SCOPO DEL LAVORO
MATERIALI E METOD
ono stati studiati 15 gruppi di 4 topi sani maschi Balb/c trattati come segue:
azione di doxorubicina n=8 ( 15 mg/kg ).
pi nella maggior parte
dalla
a resa di marcatura, valutata ogni volta dopo la marcatura mediante cromatografia su colonna 25, è stata dell’85-90 %.
estamibi: Il sestamibi è fornito sottoforma di Kit Cardiolite fornito da Bristol-Myers Squibb S
Balb/c in condizioni basali n=12 senza trattamento;
Balb/c dopo 1 somministrazione di doxorubicina n=8 ( 15 mg/kg ); Balb/c dopo 2 somministrazione di doxorubicina n=8 ( 15 mg/kg ); Balb/c dopo 3 somministrazione di doxorubicina n=8 ( 15 mg/kg ); Balb/c dopo 4 somministr
Trattamento
Ad eccezione dei basali tutti gli altri animali sono stati trattati con Doxorubicina per via intraperitoneale.Durante le prime tre somministrazioni i topi non mostravano segni ed erano apparente in buona salute, mentre durante la quarta somministrazione i to
dei casi morivano e presentavano alopecia in particolare a livello della testa . Per dimostrare il perché della morte,. abbiamo prelevato il cuore, lo abbiamo conservato in formalina. 4% e successivamente inclusi in paraffina per ottenere sezioni al microtomo di 3um di spessore. Per confermare il danno morfologico dovuto alla Doxorubicina abbiamo colorato il preparato con ematossilina ed cosina e osservato al microscopio elettronico i cambiamenti strutturali del miocardio.
Marcatura dei radiotraccianti
AnnessinaV: Per lo studio è stata utilizzata Annessina V umana ricombinante fornita Theseus Imaging Corporation (Boston USA).
La marcatura è stata eseguita incubando in vitro per 30 minuti a temperatura ambiente, 60-90 µg di HYNIC-AnnessinaV diluita in 0,5 ml di soluzione fisiologica, con 20-30 mCi di anione pertecnetato (99mTcO4-) appena eluito da un generatore di 6Gb (Amersham GE HealthCare, UK) aggiungendo di 10-20 µg di agente riducente (cloruro stannoso diidrato (SnCl2-2H2O)) e 1.5 mg di tricina (N[Tris (idrossimetil) metil] glicina) come co-ligando.
L G S
S.r.l.(Italia)
Si procede alla marcatura ricostituendo 1-3 ml di partecnetato sodico(99mTcO4 -)Na e si lascia ffreddamento, si ottineiene un complesso
-ISOBUTIL_ISONITRILE il
razione del radiofarmaco è stata effettuata tramite iniezione in una vena caudale di
o di 180 secondi ciascuno. Sono stati, inoltre, ottenuti standard di dose iniettata da tilizzare, dopo pesatura e conteggio in contatore gamma, per il calcolo della percentuale della tessuto campionato (%ID/g tessuto). La %ID/g tessuto è stata, bollire per dieci minuti a 100
.Dopo ricostituzione con sodio partecnetato e ra
lipofilico cationico monovalente, il 99mTc(MIBI)6-= 2-METOSSI quale risulta essere stabile per circa 10 ore.
Biodistribuzione 99mTc-Annessina
La somminist
0,1 ml di una soluzione contenente 500 uCi di 99mTc-Annessina, corrispondente ad una concentrazione globale di proteina di 4,5 ng per ciascun animale. L’Annessina radiomarcata è stata somministrata, sempre per via e.v. in una vena caudale, nei gruppi di animali balb-c basalemente e negli animali dopo 1,2,3e 4 sttimane di somministrazione di DOX.Un’ora dopo l’iniezione del radiofarmaco. gli animali sono stati anestetizzati e, quindi, sacrificati. Campioni di tiroide, rene, coda, osso, polmone, cuore, muscolo, sangue, stomaco, cute, fegato, milza, intestino, urina, sono stati prelevati immediatamente dopo il decesso e pesati. La radioattività presente in ogni singolo campione è stata misurata mediante contatore gamma (LKG-WALLAC) per un temp
u
dose iniettata per grammo di
quindi, calcolata per ciascun organo considerato per la biodistribuzione.
Biodistribuzione 99mTc-Sestamibi
La somministrazione del radiofarmaco è stata effettuata tramite iniezione in una vena caudale di 0,1 ml di una soluzione contenente 500 uCi di 99mTc-Sestamibi, corrispondente ad una concentrazione globale di proteina di 4,5 ng per ciascun animale. L’Annessina radiomarcata è
intestino, urina, sono stati prelevati immediatamente dopo il decesso e pesati. La radioattività ciascuno. Sono stati, inoltre, ottenuti standard di dose iniettata da
rato per la biodistribuzione.
ilico chiamato 5,5’,6,6’- tracloro-1,1’,3,3’- tetraetilbenzimidadolcarbocianina iodato (JC-1).
