L’apoptosi può essere valutata in vitro e in vivo.
In vitro:le metodiche di studio in vitro sono prec
del tessuto da studiare che deve essere prelevato.
DNA-elettroforesi: consente di stabilire l’avvenuta frammentazione del DNA che si realizza durante l’apoptosi, separando i vari frammenti su gel in base alle loro dimensioni;
qualsiasi cellula ed anche l’apoptosi.Cambiando parametro da monitorare otteniamo altre informazioni. L’apoptosi può essere ad esempio valutata con l’annessina V, molecola che lega la fosfatidilserina precocemente esposta sul versante esterno della membrana citoplasmatica delle cellule che vanno incontro ad apoptosi. Usando una doppia marcatura (annessina V per legare la fosfatidilserina di membrana ed ethidium bromide che lega il DNA) è possibile riconoscere solo le cellule in apoptosi in quanto esse divengono positive all’annessina V prima di legare l’EB; le cellule negative per entrambe sono cellule integre, mentre quelle positive solo per EB sono cellule morte, ma non tramite apoptosi.
Microscopia elettronica: consente di apprezzare direttamente le modificazioni morfologiche cui vanno in contro le cellule durante l’apoptosi;
TUNEL: consente di visualizzare la frammentazione del DNA delle cellule apoptiche mediante microscopio. L’estremo 3’ terminale del frammento di DNA viene legato ad una molecola dUTP- biotina tramite l’enzima TdT ed a sua volta la biotina viene legata all’enzima streptavidina. Aggiungendo il substrato dell’enzima si realizza la reazione tra i due e le cellule in apoptosi si colorano;
In vivo: i metodi di studio in vivo consentono di studiare in maniera non invasiva il processo di
apoptosi nell’animale e nell’uomo.
Allo stato attuale due diverse modalità di studio RM (studio di diffusione e spettroscopia con M) sono state impiegate con successo nello valutazione in vivo dell’apoptosi.
sequenze RM pesate in diffusione sono in grado di rnire preziose informazioni di carattere metabolico, risultando di particolare utilità nello
ffusione è una tecnica di risonanza magnetica in ca si basa sull’impiego di sequenze ultrarapide cazione di tali R
Recenti studi dimostrano che l’impiego di fo
valutazione in vivo dell’apoptosi. Lo studio di di
grado di studiare la diffusività dell’acqua, cioè il movimento casuale microscopico delle molecole d’acqua indotto dall’energia termica. Tale metodi
(eco-planari) ottenute mediante l’impiego di due veloci e potenti gradienti di diffusione bipolari applicati in modo simmetrico all’impulso di radio-frequenza. In virtù dell’appli
gradienti, vi è dapprima un defasamento con successivo rifasamento dei protoni, variabile in rapporto alle variazioni di diffusività dell’acqua che si traduce in variazioni di intensità di segnale. Utilizzando tale tecnologia, Hakumäki e collaboratori hanno dimostrato che in presenza di apoptosi indotta da terapia, si osserva una marcata riduzione del coefficiente di diffusione dei
metaboliti della colina intracellulare ed un significativo incremento della diffusione rapida della componente di acqua extracellulare. Tali risultati, sono probabilmente riferibili sia ad una riduzione numerica e dimensionale delle cellule sia ad una diminuzione del grado di viscosità intracellulare tipico delle cellule apoptotiche.
Recentemente, Hortelano e collaboratori hanno ottenuto risultati simili mediante l’impiego di tecniche di risonanza magnetica spettroscopica (MRS) avvalorando l’ipotesi che la riduzione del volume intracellulare e del numero degli elementi cellulari siano responsabili delle modificazioni osservate nella diffusione di acqua. La MRS è lo studio in vivo di alcune tappe del metabolismo o, ha una propria ed unica frequenza di risonanza e
qua, il più semplice segnale individuabile con tecniche di spectroscopia RM, è sentano il 4-16% del totale e il 20-50% della massa cellulare
microambiente tissutale. Essa si basa sul principio che il nucleo di ciascuna specie chimica 1H, 31P o 13C, anche in assenza di un gradiente di campo magnetic
può, pertanto, essere riconosciuto. La metodica è pertanto in grado di identificare alcuni metaboliti presenti in ambito tissutale, caratterizzati da un basso peso molecolare, sottoforma di uno spettro la cui morfologia dipende essenzialmente dalla loro concentrazione (superiore a 0,1-1 mM).
