settimana 2 settimane 3 settimane 4 settimana

DISCUSSIONE

La Doxorubicina (DOX) fa parte della famiglia delle antracicline ed è stata isolata per la prima volta nel 1960 da fonti naturali più precisamente dal batterio Streptococco peucetius insieme con la Daunorubicina (DNR). Oggi le antracicline rimangono uno dei farmaci che hanno maggiore effetto antitumorale. La DOX è usata per il trattamento sia dei tumori solidi sia per quelli ematologici in particolare il Linfoma di Honking e Linfoma non Honking. L’utilizzo di questo farmaco negli ultimi anni è diminuito per i suoi gravi effetti collaterali in particolare a livello cardiaco.

Il meccanismo di azione dell’antracicline nelle cellule tumorali rimane sconosciuto si ipotizza che il farmaco agisca tramite:

1 Intercalazione nel DNA che comporta un’inibizione della sintesi delle macromolecole;

2 Generazione delle specie reattive dell’ossigeno (ROS) con conseguente danno al DNA o perossidazione dei lipidi.

3 effetti diretti sulla membrana cellulare

4 danno iniziale al DNA tramite inibizione della Topoisomerasi II e conseguente induzione dell’apoptosi.

meccanismo responsabile della cardiomiopatia indotta da DOX rimane sconosciuta e sebbene umerosi meccanismi sono stati proposti; studi recenti supportano l’evidenza che il ruolo

eggiore nella patogenesi della cardiotossicità sia a carico di un incremento nello stress ssidativo e perossidazione dei lipidi in concomitanza con una riduzione degli antiossidanti e ruppi sulfidrilici.

cardiotossicità della DOX sono i mitocondri dove il farmaco si ccumula con il tempo: la concentrazione intracellulare di DOX è infatti circa 2 ordini di randezza più alta rispetto alla concentrazione extracellulare nelle colture. A livello plasmatici la oncentrazione della DOX è circa uguale 0,5 1(M.mentre la concentrazione intramitocondriale Il

n m o g

L’ organello bersaglio della a

g c

dell’inattivazione di proteine ed enzimi localizzate nel retico sarcoplasmatico cardiaco e a livello ella catena respiratoria dei mitocondri.

si attivo che necessità di energia fornita dalla molecola di ATP per consentire la durante li sviluppo embrionale, nel mantenimento dell’omeostasi,

ente ad cui si registra un aumento di apoptosi (es. AIDS, malattie

malattie in cui l’apoptosi viene inibita (es.neoplasia e ti indicano che l’apoptosi dei cardiomiociti indotta da DOX sia una delle cause

. d

La causa principale della suscettibilità del muscolo cardiaco al danno indotto da ossidanti sembra essere la presenza di bassi livelli di catalasi nei miociti e una rapida in attivazione dell’enzima glutatione perossidasi -1 selenio dipendente (GPx1).

L’incremento dello stress ossidativo attiva l’apoptosi nei cardiomiociti tramite la via intrinseca dipendente dai mitocondri.

L’apoptosi è il meccanismo mediante il quale la cellula è in grado di andare in contro morte. E’ un proces

trascrizione dei geni pro-apoptotici e la successiva sintesi proteica. Si manifesta come normale evento fisiologico, ad esempio

nell’invecchiamento e come meccanismi di difesa in risposta al danno cellulare consegu agenti patogeni .

Esistono patologie in

neurodegenerative e danno ischemico) e malattie autoimmuni).

Ricerche recen

principali dello scompenso cardiaco che si osserva a seguito di un lungo trattamento con il chemioterapico. Il trattamento con Dox causa la morte cellulare dei miociti per apoptosi tramite l’attivazione delle caspasi e della degradazione del DNA a livello internucleosomale.Questo è importante perché la perdita dei miocardiociti può essere la causa iniziale o l’aumento dello scompenso cardiaco

Lo scopo del nostro lavoro è stato quello di analizzare i cambiamenti fisiologici e biochimici del singolo miocardiocità a seguito di somministrazione cronica fino a quattro settimane di DOX in un modello animale. I metodi impiegati per tale studio:

- Biodistribuzione di 99mTc-Sestamibi e di 99mTc-Annessina V; -“Western blot” per Bcl-2;

-Misura del potenziale di membrana mitocondriale (catione fluorescente JC-1); -Frammentazione del DNA (Apoptosi) mediante gel elettroforesi

fissazione intracellulare. L’ analisi della biodistribuzione del 99mTc-Sestamibi ha evidenziato un andamento non costante della captazione del radiofarmaco nel cuore. Entro le prime due

lla biodistribuzione del 99m Tc- Annessina V ha evidenziato un

imo uptake del 99m Tc- AnnessinaV) e un danno cronico che induce la cellula

tesi è stato valutato come indicatore di apoptosi sia l’espressione del Bcl-

ane il cuore tende ad aumentare il Bcl-2 come

incipale meccanismo di danno cellulare è terazione del farmaco con la settimane di trattamento con DOX si assiste,infatti, ad un incremento di captazione, mentre nelle ultime due settimane la captazione decrementa con valori al di sotto di quelli dell’animale non trattato.

L’99m Tc-Annessina è un radiofarmaco in grado di legarsi selettivamente alle cellule in apoptosi.Anche l’analisi de

andamento non costante della captazione del radiofarmaca nel cuore. Entro la prima settimana di trattamento con la DOX si osserva la massima captazione mentre nelle settimane successive i valori tornano come quelli dell’animale non trattato.

L’ andamento della captazione dei due radiofarmaci ci ha fatto ipotizzare l’esistenza di un danno precoce del miocardiocita che induce la cellula a morte per apoptosi entro la prima settimana di trattamento( mass

miocardica a necrosi nelle ultime settimane di trattamento( minimo uptake sia del 99m Tc- Annessina e 99m Tc- sestamibi).

