alle piastrine. Tuttavia non è stato dimostrato alcun effetto anticoa
animali (con dosi fino a 1000 volte superiori a quelle usate nei trials umani) non hanno mostrato effetti statistici o clinici sui parametri della coagulazione PT e aPTT dopo 90 minuti.
Le cellule che vanno incontro ad apoptosi rapidamente ridistribuiscono la PS dal versante interno a quello esterno della membrana plasmatica. Questi cambiamenti si realizzano entro 30-120 minuti dal segnale di apoptosi e prima dell’inizio della degradazione del DNA e della formazione di “blebs”. L’Annessina V ha alta affinità per le cellule o le piastrine che espongono sulla superficie della membrana citoplasmatica PS, sia in vitro che in vivo. Questa osservazione ha determinato lo sviluppo di studi che imiegano Annessina V radiomarcata per valutare l’apoptosi in vitro in linee cellulari di linfoblasti T ed in vivo in modelli animali
L’Annessina V comunemente utilizzata negli studi è ottenuta con tecnica ricombinante(rh-Annessina V), prodotta in E.Coli ed ha la stessa struttura e proprietà di quella isolata dai tessuti dell’uomo.La prima marcatura con radioisotopi della Annessina V è stata con
dei leganti N2S2 (diamino dimercaptide agente chelante bifunzionale). Una evoluzione successiva del metodo ha sostituito il Linker N2S2 con un chelante bifunzionale organico, HYNIC ( succinimidyl (6-hydrazinonicotinic acid)( il quale è legato all’Annessina e al momento della marcatura si lega al radiofarmaco tramite una reazione di coniugazione con
99mTc-Pertecnetato in presenza di agente stannoso. Attraverso tecniche di colorazione immunologica e imaging scintigrafico è stata dimostrata la capacità del 99mTc- HYNIC rh-Annessina V riconosce per legame con la PS i tessuti apoptotici in numerosi modelli cellulari ed animali:
- apoptosi epatica fulminante indotta in topi con anticorpi anti-Fas;
- trapianto di cuore nei ratti prima e dopo il trattamento immunosoppressivo e trapianto di polmone;
- linfoma murino prima e dopo terapia antitumorale; - danno cerebrale ischemico-ipossico in conigli neonati;
danno ipossico-ischemico a carico dei miocardiociti dopo riperfusione; apoptosi associata all’artrite reumatoide
Questi esperimenti indicano che l’esposizione di PS, sulla faccia esterna della membrana cellulare delle cellule in apoptosi, può essere visualizzata in vivo rappresentando un valido strumento per valutare direttamente, in fase precoce, la presenza di morte cellulare programmata. Sono stati eseguiti altri studi per valutare la potenziale tossicità di una singola somministrazione endovenosa di Hynic –Annessina V negli animali. Usando dosi da 20 a 500 volte superiori rispetto a quella da usare nell’uomo(60(g) non sono stati riportati effetti avversi e ciò rassicura
nnessina V e la sua attività sulla maneggevolezza dei farmaci usati e quindi sul uso del test nel uomo.
Recentemente sono divenuti disponibili anche i primi dati dell’impiego della 99mTc-Annessina V nell’uomo. Hofstra et al ha impiegato il radiofarmaco in sette pazienti con documentato infarto acuto del miocardio dimostrando una visualizzazione della necrosi e/o apoptosi dei cardiomoiciti. Similmente Narula at al hanno dimostrato la capacità degli agenti di visualizzazione dell’apoptosi di valutare in modo non invasivo il rigetto al trapianto di cuore. Tale dato è stato confermato da Kown MH at al. che ha valutato la sicurezza d’impiego della 99mTc-A
diagnostica in dieci pazienti con rigetto acuto di trapianto di cuore. L’ 99mTc-Annessina V è stata, inoltre, recentemente impiegata come strumento per visualizzare l’apoptosi indotta dal trattamento con anticorpi anti TNF-alpha (Infliximab) nei linfociti T attivati nei pazienti con
Balhocine et al. hanno condotto uno studio di correlazione tra i risultati della scintigrafia con 99mTc-Annessina V, ed i risultati clinici di pazienti con stadio avanzato di carcinoma polmonare e linfoma, 1-3 giorni dopo il trattamento chemioterapico. Le conclusioni che sono emerse da
ng tramite 99mTc-Annessina dell’Annessina dopo il trattamento, rispetto ai valori precedenti la terapia, predice una l’aumento della captazione dell’Annessina , nei quali si osserva una localizzazione ento. Lo studio, inoltre, nessina sembra essere dipendente dal tempo di iniezione
, i dati dosponibili, questo studio sono molto importanti poiché dimostrano che l’imagi
V può essere compiuto più volte ed in sicurezza e che il significativo incremento dei livelli di captazione
risposta, almeno parziale, alla chemioterapia. Inoltre sembra essere specifico e si osserva nei tumori necrotici
aspecifica del tracciante, sia in condizioni basali che dopo trattam evidenzia che l’aumento di uptake di An
del radiofarmaco dopo l’inizio della terapia.