Dopo l’ac
rappresentato dalla frequenza di risonanza dell’idrogeno del gruppo metile e metilene degli acidi grassi dei trigliceridi. I lipidi rappre
secca in molti tessuti. Tuttavia, le attuali tecniche di spettroscopia RM non sono in grado di rilevare il segnale di risonanza proveniente dai lipidi contenuti in un
sostanzialmente ristretto come la membrana cellulare. Viceversa, la MRS è stata impiegata con buoni risultati per una valutazione del segnale di risonanza proveniente dagli acidi grassi dei tessuti in apoptosi. Studi in vitro dimostrano che l’insorgenza dell’apoptosi è tipicamente associata ad un marcato incremento dei livelli dei gruppi CH2 dei lipidi di membrana rispetto ai gruppi CH3. Tuttavia, tali alterazioni del profilo spettrale lipidico sono sostanzialmente aspecifiche e difficilmente differenziabili rispetto a quelle indotti da processi neoplasitici, fenomeni di attivazione cellulare, proliferazione, necrosi o arresto di crescita.
La PS in condizioni normali è localizzata all’interno della cellula, sul lato citosolico della membrana plasmatici. E’ presente in circolo nei soggetti sani a basse concentrazioni (1 - 6 ng/ml) ed aumenta notevolmente durante la gravidanza. Un tempo chiamata proteina placentare anticoagulante(PAP), perché originariamente isolata nella placenta umana, l’Annessina V è stata
gulante ai normali livelli circolanti e la sua azione fisiologica è sconosciuta. Studi sugli
99mTc attraverso in seguito isolata anche nella muscolatura cardiaca, nell’endotelio vascolare, negli eritrociti, nei linfociti, nei trombociti, nelle cellule gliali, negli oligodendrociti, nelle cellule di Schwann, negli epatociti, nei condrociti, negli osteoblasti e nelle cellule muscolari scheletriche. La struttura di questa molecola è stata scoperta nel 1987: è composta da 319 aminoacidi, ha un peso di 36kDa e contiene quattro ripetizioni interne ciascuna delle quali presenta il sito di legame Ca2+ dipendente con la PS. E’ stato postulato che gli ioni Ca2+ inducono una conformazione della molecola di Annessina V con la formazione di una tasca che è il sito di interazione specifico con la PS. L’Annessina V è stata identificata come anticoagulante che agisce tramite il legame dei fosfolipidi anionici di membrana alle piastrine. Tuttavia non è stato dimostrato alcun effetto anticoa
animali (con dosi fino a 1000 volte superiori a quelle usate nei trials umani) non hanno mostrato effetti statistici o clinici sui parametri della coagulazione PT e aPTT dopo 90 minuti.