A sostegno di questi ipo

2 sia l’analisi della frammentazione del DNA a vari tempi di trattamento sia analisi del potenziale di membrana mitocondriale.

Il Bcl-2 appartiene a una famiglia di 30 proteine che possono essere suddivisi in due gruppi in basa alla loro funzione pro- o- apoptotica. Nel nostro esperimento abbiamo osservato un decremento del Bcl-2 entro la seconda settimana mentre un incremento dell’espressione nelle due settimane successive. Nelle ultime settim

meccanismo di protezione dall’insulto apparentemente senza risultato.

La Doxorubicina è un chemioterapico molto utile la cui maggiore limitazione è lo sviluppo della cardiotossicità. Recenti studi hanno dimostrato che il pr

miocardiocita è un tipo cellulare altamente suscettibile al danno del DNA indotto da ROS.

Nel nostro esperimento per osservare il danno da DNA solo nella prima settimana abbiamo effettuato la ricerca della frammentazione del DNA mediante gel elettroforetico. La Frammentazione del DNA si osserva solo nel tessuto dell’animale dopo una sola settimana di trattamento.

ità del poro di transizione detto PTP, la cui

optotica Bax della famiglia Bcl 2.

ciale perché la PCD possa Vari studi hanno dimostrato che l’apoptosi secondaria al trattamento con Dox è tipo tipo mitocondriale. Il mitocondrio è il sito di integrazione fra gli stimoli pro ed anti-apoptotici. E’ possibile che i membri della famiglia Bcl 2 regolino l’omeostasi mitocondriale sia direttamente che indirettamente modulando l’attività di altre proteine mitocondriali, ad esempio: VDAC (canale ionico voltaggio dipendente) che è una subun

apertura permette il rilascio di vari fattori dallo loro localizzazione usuale, lo spazio intermembrana mitocondriale, quali: il Citocromo c, AIF (Fattore Iniziante l’Apoptosi), SMAC/DIABLO endonucleasi G.

Quando si ha danno al DNA, p53 viene indotto e, oltre a bloccare la cellula in G1, promuove l’attivazione della proteina pro-ap

Bax è una proteina citoplasmatica che, una volta attivata, trasloca sulla membrana mitocondriale in forma di dimero fungendo così da poro di membrana del mitocondrio e potendo permettere la fuoriuscita del Citocromo c .

Il Citocromo c liberato nel citoplasma lega al fattore proteico APAF 1 e alla procaspasi 9 formando così il complesso noto col nome di apoptosoma, il quale, una volta attivato, provoca l’attivazione della Caspasi 3 e di conseguenza la cascata proteolitica che ha come target la frammentazione del DNA.

Il mitocondrio, che da’ la via intrinseca di apoptosi svolge un ruolo cru

verificarsi; infatti un gran numero di proteine determinanti la Morte Cellulare Programmata si trovano a livello dello spazio intermembrana mitocondriale (IMS) e tra queste troviamo: il Fattore Iniziante l’Apoptosi (AIF), Smac/DIABLO e il Citocromo c.

I meccanismi mediante il quale si realizza la permeabilizzazione di membrana sono comunque ancora materia di dibattito. E’ chiaro comunque che alcuni membri della famiglia Bcl-2, come Bcl-2 e Bcl-XL diano stimolo anti-apoptotico stabilizzando la funzione di barriera della membrana mitocondriale, mentre i membri della famiglia di Bcl-2 che danno stimolo pro-

apoptico come Bax e Bak tendono a far sì che la membrana mitocondriale risulti permeabile.

di membrane interna mediamte la colorazione con un catione fluorescente (JC-1).

tilizzo.

macologica ha fino ad oggi

l’ertropietina, il fattore stimolante le colonie dei granulociti e la

ime 2 settimane di trattamento con Dox.

o di nuovi farmaci utili per AIF è una flavoproteina con significativa omologia di sequenza con le ossidoreduttasi di piante e batteri che una volta attivata induce la condensazione della cromatina e la frammentazione del DNA a 50 Kbp.Nel nostro esperimento per dimostrare questo abbiamo valutato il potenziale mitocondriale

La percentuale di mitocondri normopolarittati diminuisce con l’andare delle settimane di trattamento con DOX e contemporaneamente abbiamo un aumento della percentuale di mitocondri depolarizzanti.Se correliamo questo dato con quello della biodistribuzione del 99m Tc- setamibi osserviamo che nelle ultime due settimane di trattamento la membrana mitocondriale ha avuto un danno cosi’ prottrato da portare la cellula miocardia a necrosi.

In conclusione possiamo osservare che:

La cardiotossicità della Doxorubicina, un chemioterapico molto efficace per sua azione antineoplastica, ha limitato il suo u

Il meccanismo fisiopatologico della cardiotossicità determinata dalla Doxorubicina è prevalentemente sconosciuto. Per tale motivo nessuna terapia far

potuto limitare l’effetto cardiotossico della Doxorubicina. Recenti studi hanno evidenziato risultati promettenti mediante utilizzo di terapia adiuvente composta da una combinazione citochine emopoietiche, quali

trombopoietina.

ll nostro studio ha dimostrato che l’utilizzo dei traccianti 99mTc-Sestamibi e 99mTc-Annessina V è indicato per lo studio del danno cardiaco da DOX evidenziando che il danno precoce cardiaco avviene entro le pr

Il nostro modello animale con trattamento cronico di DOX ha evidenziato che il danno precoce induce la cellula miocardica a morte per apoptosi entro la prima settimana mentre il danno protratto cronicamente induce la cellula cardiaca a necrosi.