Quest’ultima problematica è di particolare interesse, poiché il dibattito sui tempi di induzione dell’apoptosi è estremamente aperto.
Il picco di captazione dell’ Annessina V (corrispondente alla espressione di PS), valutato in modelli animali, varia da 1 a più di 20 ore dopo una singola dose di un farmaco preapoptotico. Non ci sono, ad oggi, dati definitivi, di modelli animali o umani, su quando sia meglio realizzare l’imaging con Annessina, dopo l’inizio della chemioterapia. Tuttavia
suggeriscono l’esistenza di almeno due picchi di captazione dell’Annessina, uno precoce che si realizza entro alcune ore dall’inizio della terapia ed uno tardivo, 24-72 ore dopo. Un incremento della captazione di Annessina pari a 2-3 volte il livello basale è stato notato dopo 1 ora dalla somministrazione di un’unica alta dose di ciclofosfamide (150 mg/kg i.p.) in un modello animale di linfoma. Similmente un incremento di captazione di Annessina si è verificato, in cellule miocardiche, 5 ore dopo un iniezione di doxorubicina (10 mg/kg i.p.) Paradossalmente questo incremento transitorio di captazione non si è accompagnato ad una sincrona perdita di cellule tumorali, che si è invece realizzata circa 20 ore dopo il trattamento come confermato da analisi successive. Il significato di questo picco precoce di captazione di Annessina, precedente alla perdita di cellule, non è chiaro, ma può essere in relazione a bassi livelli di apoptosi di cellule in una particolare fase del ciclo cellulare oppure a stress preapoptotico delle cellule tumorali che causa una transitoria espressione di PS e che può o meno essere predittiva della successiva morte per apotosi
Doxorubicina
La famiglia delle antracicline è costituita da farmaci antitumorali in particolare si tratta di antibiotici citotossici, cioè un gruppo di farmaci, isolati per lo più da fonti naturali, la cui azione antineoplastica è dovuta ad una interazione con il DNA, che causa danni all’acido nucleico che comportano l’attivazione dell’apoptosi. Sono molto efficaci ma anche molto tossici dal momento che non sempre riescono a discriminare tra le cellule maligne e le sane .
I primi derivati antraciclinici ad essere scoperti ed utilizzati in terapia, sono stati la daunorubicina (o daunomicina) e la doxorubicina (o adriamicina) che, nei primi anni ’60, vennero isolati da ceppi di Streptomyces peucetius. La daunorubicina è attualmente commercializzata con i nomi di Daunoblastina e Daunoxome, mentre la doxorubicina come Adriblastina, Caelyx e Myocet.
ente ad un amminozucchero (daunosamina).
ze Dal punto di vista strutturale, gli antibiotici antraciclinici sono caratterizzati da una porzione tetraciclica planare, legata glicosidicam
Le strutture molecolari della daunorubicina e della doxorubicina differiscono solamente per uno dei sostituenti terminali. Seppure piccola, tale differenza strutturale ha importanti conseguen sullo spettro di attività dei due antibiotici citotossici. La doxorubicina, infatti, ha applicazioni cliniche di rilievo soprattutto nei tumori solidi (carcinoma mammario, dell’endometrio, delle ovaie, dei testicoli, della tiroide, dei polmoni, Linfoma di Hodgkin e non Hodgkin), mentre la principale indicazione clinica della daunorubicina è la leucemia acuta .
Altri derivati antraciclinici utilizzati sono epirubicina e idarubicina, commercializzati con i nomi di Farmorubicina e Zavedos rispettivamente .
L’epirubicina è un derivato semisintetico della doxorubicina, ottenuto tramite epimerizzazione da assiale ad equatoriale del gruppo idrossilico al C4’ della daunosamina; tale modificazione fa diminuire l’emivita del farmaco .