Le cellule che vanno incontro ad apoptosi rapidamente ridistribuiscono la PS dal versante interno a quello esterno della membrana plasmatica. Questi cambiamenti si realizzano entro 30-120 minuti dal segnale di apoptosi e prima dell’inizio della degradazione del DNA e della formazione di “blebs”. L’Annessina V ha alta affinità per le cellule o le piastrine che espongono sulla superficie della membrana citoplasmatica PS, sia in vitro che in vivo. Questa osservazione ha determinato lo sviluppo di studi che imiegano Annessina V radiomarcata per valutare l’apoptosi in vitro in linee cellulari di linfoblasti T ed in vivo in modelli animali
L’Annessina V comunemente utilizzata negli studi è ottenuta con tecnica ricombinante(rh- Annessina V), prodotta in E.Coli ed ha la stessa struttura e proprietà di quella isolata dai tessuti dell’uomo.La prima marcatura con radioisotopi della Annessina V è stata con
dei leganti N2S2 (diamino dimercaptide agente chelante bifunzionale). Una evoluzione successiva del metodo ha sostituito il Linker N2S2 con un chelante bifunzionale organico, HYNIC ( succinimidyl (6-hydrazinonicotinic acid)( il quale è legato all’Annessina e al momento della marcatura si lega al radiofarmaco tramite una reazione di coniugazione con 99mTc-
Pertecnetato in presenza di agente stannoso. Attraverso tecniche di colorazione immunologica e imaging scintigrafico è stata dimostrata la capacità del 99mTc- HYNIC rh-Annessina V riconosce per legame con la PS i tessuti apoptotici in numerosi modelli cellulari ed animali:
- apoptosi epatica fulminante indotta in topi con anticorpi anti-Fas;
- trapianto di cuore nei ratti prima e dopo il trattamento immunosoppressivo e trapianto di polmone;
- linfoma murino prima e dopo terapia antitumorale; - danno cerebrale ischemico-ipossico in conigli neonati;
danno ipossico-ischemico a carico dei miocardiociti dopo riperfusione; apoptosi associata all’artrite reumatoide
Questi esperimenti indicano che l’esposizione di PS, sulla faccia esterna della membrana cellulare delle cellule in apoptosi, può essere visualizzata in vivo rappresentando un valido strumento per valutare direttamente, in fase precoce, la presenza di morte cellulare programmata. Sono stati eseguiti altri studi per valutare la potenziale tossicità di una singola somministrazione endovenosa di Hynic –Annessina V negli animali. Usando dosi da 20 a 500 volte superiori rispetto a quella da usare nell’uomo(60(g) non sono stati riportati effetti avversi e ciò rassicura
nnessina V e la sua attività sulla maneggevolezza dei farmaci usati e quindi sul uso del test nel uomo.
Recentemente sono divenuti disponibili anche i primi dati dell’impiego della 99mTc-Annessina V nell’uomo. Hofstra et al ha impiegato il radiofarmaco in sette pazienti con documentato infarto acuto del miocardio dimostrando una visualizzazione della necrosi e/o apoptosi dei cardiomoiciti. Similmente Narula at al hanno dimostrato la capacità degli agenti di visualizzazione dell’apoptosi di valutare in modo non invasivo il rigetto al trapianto di cuore. Tale dato è stato confermato da Kown MH at al. che ha valutato la sicurezza d’impiego della 99mTc-A
diagnostica in dieci pazienti con rigetto acuto di trapianto di cuore. L’ 99mTc-Annessina V è stata, inoltre, recentemente impiegata come strumento per visualizzare l’apoptosi indotta dal trattamento con anticorpi anti TNF-alpha (Infliximab) nei linfociti T attivati nei pazienti con
Balhocine et al. hanno condotto uno studio di correlazione tra i risultati della scintigrafia con 99mTc-Annessina V, ed i risultati clinici di pazienti con stadio avanzato di carcinoma polmonare e linfoma, 1-3 giorni dopo il trattamento chemioterapico. Le conclusioni che sono emerse da
ng tramite 99mTc-Annessina dell’Annessina dopo il trattamento, rispetto ai valori precedenti la terapia, predice una l’aumento della captazione dell’Annessina , nei quali si osserva una localizzazione ento. Lo studio, inoltre, nessina sembra essere dipendente dal tempo di iniezione
, i dati dosponibili, questo studio sono molto importanti poiché dimostrano che l’imagi
V può essere compiuto più volte ed in sicurezza e che il significativo incremento dei livelli di captazione
risposta, almeno parziale, alla chemioterapia. Inoltre sembra essere specifico e si osserva nei tumori necrotici
aspecifica del tracciante, sia in condizioni basali che dopo trattam evidenzia che l’aumento di uptake di An
del radiofarmaco dopo l’inizio della terapia.
Quest’ultima problematica è di particolare interesse, poiché il dibattito sui tempi di induzione dell’apoptosi è estremamente aperto.