ssuto cardiaco fresco mediante un kit insolazione mitocondri presente in ogni singolo campione è stata misurata mediante contatore gamma (LKG-WALLAC) per un tempo di 180 secondi
utilizzare, dopo pesatura e conteggio in contatore gamma, per il calcolo della percentuale della dose iniettata per grammo di tessuto campionato (%ID/g tessuto). La %ID/g tessuto è stata, quindi, calcolata per ciascun organo conside
Western Blot
Per dei campioni di cuore che sono stati congelati e trattati con inibitore della protesi ,al fine di effettuare la corsa elettroforetica per identificare la quantità proteica specifica in ogni cuore.La tecnica del Western Blot è un’estensione dell’elettroforesi sul gel di poliacrilamide, su cui si separano le molecole proteiche presenti nei campioni di cuori in base al loro peso molecolare. In seguito le proteine vengono trasferite ad un filtro di nitrocellulosa che viene poi incubato con un anticorpo specifico (Bcl-2 e P53)per la proteina in esame.
Misurazione del potenziale di membrana mitocondrialeIe
Per determinare il potenziale di membrana mitocondriale si usa un unico catione fluorescente colorato,JC-1 che segna la perdita di potenziale.L’integrità della membrana mitocondriale interna può essere misurato attraverso l’osservazione del gradiente del suo potenziale di membrana( ).
Aquesto scopo viene utilizzato la misura del uptake di un catione lipof te
Sono stati estratti i mitocondri da te
(Sigma) e abbiamo proceduto alla colorazione mediante JC-1. Abbiamo concluso con la lettura dei campioni al citofluorimetro ().
Analisi statistica
I dati di biodistribuzione e di immunofluorescenza nelle differenti condizioni sono espressi come valore medio, mediano e come deviazione standard sia per i diversi organi campionati sia per cuori normali e cuori dopo il trattamento. Inoltre, sono stati calcolati alcuni rapporti di
captazione, Le differenze statistiche sono state valutate attraverso test di tipo non parametrico, quali il Mann Whitney U Test, il Kruskal Wallis, lo Spearman e la procedura di confronto di gruppi di Dunn considerando come significativo p<0,005. Questi test, al pari della maggior parte dei test non parametrici, si basano sui ranghi, ovvero ad ogni elemento viene assegnato un punteggio crescente partendo dal numero 1 che corrisponde al valore più basso. In caso di valori uguali ad ogni campione è assegnato un punteggio che corrisponde al valore medio dei ranghi che
li sarebbero stati assegnati.
n Whitney U è un test basato sui ranghi. Sostituisce alle osservazioni originali i
di due. Il test di Dunn è una procedura he consente di effettuare confronti incrociati diretti tra gruppi quando le grandezze campionarie pearman è una misura statistica non
n la tera greca ρs (rho).
g
L’analisi Man
loro ranghi e focalizza l’attenzione sulla popolazione delle possibili combinazioni dei ranghi. Dal momento che tutti i campioni hanno un numero finito di elementi, per ottenere la distribuzione di tutti i possibili valori del test è sufficiente cercare tutte le possibili modalità con cui i ranghi possono essere attribuiti a ciascun elemento della popolazione. L’ananlisi Kruskal-Wallis è un test non parametrico che equivale al test parametrico dell'analisi della varianza ad una via quando il campione è composto da un numero di gruppi maggiore
c
sono diverse. L'indice di correlazione R per ranghi di S
parametrica della correlazione e misura pertanto il grado di relazione tra due variabili per le quali non si fa altra ip
potesi che non la misura ordinale ma possibilmente continua. Viene indicata solitamente co let
Diversamente dal coefficiente di correlazione lineare di Pearson, non misura una relazione lineare anche qualora venissero usate misure intervallari.
RISULTATI
I risultati relativi alla biodistribuzione della 99m Tc-Sestamibi in topi maschi sani di specie Balb/c in condizioni basali ed a 1, 2,3 e 4 somministrazioni di Doxorubicina,hanno mostrato una diversa captazione del radiofarmaco (Grafico 1). Abbiamo una prevalenza di captazione a livello del fegato che presenta un % ID/g tessuto pari a 11,27% (Media), 9,48 (Mediana) ( 0,0518 basalmente, 17,93%, 15,57 (0,0841 dopo la prima somministrazione di DOX, 23,85%, 25,91%
,64%, 6,30% (0,0155 basalmente, 6,79%, 7,70% (0,0225 dopo la prima a, 7,36%, 7,36% ( 0,04038. Il quinto organo con maggiore captazione è il
, 7,88% ( 0,047 dopo la seconda settimana, ,19%, 2,96% ( 0,0280 dopo la terza settimana, 8,22%, 8,22% ( 0,04956 dopo la quarta mministrazione.Gli altri organi campionati presentano basse percentuali di % ID/g di tessuto in odo riproducibile nei diversi tempi dell’esperimento.
