La proteinuria nel cane e nel gatto: valutazione della microalbuminuria

Testo completo

(1)UNIVERSITA’ DI PISA FACOLTA’ DI MEDICINA VETERINARIA CORSO DI LAUREA SPECIALISTISCA IN MEDICINA VETERINARIA. Tesi di Laurea:. “La proteinuria nel cane e nel gatto:. valutazione della microalbuminuria” Relatore: Prof.ssa Grazia Guidi Candidato: Ilaria Giudici Correlatore: Prof. Roberto Papini. Anno Accademico 2005/2006. 1.

(2) Dedico questo lavoro a mio padre, che sarà sempre con me nel mio cuore.. 2.

(3) RIASSUNTO Parole chiave: cane, gatto, urine, proteinuria, microalbuminuria. Con il termine di microalbuminuria si intende un escrezione giornaliera di albumina compresa tra 1.0 e 30 mg/dl. Tale concentrazione non è rilevabile mediante l’impiego delle tradizionali strisce reattive. In medicina umana è stato dimostrato che la microalbuminuria è un valido parametro per predire l’instaurarsi di una proteinuria ed è usato per diagnosticare precocemente stati iniziali di insufficienza renale. In medicina veterinaria gli strumenti a disposizione per valutare la funzionalità renale sono costituiti dall’analisi di alcuni parametri come creatinina e urea plasmatica, peso specifico urinario che non appaiono alterati fino a che non sono stati persi da un punto di vista funzionale all’incirca il 70% dei nefroni. La capacità di identificare la malattia renale precocemente potrebbe permettere di effettuare una terapia capace di rallentare la progressione a insufficienza renale. Lo scopo di questo studio è stato quello di valutare un test semiquantitativo per identificare nelle urine di cane e gatto la presenza della microalbuminuria. Sono stati raccolti campioni di urina da 45 cani e da 15 gatti mediante minzione spontanea o cistocentesi o cateterismo sui quali è stato effettuato, oltre al test in esame, l’analisi con strisce reattive, la valutazione quantitativa delle proteine urinarie e relativo calcolo UP/UC, ed un’analisi qualitativa con SDS-PAGE elettroforesi. ABSTRACT Key words: dog, cat, urine, proteinuria, microalbuminuria. Microalbuminuria is defined as a urinary albumin concentration between 1.0 and 30 mg/dl. This concentration is undetectable with conventional urine dipsticks. In humans, it has been shown that microalbuminuria is a consistent predictor of proteinuria and is used to predict early renal disease. In veterinary the tools usually used to estimate the renal functionality are plasmatic creatinine, urea and urine specific gravity that are not altered until 70% of total nephrons has functionally been lost. The ability to identify precociously might make possible the implementation of therapies to slow the progression to renal failure. The purpose of this study is evaluation of a semiquantitative test to identify microalbuminuria in urine of dogs and cats. Urine samples were collected from 45 dogs and 15 cats by spontaneous urination or by cystocentesis or by urethral catheterisation. In addition to the test, On these samples were executed analysis with a commercial dipstick, a quantitative evaluation of urinary proteins and relative calculus UP/UC, and a qualitative analysis with SDS-PAGE electrophoresis. 3.

(4) INDICE. PARTE GENERALE. Introduzione................................................................................................................7 CAPITOLO 1 – Richiami di anatomia e di fisiologia................................................9 1.1 .Struttura del glomerulo........................................................................................9 1.2 .Filtrazione glomerulare e riassorbimento tubulare............................................11 1.3 .Concentrazioni proteiche nell’urina...................................................................15 1.4 .Proteine presenti nelle urine...............................................................................20 CAPITOLO 2 – Patologie provocate da lesioni renali dirette dovute ad agenti infettivi......................................................................................................................21 2.1 Lesioni dirette provocate da agenti infettivi.......................................................21 2.2 Lesioni immunomediate......................................................................................24 2.3 Lesioni dovute a cause emodinamiche...............................................................27 2.4 Lesioni dirette provocate da varie sostanze e disfunzioni endocrine................28 2.5 Meccanismi patogenetici della proteinuria nelle nefropatie...............................32 CAPITOLO 3 – Classificazione della proteinuria...................................................34 CAPITOLO 4 – Determinazione quanti-qualitativa della proteinuria......................44 4.1 Metodi semiquantitativi......................................................................................47 4.1.1 Strisce reattive..................................................................................................47 4.1.2 Prova turbidometrica con acido solfosalicilico o acido acetico......................49 4.2 Metodi quantitativi..............................................................................................51 4.2.1 Contenuto proteico nelle 24 h e rapporto UP/UC............................................53 4.3 Metodi qualitativi................................................................................................58. 4.