Il picco di captazione dell’ Annessina V (corrispondente alla espressione di PS), valutato in modelli animali, varia da 1 a più di 20 ore dopo una singola dose di un farmaco preapoptotico. Non ci sono, ad oggi, dati definitivi, di modelli animali o umani, su quando sia meglio realizzare l’imaging con Annessina, dopo l’inizio della chemioterapia. Tuttavia
suggeriscono l’esistenza di almeno due picchi di captazione dell’Annessina, uno precoce che si realizza entro alcune ore dall’inizio della terapia ed uno tardivo, 24-72 ore dopo. Un incremento della captazione di Annessina pari a 2-3 volte il livello basale è stato notato dopo 1 ora dalla somministrazione di un’unica alta dose di ciclofosfamide (150 mg/kg i.p.) in un modello animale di linfoma. Similmente un incremento di captazione di Annessina si è verificato, in cellule miocardiche, 5 ore dopo un iniezione di doxorubicina (10 mg/kg i.p.) Paradossalmente questo incremento transitorio di captazione non si è accompagnato ad una sincrona perdita di cellule tumorali, che si è invece realizzata circa 20 ore dopo il trattamento come confermato da analisi successive. Il significato di questo picco precoce di captazione di Annessina, precedente alla perdita di cellule, non è chiaro, ma può essere in relazione a bassi livelli di apoptosi di cellule in una particolare fase del ciclo cellulare oppure a stress preapoptotico delle cellule tumorali che causa una transitoria espressione di PS e che può o meno essere predittiva della successiva morte per apotosi
Doxorubicina
La famiglia delle antracicline è costituita da farmaci antitumorali in particolare si tratta di antibiotici citotossici, cioè un gruppo di farmaci, isolati per lo più da fonti naturali, la cui azione antineoplastica è dovuta ad una interazione con il DNA, che causa danni all’acido nucleico che comportano l’attivazione dell’apoptosi. Sono molto efficaci ma anche molto tossici dal momento che non sempre riescono a discriminare tra le cellule maligne e le sane .
I primi derivati antraciclinici ad essere scoperti ed utilizzati in terapia, sono stati la daunorubicina (o daunomicina) e la doxorubicina (o adriamicina) che, nei primi anni ’60, vennero isolati da ceppi di Streptomyces peucetius. La daunorubicina è attualmente commercializzata con i nomi di Daunoblastina e Daunoxome, mentre la doxorubicina come Adriblastina, Caelyx e Myocet.
ente ad un amminozucchero (daunosamina).
ze Dal punto di vista strutturale, gli antibiotici antraciclinici sono caratterizzati da una porzione tetraciclica planare, legata glicosidicam
Le strutture molecolari della daunorubicina e della doxorubicina differiscono solamente per uno dei sostituenti terminali. Seppure piccola, tale differenza strutturale ha importanti conseguen sullo spettro di attività dei due antibiotici citotossici. La doxorubicina, infatti, ha applicazioni cliniche di rilievo soprattutto nei tumori solidi (carcinoma mammario, dell’endometrio, delle ovaie, dei testicoli, della tiroide, dei polmoni, Linfoma di Hodgkin e non Hodgkin), mentre la principale indicazione clinica della daunorubicina è la leucemia acuta .
Altri derivati antraciclinici utilizzati sono epirubicina e idarubicina, commercializzati con i nomi di Farmorubicina e Zavedos rispettivamente .
L’epirubicina è un derivato semisintetico della doxorubicina, ottenuto tramite epimerizzazione da assiale ad equatoriale del gruppo idrossilico al C4’ della daunosamina; tale modificazione fa diminuire l’emivita del farmaco .