L’idarubicina deriva dalla daunorubicina per eliminazione del gruppo metossilico al C4; tale antraciclina ha uno spettro d’attività più ampio rispetto alla daunorubicina e ciò potrebbe essere
O O 9 11 14 O OH O O D C B A 4 4' 3' Doxorubicina O OH O O OH OH CH2OH OCH3 O OH O O NH2 HO H3C DOXORUBICINA OCH3 O OH O O H3C DAUNORUBICINA 4 4 4' OH O CH3 NH2 HO
meccanismo con cui le antracicline esplicano la loro attività
:
) intercalazione dentro il DNA determinando l'inibizione della sintesi delle macromolecole;
Mentre in passato si riteneva che il
citotossica fosse dovuto alla sola intercalazione di tali molecole nella struttura del DNA, con conseguente inibizione delle normali attività dell’acido nucleico, attualmente la tendenza è quella di ritenere l’intercalazione sì necessaria ma non sufficiente all’azione antitumorale. Il meccanismo di azione dell’antracicline nelle cellule tumorali non è ancora chiarito e ci sono ipotesi controverse. Le ipotesi sono
(2) formazione di specie reattive di ossigeno (ROS), che portano danni al DNA o perossidazione lipidica;
(3) formazione di DNA vincolante e alchilazione; (4) DNA cross-linking;
(5) interferenza con la duplicazione o separazione del DNA; (6) effetti diretti sulla membrana;
(7) danni del DNA per inibizione della topoisomerasi I
(8) induzione di apoptosi in risposta dell’ inibizione della topoisomerasi II;
Le topoisom rasi sono enzimi nucleari che rilassano il DNA superavvolto attraverso tagli reversibili o ad un singolo filamento del duplex, come fa la topoisomerasi I, o ad entrambi, come fa invece la topoisomerasi II. In entrambi i casi l’elica viene reversibilmente interrotta attraverso la formazione, in modo ATP-dipendente, di un legame fosfodiestereo tra l’OH della tirosina dell’enzima (Tyr805 nella topoisomerasi umana) e il gruppo fosforico del DNA. Il taglio consente all’estremità libera dell’acido nucleico di ruotare, risolvendo il superavvolgimento. A questo punto l’OH dell’estremità libera del DNA può ripristinare la continuità dell’elica attaccando il fosfato attivato.
Attualmente si sa che le antracicline, dopo essersi intercalate nella doppia elica, vanno a localizzarsi all’interfaccia tra il sito attivo della topoisomerasi II e il sito di cleavage del DNA, interagendo pertanto sia con l’uno che con l’altro e ricoprendo una regione di quattro coppie di
asi che vanno dalla posizione –2 alla +2 rispetto al legame fosfodiestereo tagliato.
a loro azione si esplica stabilizzando un complesso di cleavage detto ternario perché formato dal NA, dall’enzima e dal farmaco, in cui le eliche del DNA sono tagliate e legate all’enzima.
I;
e
b L D
Pertanto l’azione del farmaco porta a tagli irreversibili nel DNA che aprono la strada al programma di morte cellulare nelle cellule tumorali. In tal modo le antracicline, trasformando una proteina utile in una tossina che “avvelena” irreversibilmente il DNA, sono anche definite
permeabilità soprattutto dell’ione calcio.Il secondo è la produzione di radicali liberi e di specie reattiva dell’ossigeno attraverso il metabolismo ossido-riduttivo dell’anello antrchinonico.I
A ed inducono per ossidazione dei lipidi di rmeabilità di membrana e la produzione di radicali liberi
ti farmaci.
e cause della cardiotossicità della Doxorubicina non sono state ancora del tutto chiarite. Però
stituito da una porzione 3-ammino-2,3,6-trideossi-L-fucosilica. La
lettrone che radicali liberi prodotti contribuisco al danno al DN
membrana. L’alterazione della pe
potrebbero essere la causa della tossicità cardiaca caratteristica di ques
Cardiotossicità
L
risulta chiaro che le cellula miocardiche vanno incontro a morte per suicidio(apoptosi). Le cause che si sono fatte largo negli ultimi anni sono:
Incremento dello stress ossidativi:la Dox, dal punto di vista strutturale, ha una porzione agliconica e una porzione glucidica. L’aglicone è una struttura tetraciclina con 4 anelli condensati, presenta un chinone sull’anello C adiacente a un idrochinone sull’anello B. Contiene inoltre un gruppo metossile sul C-4, nell’anello D, e una piccola catena al C-9 contenente un gruppo carbonilico.Lo zucchero, chiamato daunosammina, è attaccato tramite legame glicosidico al C-7 e all’anello A ed è co
catena laterale nel C-9 termina con un gruppo ossidrile alcolico primario – CH2OH.
Gli orfanelli bersaglio della cardiotossicità della DOX sono i mitocondri dentro i quali si accumula il farmaco. Gli enzimi mitocondriali (es.NADH deidrogenasi agisce direttamente sulla molecola della Doxorubicina precisamente sull’anello chinolonico liberando un e
viene catturato da agenti ossidanti formando cosi’ un O2-(anione superossido) e H2O2 (perossido d’idrogeno). Queste molecole, pur non essendo radicali di per sé vengono facilmente convertite in radicale idrossilico.Queste specie reattive dell' ossigeno(ROS) danneggiano irreversibilmente il tessuto miocardio. Inoltre nel reticolo endoplasmico il complesso del citocromo P450 può liberare direttamente anione superossido:
O2 - P450(Fe2+)-RH P450(Fe3+)-RH + O2·–
La Doxorubicina può anche agire direttamente inibendo gli enzimi antiossidanti come ad esempio glutammil – cisteinil sitetasi, o glutammato cisteina ligasi che serve per la biosintesi della