(5) 4.3.1 Immunodiffusione............................................................................................59 4.3.2 Tecniche elettroforetiche.................................................................................61 4.3.2.1 Elettroforesi zonale.......................................................................................62 4.3.2.1.1 Concentrazione del campione....................................................................64 4.3.2.1.2 Utilizzo di coloranti ad elevata sensibilità associati a tamponi ad alta risoluzione.................................................................................................................64 4.3.2.1.3 Immunofissazione......................................................................................67 4.3.3 SDS-elettroforesi..............................................................................................68 4.3.3.1 SDS-PAGE...................................................................................................70 4.3.3.2 SDS-AGE......................................................................................................77 4.3.4 Isoelettrofocalizzazione (IEF)..........................................................................79 4.3.4.1 IEF verticale su colonna................................................................................81 4.3.4.2 IEF su gel orizzontale...................................................................................81 4.3.4.3 Rivelazione e identificazione........................................................................82 4.3.5 Metodo CSI (Cross Star Immunofixation)...................................................... 83 4.3.6 FAST GEL NEFRO (BIOCI)......................................................................... 85 4.3.6.1 Principio del metodo FAST-GEL.................................................................86 4.3.7 Western blotting...............................................................................................87 4.4 Localizzazione della proteinuria.........................................................................87 CAPITOLO 5 – Microalbuminuria...........................................................................91 5.1 Cause di microalbuminuria.................................................................................93 PARTE SPERIMENTALE CAPITOLO 6 – Materiali e metodi..........................................................................96 6.1 Strisce reattive.....................................................................................................98 6.2 Determinazione quantitativa delle proteine urinarie...........................................98 6.2.1 Contenuto.........................................................................................................98 5.

(6) 6.2.2 Procedura.........................................................................................................99 6.3 Determinazione della creatinina urinaria..........................................................100 6.3.1Contenuto........................................................................................................100 6.3.2 Procedura.......................................................................................................101 6.4 Esecuzione del test E.R.D. HealthScreen.........................................................102 6.5 Esecuzione dell’elettroforesi SDS-PAGE in gel di poliacrilamide..................104 6.6 Analisi statistica................................................................................................108 6.7 Segnalamento....................................................................................................115 6.8 Motivo della visita............................................................................................117 CAPITOLO 7 – Risultati.......................................................................................120 7.1 Analisi con le strisce reattive............................................................................120 7.2 Rapporto UP/UC...............................................................................................122 7.3 E.R.D. HealthScreen test..................................................................................123 7.4 Elettroforesi.......................................................................................................125 7.5 Analisi statistica................................................................................................126 7.5.1 Analisi statistica delle strisce reattive............................................................126 7.5.2 Analisi statistica del rapporto UP/UC............................................................128 7.5.3 Analisi statistica dell’E.R.D. HealthScreen test.............................................130 7.5.4 Utilizzo contemporaneo di due test di screening...........................................133 CAPITOLO 8 – Discussione e conclusioni............................................................136 8.1 Discussione.......................................................................................................136 8.2 Conclusioni.......................................................................................................145 BIBLIOGRAFIA....................................................................................................148 RINGRAZIAMENTI..............................................................................................151. 6.