L’idarubicina deriva dalla daunorubicina per eliminazione del gruppo metossilico al C4; tale antraciclina ha uno spettro d’attività più ampio rispetto alla daunorubicina e ciò potrebbe essere
O O 9 11 14 O OH O O D C B A 4 4' 3' Doxorubicina O OH O O OH OH CH2OH OCH3 O OH O O NH2 HO H3C DOXORUBICINA OCH3 O OH O O H3C DAUNORUBICINA 4 4 4' OH O CH3 NH2 HO
meccanismo con cui le antracicline esplicano la loro attività
:
) intercalazione dentro il DNA determinando l'inibizione della sintesi delle macromolecole;
Mentre in passato si riteneva che il
citotossica fosse dovuto alla sola intercalazione di tali molecole nella struttura del DNA, con conseguente inibizione delle normali attività dell’acido nucleico, attualmente la tendenza è quella di ritenere l’intercalazione sì necessaria ma non sufficiente all’azione antitumorale. Il meccanismo di azione dell’antracicline nelle cellule tumorali non è ancora chiarito e ci sono ipotesi controverse. Le ipotesi sono
(2) formazione di specie reattive di ossigeno (ROS), che portano danni al DNA o perossidazione lipidica;
(3) formazione di DNA vincolante e alchilazione; (4) DNA cross-linking;
(5) interferenza con la duplicazione o separazione del DNA; (6) effetti diretti sulla membrana;
(7) danni del DNA per inibizione della topoisomerasi I
(8) induzione di apoptosi in risposta dell’ inibizione della topoisomerasi II;
Le topoisom rasi sono enzimi nucleari che rilassano il DNA superavvolto attraverso tagli reversibili o ad un singolo filamento del duplex, come fa la topoisomerasi I, o ad entrambi, come fa invece la topoisomerasi II. In entrambi i casi l’elica viene reversibilmente interrotta attraverso la formazione, in modo ATP-dipendente, di un legame fosfodiestereo tra l’OH della tirosina dell’enzima (Tyr805 nella topoisomerasi umana) e il gruppo fosforico del DNA. Il taglio consente all’estremità libera dell’acido nucleico di ruotare, risolvendo il superavvolgimento. A questo punto l’OH dell’estremità libera del DNA può ripristinare la continuità dell’elica attaccando il fosfato attivato.
Attualmente si sa che le antracicline, dopo essersi intercalate nella doppia elica, vanno a localizzarsi all’interfaccia tra il sito attivo della topoisomerasi II e il sito di cleavage del DNA, interagendo pertanto sia con l’uno che con l’altro e ricoprendo una regione di quattro coppie di
asi che vanno dalla posizione –2 alla +2 rispetto al legame fosfodiestereo tagliato.
a loro azione si esplica stabilizzando un complesso di cleavage detto ternario perché formato dal NA, dall’enzima e dal farmaco, in cui le eliche del DNA sono tagliate e legate all’enzima.
I;
e
b L D
Pertanto l’azione del farmaco porta a tagli irreversibili nel DNA che aprono la strada al programma di morte cellulare nelle cellule tumorali. In tal modo le antracicline, trasformando una proteina utile in una tossina che “avvelena” irreversibilmente il DNA, sono anche definite
permeabilità soprattutto dell’ione calcio.Il secondo è la produzione di radicali liberi e di specie reattiva dell’ossigeno attraverso il metabolismo ossido-riduttivo dell’anello antrchinonico.I
A ed inducono per ossidazione dei lipidi di rmeabilità di membrana e la produzione di radicali liberi
ti farmaci.
e cause della cardiotossicità della Doxorubicina non sono state ancora del tutto chiarite. Però
stituito da una porzione 3-ammino-2,3,6-trideossi-L-fucosilica. La
lettrone che radicali liberi prodotti contribuisco al danno al DN
membrana. L’alterazione della pe
potrebbero essere la causa della tossicità cardiaca caratteristica di ques
Cardiotossicità
L
risulta chiaro che le cellula miocardiche vanno incontro a morte per suicidio(apoptosi). Le cause che si sono fatte largo negli ultimi anni sono:
Incremento dello stress ossidativi:la Dox, dal punto di vista strutturale, ha una porzione agliconica e una porzione glucidica. L’aglicone è una struttura tetraciclina con 4 anelli condensati, presenta un chinone sull’anello C adiacente a un idrochinone sull’anello B. Contiene inoltre un gruppo metossile sul C-4, nell’anello D, e una piccola catena al C-9 contenente un gruppo carbonilico.Lo zucchero, chiamato daunosammina, è attaccato tramite legame glicosidico al C-7 e all’anello A ed è co
catena laterale nel C-9 termina con un gruppo ossidrile alcolico primario – CH2OH.