oltre abbiamo dimostrato che i risutati relativi alla biodistribuzione del 99m Tc- Sestamibi in pi maschi sani balb/c in condizioni basali ed 1, 2, 3 e 4 settimane dopo la somministrazione di oxorubicina, non hanno mostrato differenze significative nella analisi dei valori di captazione ei differenti organi come dimostrato attraverso il test di Kruskal Wallis. Ci siamo soffermati sul uore che presenta un % ID/g tessuto pari a 3,72% ( Media), 3,56% (Mediana) ( 0,683 (0,0952 dopo la seconda somministrazione, 4,71%, 3,3,09% (0,0453 dopo la terza somministrazione e 6,26%, 6,26% (0,05378. Il secondo organo con maggiore captazione captazione sono i rene che presentano un % ID/g tessuto pari a 10,10%, 9,77% ( 0,0270 in condizioni basali, 15,02%, 13,55% ( 0,0528 dopo la prima somministrazione di DOX, 16,46%, 17,72% ( 0,0601 dopo la seconda somministrazione, 6,04%, 6,13% ( 0,0229 dopo la terza somministrazione e 20,05%, 20,05% ( 0,02892 dopo la quarta somministrazione. Il terzo organo con maggiore captazione è l’ intestino che presenta un % ID/g tessuto pari a 8,19%, 5,52% (0,0757 basalmente, 23,56%, 20,67% (0,3764 dopo la prima somministrazione, 33,56%, 29,66% ( 0,3022 dopo la seconda settimana, 21,75%, 20,88% ( 0,1660 dopo la terza settimana, 12,49%, 12,49% ( 0,02602. Il quarto organo con maggiore captazione è la tiroide che presenta un % ID/g tessuto pari a 5
somministrazione, 7,72%, 7,05% ( 0,0563 dopo la seconda settimana, 2,69%, 2,18% ( 0,0161 dopo la terza settiman
cuore che presenta un % ID/g tessuto pari a 4,53%, 356% (0,0286 basalmente, 12,30%, 6,17% (0,1168 dopo la prima somministrazione, 8,71%
3 so m In to D n c
basalmente, 7,387%, 6,028% (0,795 dopo la prima somministrazione, 8,379%, 7,387% ( 0,960 opo la seconda settimana, 0,065%, 0,030% ( 0,028 dopo la terza settimana, 0,045%, 0,025% (
nistrazione, 0,38%, 0,37% ( 0,960 dopo la d
0,028 dopo la quarta somministrazione (Grafico ).
I risultati relativi alla biodistribuzione della 99m Tc-Annessina V in topi maschi sani di specie Balb/c in condizioni basali ed a 1, 2,3 e 4 somministrazioni di Doxorubicina,hanno mostrato una diversa captazione del radiofarmaco (Grafico 2). Abbiamo una prevalenza di captazione a livello dei reni che presentano un % ID/g tessuto pari a 0,63% (Media), 0,68 (Mediana) ( 0,025 basalmente, 50,45%, 52,66 (0,15137 dopo la prima somministrazione di DOX, 23,85%, 18,91% (0,2437 dopo la seconda somministrazione, 53.68%, 54,65% (0,2435 dopo la terza somministrazione e 18,57%, 18,57% (0,09727. Il secondo organo con maggiore captazione captazione è la milza che presenta un % ID/g tessuto pari a 0,23%, 0,06% ( 0,0036 in condizioni basali, 4,49%, 4,49% ( 0,00815 dopo la prima somministrazione di DOX, 1,91%, 1,03% ( 0,0220 dopo la seconda somministrazione, 8,98%, 9,06% ( 0,0176 dopo la terza somministrazione e 2,20%, 2,20% ( 0,01660 dopo la quarta somministrazione. Il terzo organo con maggiore captazione è il fegato che presenta un % ID/g tessuto pari a 0,09%, 0,05% (0,0011 basalmente, 3,36%, 3,22% (0,01281 dopo la prima somministrazione1,78%, 1,34% ( 0,01262 dopo la seconda settimana, 7,82%, 7,85% ( 0,0342 dopo la terza settimana, 5,23%, 5,23% ( 0,04578..Gli altri organi campionati presentano basse percentuali di % ID/g di tessuto in modo riproducibile nei diversi tempi dell’esperimento.
Inoltre abbiamo dimostrato che i risutati relativi alla biodistribuzione del 99m Tc- Sestamibi in topi maschi sani balb/c in condizioni basali ed 1, 2, 3 e 4 settimane dopo la somministrazione di Doxorubicina, non hanno mostrato differenze significative nella analisi dei valori di captazione nei differenti organi come dimostrato attraverso il test di Kruskal Wallis. Ci siamo soffermati sul cuore che presenta un % ID/g tessuto pari a 0,01% ( Media), 0,02% (Mediana) ( 0,683 basalmente, 0,78%, 0,83% (0,795 dopo la prima sommi
appartenenti ad animali sacrificati entro la terza e la quarta settimana registrano un incremento del Bcl-2.( Grafico)
Inoltre abbiamo osservato, tramite il catione fluorescente JC-1 un andamento del potenziale di membrana mitocondriale; una diminuzione dei mitotocondri normopolarizzati e un rispettivo aumento dei mitocondri polarizzati. In conclusione,abbiamo osservato che il chico induce morte cellulare già nella prima settimana, come frammentazione e poi nelle settimane successive scompare.