(7) INTRODUZIONE In questi ultimi anni all’interno dell’approccio clinico al paziente a rischio di danno renale, sta acquisendo progressivo interesse la determinazione della microalbuminuria. In campo veterinario, come indagini routinarie per valutare la funzionalità renale, vengono effettuate analisi delle urine mediante l’impiego di strisce reattive unite al dosaggio del tasso di urea e di creatinina ematica. Sfortunatamente tali valori ematici tendono ad innalzarsi quando è stato perso all’incirca il 70-75% della funzionalità renale. Molto spesso, quindi, il danno renale è troppo avanzato per effettuare un intervento medico che migliori significativamente la situazione. Avere quindi la possibilità di usufruire di un parametro, come la microalbuminuria, che identifichi precocemente una nefropatia può far sì che si possano attuare interventi terapeutici atti a rallentare la progressione. La proteinuria è uno dei sintomi più frequenti e precoce di alterazione della funzionalità renale, una corretta interpretazione qualitativa e quantitativa delle proteine nelle urine è indispensabile a diagnosticare la sede e la gravità di un processo morboso e a valutarne l’evoluzione nel tempo. Con il termine di microalbuminuria si intende l’escrezione giornaliera di albumine compresa tra 1,0 e 30,0 mg/dl. Questa concentrazione non 7.

(8) è indagabile con le strisce reattive normalmente utilizzate per l’analisi delle urine. Metodiche per indagare tali livelli di proteinuria esistono, ma oltre ad essere costosi, richiedono tempo per essere effettuati e non avrebbe senso eseguirli su campioni risultati negativi all’indagine routinarie mediante strisce reattive, perché si correrebbe il rischio di impiegare risorse e tempo per poi giudicare il soggetto sano. Ultimamente invece si sono resi disponibili sul mercato dei kit in grado di indagare in maniera semplice e veloce la microalbuminuria, che potrebbero aprire la strada ad una più precoce individuazione di alterazione della funzionalità renale. Scopo del nostro lavoro è quello di verificare la validità di test del commercio per la valutazione della microalbuminuria del cane e del gatto in confronto a determinazioni quali-quantitative più complesse.. 8.

(9) Capitolo 1: Richiami di anatomia e di fisiologia 1.1 Struttura del glomerulo L’unità funzionale e anatomica del rene è il nefrone, composto dal glomerulo, in cui il sangue subisce la filtrazione, e da vari distinti segmenti del tubulo renale, dove le sostanze filtrate sono riassorbite e le componenti plasmatiche sono secrete nel liquido tubulare. Nella corticale del rene, i nefroni sono collegati con il sistema dei dotti collettori. che attraversano il rene e terminano nei dotti. collettori intramidollari dove il liquido tubulare subisce l’ultima modificazione formando l’urina. Il sangue proviene dall’arteria renale e viene indirizzato all’arteriola afferente che si divide in numerosi capillari glomerulari che costituiscono il gomitolo glomerulare. I capillari si riuniscono e confluiscono nell’arteriola efferente che drena il sangue dal glomerulo e lo convoglia nella vena renale. Il gomitolo glomerulare è collocato all’interno di uno strato di cellule epiteliali denominato capsula di Bowman, lo spazio presente tra il glomerulo e la capsula è chiamato spazio di Bowman ed è il sito di raccolta del filtrato glomerulare. La parete dei capillari è formata da tre strati: 1) endotelio capillare 2) membrana basale 3) epitelio viscerale. (Fig. n. 1). 9.

(10) Fig. n.1: struttura dei capillari glomerulari. 1) L’endotelio capillare è costituito da un unico strato di cellule le cui estensioni citoplasmatiche sono caratterizzate da numerose fenestrature che rappresentano i canali per il passaggio di acqua e componenti non cellulari dal sangue alla membrana basale. 2) E’ una struttura acellulare composta da varie glicoproteine tra cui i collageni di tipo IV e di tipo V, proteoglicani, laminina, fibronectina ed entactina. Anche la membrana è organizzata in tre strati che, con grande probabilità, derivano dalla fusione delle membrane basali dell’endotelio e degli strati delle cellule epiteliali. Questi strati sono a) lamina rara interna b) lamina densa c) lamina rara esterna. La lamina densa è situata tra la lamina rara interna, situata sul lato endoteliale della membrana basale glomerulare, e la lamina rara esterna, che si trova sul lato 10.

(11) epiteliale della membrana basale glomerulare. Le lamine rare sono costituite da una rete lassa di fibrille glicoproteiche. 3) L’epitelio viscerale origina da uno strato di cellule concatenate chiamate “podociti” (Fig. n. 2). Prolungamenti lunghi e stretti, denominati processi pedicellari primari e secondari, si interdigitano con processi pedicellari di altri podociti e si avvolgono attorno ad ogni singolo capillare.(1). Fig. n.2: immagine dei podociti al microscopio elettronico. 1.2 Filtrazione glomerulare e riassorbimento tubulare I reni ricevono all’incirca il 20-25% della gittata cardiaca. Dell’intera portata renale plasmatica, i glomeruli ne filtrano una certa quantità che rappresenta il volume del filtrato glomerulare (VFG) o GFR (Glomerular Filtration Rate). Il risultato di questo processo è un fluido 11.