Gli orfanelli bersaglio della cardiotossicità della DOX sono i mitocondri dentro i quali si accumula il farmaco. Gli enzimi mitocondriali (es.NADH deidrogenasi agisce direttamente sulla molecola della Doxorubicina precisamente sull’anello chinolonico liberando un e
viene catturato da agenti ossidanti formando cosi’ un O2-(anione superossido) e H2O2 (perossido d’idrogeno). Queste molecole, pur non essendo radicali di per sé vengono facilmente convertite in radicale idrossilico.Queste specie reattive dell' ossigeno(ROS) danneggiano irreversibilmente il tessuto miocardio. Inoltre nel reticolo endoplasmico il complesso del citocromo P450 può liberare direttamente anione superossido:
O2 - P450(Fe2+)-RH P450(Fe3+)-RH + O2·–
La Doxorubicina può anche agire direttamente inibendo gli enzimi antiossidanti come ad esempio γ-glutammil – cisteinil sitetasi, o glutammato cisteina ligasi che serve per la biosintesi della γ-
glutammil cisteinil glicina(GHS).
Per ciò che riguarda le proteine, gli aminoacidi più sensibili sono la Prolina, l’Arginina e l’Istidina, le cui modificazioni tendono a frammentare le catene 13 aminoacidiche. Inoltre il danno ossidativo può causare la formazione di legami crociati tra due o più proteine, mediante l’ossidazione di gruppi
sulfidrilici delle cisteine. Nell’insieme queste alterazioni comportano l’abolizione della funzione adazione delle proteine danneggiate. E’ stata dimostrata la sensibilità di alcuni nzimi, tra i quali l’aconitasi mitocondriale, all’anione superossido. L’inibizione dell’attività
ausano il ca di queste proteine. Diversi enzimi del
reazione: e la prematura degr
e
dell’enzima è dovuta al rilascio di ferro libero dal dominio catalitico. Le metalloproteine (emoproteine, Cu/Zn SOD) sono sensibili a elevati livelli fisiologici di H2O2 che c
rilascio di ioni metallo e la perdita dell’attività biologi
ciclo di Calvin (fruttosio bisfosfatasi, gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi) sono direttamente inattivati dall’H2O2, che ossida i gruppi tiolici importanti per la funzionalità di
questi enzimi.
La perossidazione lipidica è considerata la principale fonte di danno da ROS: il processo è costituito da una serie di reazioni a catena di iniziazione, propagazione e terminazione che destabilizzano la struttura del doppio strato fosfolipidico delle membrane e portano alla formazione di prodotti tossici
come le aldeidi. Particolarmente suscettibili alla perossidazione sono gli acidi grassi poliinsaturi (PUFA, PolyUnsaturated Fatty Acids) come l’acido linoleico ed arachidonico. Le reazioni di iniziazione coinvolgono i gruppi metilenici dei PUFA con una specie radicalica, portando alla formazione di lipoperossidi e idroperossidi o coniugati dieni:
PUFA H + X · PUFA · + X- H ;
PUFA · + O 2 → PUFA- OO · ;
PUFA- O • + PUFA- H → PUFA- OH + PUFA •.
ento della doppia elica in seguito alla formazione di idantoine, glicoli,
dei
ellulare. Sebbene inattivata da agenti ossidanti,29 il complesso risulta
o, costitutivamente attivo: è quanto n che presenta una serina al posto della cisteina, suggerendo che un punto di
cellulare è proprio la regolazione redox dei fattori trascrizionali.30 Facilmente o invece i fattori trascrizionali del tipo “Zinc-Finger” e “Zinc- zione con lo Zinco può del dominio di legame al DNA. Una
la tioredossina, Ref-1 è in grado di odo la loro attività, in L’esito finale è la completa scompaginazione del doppio strato lipidico delle mem牢湡
brane.
Infine, i danni al DNA, particolarmente da parte del radicale idrossilico, si evidenziano nella