(12) dotato degli stessi caratteri fisico-chimici del plasma e di un basso contenuto proteico, denominato ultrafiltrato glomerulare o preurina. La forza di filtrazione è fornita dalla pressione idrostatica a cui si oppone la pressione oncotica, che deriva dalle proteine presenti nel plasma, e la pressione renale intratubulare e interstiziale. La pressione di filtrazione netta è quindi data dalla differenza tra la pressione idrostatica del capillare e la pressione oncotica addizionata alla pressione idrostatica dell’ultrafiltrato. (2) ( Fig. n. 3). Fig. n. 3: pressioni che regolano la filtrazione a livello glomerulare. Ci sono altri fattori che influenzano la quantità e la qualità del filtrato glomerulare come il numero di glomeruli funzionanti, il volume di 12.

(13) sangue e la permeabilità dei capillari glomerulari. Acqua e piccole molecole passano facilmente il filtro glomerulare e, quindi,. sono. concentrazioni. presenti. nell’ultrafiltrato. plasmatiche.. Le. all’incirca. sostanze. presenti. nelle. stesse. nel. filtrato. glomerulare possiedono un peso molecolare inferiore ai 70.000 Da, in quanto il glomerulo esercita una funzione di setaccio, escludendo dal passaggio macromolecole dotate di un peso molecolare maggiore. Ulteriori fattori che influiscono sul passaggio delle molecole sono carica elettrica, forma (configurazione) e dimensioni. La carica negativa posseduta dai capillari glomerulari impedisce il passaggio alle macromolecole anioniche. e incrementa quello delle. macromolecole cationiche. Questo è dovuto a residui di glicoproteine, caricati negativamente, che sono presenti nella membrana basale glomerulare che riveste l’endotelio e le cellule epiteliali. La forma e la deformabilità giocano anche loro un ruolo importante nella capacità di attraversare la barriera di filtrazione. Ad esempio il destano. (3). , molecola lunga, flessibile e priva di carica, attraversa la. barriera di filtrazione sette volte più facilmente rispetto alla perossidasi di rafano, che è una proteina globulare di raggio simile e carica netta. In genere, sostanze con raggio molecolare di 4 nm o maggiore non vengono filtrate mentre, quelle di raggio 2 nm o inferiore, passano senza alcuna interferenza. 13.

(14) La velocità di filtrazione glomerulare può variare in seguito a variazioni del diametro delle arteriole afferenti ed efferenti. La dilatazione delle prime comporta un aumento del flusso ematico al glomerulo che incrementa la pressione idrostatica e potenzialmente anche la filtrazione, la vasocostrizione delle seconde aumenta la pressione idrostatica glomerulare e riduce il flusso ematico renale. Il riassorbimento tubulare è un meccanismo fondamentale per il mantenimento dell’omeostasi corporea, perché evita la perdita con le urine di sostanze utili che hanno superato la barriera glomerulare. Il tubulo prossimale è responsabile del riassorbimento dell’ultrafiltrato in misura maggiore rispetto alla rimanente parte del tubulo, circa il 60% della maggior parte delle sostanze filtrate sono riassorbite. Anche peptidi e proteine a basso peso molecolare vengono riassorbiti. Le peptidasi presenti nell’orletto a spazzola del tubulo prossimale degradano ad aminoacidi una percentuale elevata dei peptidi filtrati. Questi sono riassorbiti per cotrasporto con il Na+ attraverso la membrana plasmatica apicale. Sono presenti sulla membrana luminale delle proteine capaci di interagire con gli aminoacidi in base ad alcune loro caratteristiche di struttura. Mentre, ad esempio, per il glucosio esiste un sistema di trasporto specifico, per gli aminoacidi non esiste una corrispondenza stretta tra il vettore e la sostanza da trasportare, non esistono quindi 20 proteine diverse per trasportare altrettanti tipi di 14.

(15) aminoacidi. Ci sono proteine di trasporto capaci di legare tipi strutturali analoghi. Ad esempio, la proteina di membrana che è deputata al trasporto dell’arginina è capace di interagire anche con la lisina, l’ornitina e la cistina e non può trasportare però il glutammato e l’aspartato. La presenza di vie comuni di riassorbimento determina una competizione tra le sostanze che utilizzano la stessa via, perché i legami con il carrier possono andare incontro a saturazione. Anche le proteine a basso peso molecolare sono riassorbite dal tubulo prossimale ma attraverso dei meccanismi differenti. Alcune proteine filtrate come insulina, glucagone e ormone paratiroideo, sono assorbite dal fluido tubulare nelle cellule del tubulo prossimale attraverso un meccanismo di endocitosi mediata da carrier (3) . Le proteine si legano a sedi specifiche della membrana luminale e danno origine alla formazione di vescicole intracellulari che si fondono con un sistema di organelli intracellulari, chiamati lisosomi. Gli enzimi proteolitici presenti al loro interno degradano le proteine riassorbite e gli aminoacidi che ne derivano sono trasportati nel liquido interstiziale e ritornano nel sangue.. 1.3 Concentrazioni proteiche nell’urina L’urina normale contiene una insignificante quantità di proteine, insufficiente a produrre un risultato positivo anche con il metodo più 15.

(16) sensibile per la determinazione delle proteine. La membrana glomerulare integra previene la perdita di proteine plasmatiche con il filtrato normale e qualche proteina di basso peso molecolare o di piccole dimensioni viene riassorbita dai tubuli renali. La quantità di proteine presenti nel filtrato a livello del tubulo prossimale del cane è all’incirca di 10-15 mg/dl. Le proteine urinarie in soggetti privi di patologie derivano dall’albumina, dalla proteina di Tamm-Horsfall prodotta dalle porzioni del nefrone distale rispetto al braccio discendente dell’ansa di Henle, dalle immunoglobuline secretorie, soprattutto le IgA, che originano dalle vie urinarie e, a secondo del metodo di raccolta, dalle vie genitali.Anche se il plasma contiene alte concentrazioni di albumine, nell’ultrafiltrato sono presenti in piccole quantità in relazione al loro peso molecolare, che è compreso tra 66.000 e 68.000 Da, e alla loro carica negativa. Le albumine costituiscono dal 40 al 60% delle proteine totali urinarie dato che non sono riassorbite completamente dalle cellule dei tubuli renali (4) (Tab. n. 1) Il 40-60% delle proteine di norma presenti nelle urine provengono dai tubuli distali e dai dotti collettori, dal rivestimento epiteliale delle vie urinarie inferiori e da quelle genitali. La proteina di Tamm-Horsfall è presente nell’urina di cane in concentrazioni variabili da 0,5 a 1,0 mg/dl. 16.

(17) L’urotelio può secernere anche immunoglobuline, soprattutto IgA, come meccanismo difensivo dell’ospite contro le infezioni ascendenti delle vie urinarie. Proteine plasmatiche con peso molecolare tra 1.500 e 45.000 Da attraversano le pareti glomerulari più facilmente ma, a causa della loro bassa concentrazione plasmatica e del riassorbimento effettuato a livello tubulare, compaiono nell’urina in quantità modeste. L’emoglobina, anche se è una molecola piccola, normalmente non è presente nelle urine perché di norma è legata all’aptoglobina, che è una molecola di dimensioni maggiori. Più raramente, le proteine presenti nelle urine possono avere origine dal disfacimento cellulare che si ha in corso di lesioni infiammatorie della mucosa dei bacinetti (pieliti) o della vescica (cistiti), è la cosiddetta “proteinuria spuria”. Piccole quantità di mucoproteine possono essere presenti nell’urina normale, questo è caratteristico soprattutto dell’urina del cane.. Sostanza. Peso Presenza molecolare nell’ approssimativo ultrafiltrato (Da) glomerulare. Acqua. 18. Presente. Urea. 60. Presente. Creatinina. 113. Presente. Glucosio. 180. Presente 17.

(18) Β2−microglobulina. 11.800. Presente. Lisozima (muramidasi). 14.400. Presente. Mioglobina. 17.600. Presente. Bence Jones (monomero). 22.000. Presente. α1−microglobina. 37.000. Presente. α1−glicoproteina acida. 40.000. Presente. Bence Jones (dimero). 44.000. Presente. Amilasi. 50.000. Presente. Emoglobina (tetramero). 64.500. Talvolta presente. Albumine. 66.000. Talvolta presente. Aptoglobina (monomero). 120.000. Assente. Immunoglobulina G. 160.000. Assente. Immunoglobulina A (dimero). 300.000. Assente. Fibrinogeno. 400.000. Assente. α2−microglobulina. 840.000. Assente. Immunoglobulina M. 900.000. Assente. Tabella n. 1: confronto tra i pesi molecolari o le proteine plasmatiche incluse ed escluse dal filtrato glomerulare. La proteinuria è definita come la presenza di proteine nelle urine ma generalmente viene utilizzata per indicare la presenza di una quantità anomala di proteine (> 20 mg/kg/die). Alcuni ricercatori hanno eseguito degli studi su numerosi cani e gatti volti ad identificare l’entità della normale escrezione proteica quotidiana con le urine (4) . (Tab. n. 2). 18.

(19) Proteine (mg/kg/die) Intervallo Media. Metodo di analisi. Specie N°pazienti valutati. 0,6-5,1. 2,3. Blu brillante Coomassie 40. Canina. 16. 1,8-22,4. 7,66. Blu brillante Coomassie 62. Canina. 14. 0,2-7,7. 2,45. Acido tricloroacetico ponceau-S 14 Canina. 19. 1,9-11,7. 4,76. Acido tricloroacetico ponceau-S 98 Canina. 8. 2,7-23,2. 6,6. Acido tricloroacetico ponceau-S 7 Canina. 29. 4,55-28,3. 13,9. Acido tricloroacetico ponceau-S 23 Canina. 17. 2,99-8,88. 4,93. Blu brillante Coomassie 1. Felina. 30. Tabella n. 2: escrezione proteica urinaria giornaliera normale in gatti e cani sani. Le varie metodologie impiegate per rilevare la loro concentrazione forniscono dati che sono significativamente differenti e questo crea una certa confusione. su quale sia il valore normale dell’escrezione. urinaria. Ad esempio in uno studio, la tecnica che utilizza il blu brillante. Coomassie. ha. determinato. concentrazioni. proteiche. decisamente più elevate rispetto a quelle ottenute con l’acido tricloroacetico ponceau-S impiegate sugli stessi campioni. Questo perché le proteine nell’urina sono così eterogenee che è difficile avere un test che sia sensibile a tutte le proteine. Sulla base di queste osservazioni e dei vari studi effettuati è stata identificata come concentrazione urinaria di proteine anormale quella che è superiore a 20 mg/kg/die identificata con la tecnica del blu brillante di Coomassie o con il metodo dell’acido tricloroacetico ponceau-S (4) . 19.

(20) 1.4 Proteine presenti nelle urine (5) PROTEINE di origine plasmatica: 60-70% • Albumina (15 mg / 24 ore) • Ceruloplasmina – Alfa 1 glicoproteina acida • Alfa 1 antitripsina – Alfa 1 microproteina • Emopessina – Transferrina – Aptoglobina • Beta 2 microglobulina – RBP – Immunoglobuline • Enzimi PROTEINE di origine renale: 30 – 40% • Uromucoide (TH) – Urochinasi – IgA secretorie • Enzimi tubulari. 20.

(21) Capitolo 2: Patologie provocate da lesioni renali dirette dovute ad agenti infettivi Le patologie sistemiche che possono determinare danni renali secondari possono essere raggruppate in questo modo: 1) lesioni dirette provocate da agenti infettivi che possono determinare il danno renale direttamente o con meccanismo immunomediato 2) lesioni immunomediate 3) lesioni dovute a cause emodinamiche 4) lesioni dirette provocate da varie sostanze e disfunzioni endocrine.. 2.1 Lesioni dirette provocate da agenti infettivi Sono pochi i microrganismi che provocano malattie infettive nel cane e nel gatto riconosciuti come responsabili di lesioni renali dirette e non tutte sono di rilevanza clinica (4) (Tab. n. 3).. Lesioni vascolari Sede di lesione. Agenti infettivi. C.endoteliali glomerulari. Epatite infettiva del cane (CAV-1). Coinvolgimento renale in vasculiti generalizzate. Herpes virus del cane (infezione neonatale), Leptospirosi, Ehrlichiosi del cane, Febbre Maculosa delle Montagne Rocciose, Brucellosi. Lesioni tubulo-intersiziali Sede di lesione. Agenti infettivi. C.epiteliali tubulari. Leptospirosi, Epatite infettiva del cane (CAV-1), Encefalitozoonosi. 21.

(22) Nefrite interstiziale. Leptospirosi, Epatite infettiva del cane (CAV-1), Encefalitozoonosi, Borreliosi di Lyme, Brucellosi. Nefrite granulomatose interstiziali. Peritonite infettiva felina, Histoplasmosi, Blastomicosi, Criptococcosi, Coccidiomicosi, Aspergillosi disseminata, Candidasi. Tabella n. 3: patologie associate a lesioni renali dirette provocate da agenti infettivi. Il virus che determina l’Epatite infettiva del cane, Adenovirus Canino tipo 1 (CAV-1), nella fase iniziale dell’infezione si replica nelle cellule epiteliali glomerulari lesionandole. Circa 7 giorni post-infezione si verifica un aumento degli anticorpi neutralizzanti e ciò si associa al deposito glomerulare degli immunocomplessi circolanti e ad una proteinuria temporanea. Quattordici giorni post-infezione il CAV-1 non appare nei glomeruli, tuttavia persiste nell’epitelio tubulare renale. La sua localizzazione a livello tubulare è associata alla viruria e determina una proteinuria temporanea(6). Le leptospire, una volta raggiunto lo spazio vascolare sanguigno, si diffondono e si moltiplicano in molti tessuti compresi i reni. Gli innalzamenti degli anticorpi sierici eliminano le spirochete nella maggior parte degli organi, ma i microrganismi possono persistere nel rene ed essere eliminati nelle urine per settimane o mesi. Nelle infezioni gravi,. si. possono. verificare. edema. tissutale. e. coagulazione. 22.

(23) intravascolare disseminata (DIC) che determinano un danno endoteliale. La disfunzione acuta dell’attività renale può essere determinata dalla diminuita filtrazione glomerulare provocata dalla tumefazione del rene, che altera la perfusione renale ematica(6). La Febbre Maculosa delle Montagne Rocciose è determinata da una rickettzia che si replica nelle cellule endoteliali di venule e di arteriole. Questo determina una vasculite. con attivazione piastrinica e del. sistema coagulativo, accompagnato da diminuiti livelli plasmatici di antitrombina III e plasminogeno e aumentati prodotti di degradazione del fibrinogeno (FDP). Gli organi con circolazione endoarteriosa come il rene sono colpiti molto spesso(6) . La Brucella canis può localizzarsi in tessuti non riproduttivi con circolazione endoarteriosa. e che filtrano i microrganismi di. provenienza ematica o gli immunocomplessi, come i reni, dove determina glomerulopatia. L’Ehrlichiosi canina può determinare una vasculite generalizzata che porta a lesioni renali di rilevanza clinica. L’insufficienza renale, come sintomo clinico saliente di malattia infettiva generalizzata, è di più probabile riscontro in animali affetti da Leptospirosi o da Febbre Maculosa delle Montagne Rocciose. Anche il microsporidio Encephalitozoon cuniculi può provocare una patologia renale tubulo-interstiziale. Viene escreto con le urine degli 23.

(24) animali infetti in quanto sopravvive e si moltiplica nell’epitelio tubulare renale(6). Associate con l’infezione da Leptospirosi, Borreliosi di Lyme, Epatite infettiva del cane ed Encefalitozoonosi, si possono trovare nefriti interstiziali acute e croniche che possono provocare o meno insufficienza renale (6). Nei gatti affetti da FIP è comune l’interessamento renale in seguito all’instaurasi di una vasculite. In pazienti affetti da Blastomicosi, Istoplasmosi, Criptococcosi o Coccidiomicosi solitamente vengono colpiti altri organi, ma in alcuni casi, possono essere colpiti anche i reni. Spesso l’Aspergillosi disseminata coinvolge anche i reni ed è possibile isolare l’organismo patogeno dalle urine dei cani colpiti. La Candidosi sistemica è rara ma in alcuni pazienti colpiti sono state trovate lesioni renali(6) .. 2.2 Lesioni immunomediate Le situazioni patologiche di origine immunomediata sono fra le cause più frequenti per quanto riguarda l’insorgenza di lesioni renali associate a patologie polisistemiche. Malattie infettive sistemiche, come la Leishmaniosi (7) o la Dirofilariosi, o patologie sistemiche, come il Lupus Eritrematoso Sistemico-LES, 24.

(25) spesso provocano lesioni renali di origine immunomediata. I. meccanismi. immunitari. provocano. lesioni. glomerulari. immunomediate che sono più numerose e meglio caratterizzate rispetto alle lesioni tubulo-interstiziali o vascolari del rene. La patogenesi delle patologie renali immunomediate coinvolge soprattutto i fattori umorali che determinano le lesioni renali, ma negli ultimi anni è stato riconosciuto un possibile meccanismo di origine cellulomediato. I complessi antigene-anticorpo, solubili, circolanti, possono essere depositati o intrappolati nel glomerulo quando esiste un modesto eccesso di antigene o quando le molecole antigene e anticorpo sono presenti nel plasma approssimativamente nello stesso numero. Se esiste un considerevole eccesso di anticorpi, i complessi tendono ad essere grandi e insolubili e sono rimossi rapidamente dalla circolazione per mezzo delle cellule fagocitarie. Quando gli immunocomplessi sfuggono alla distruzione operata dal sistema monocitico macrofagico, restano in circolo e possono accumularsi in varie strutture del glomerulo (mesangio, parete capillare e membrana basale) così come nei vasi renali, nella membrana basale tubulare o a livello dell’interstizio (Fig. n.4).. 25.

(26) Fig. n. 4: Meccanismo immunomediato: formazione di complessi immuni. Se esiste un notevole eccesso di antigene, gli immunocomplessi non si legano rapidamente e mostrano una capacità ridotta di produrre lesioni immunologiche. Si può avere la formazione di immunocomplessi in situ, all’interno della parete dei capillari glomerulari, quando gli anticorpi circolanti reagiscono con gli antigeni endogeni del glomerulo oppure fissano degli antigeni non glomerulari nella parete dei capillari glomerulari. Nel cane la glomerulonefrite associata a filariosi cardiopolmonare, si verifica in parte anche per la formazione in situ di immunocomplessi. La localizzazione degli immunocomplessi all’interno della parete dei capillari glomerulari può influenzare la risposta immunitaria. Per esempio, gli immunocomplessi subepiteliali attivano il complemento e determinano. proteinuria.. L’attivazione. locale. subepiteliale. del 26.

(27) complemento provoca un attacco alle membrane da parte del complesso (C5b-9) in modo da poter essere riunito ed inserito nel doppio strato lipidico della membrana cellulare, aumentando la permeabilità glomerulare (4). Una volta che l’anticorpo si è legato all’antigene, solubile o insolubile che sia, a livello del tessuto renale si possono mettere in moto una grande varietà di meccanismi che provocano lesioni tessutali, alcuni dei quali sono promossi semplicemente dalla sola deposizione di anticorpi, mentre altri coinvolgono la formazione di complessi col complemento che attaccano la membrana, il richiamo di cellule infiammatorie dal circolo o provocano effetti mediati dalle cellule mesangiali presenti in situ.. 2.3 Lesioni dovute a cause emodinamiche Le lesioni renali dovute ad alterazioni emodinamiche sono state considerate una causa poco frequente di patologie renali di rilevanza clinica anche se comunque viene riconosciuta loro una certa importanza, soprattutto in relazione al loro ruolo nella progressione delle patologie renali croniche. L’alterazione dell’emodinamica renale si può verificare in seguito ad iperperfusione (iperfiltrazione) o ad ipoperfusione (ipofiltrazione). Il risultato finale dell’iperfiltrazione è la glomerulosclerosi mentre, in 27.

(28) seguito ad ipofiltrazione, si può verificare una necrosi tubulare acuta. Esiste un meccanismo di autoregolazione per mantenere relativamente costante il flusso di sangue anche quando la pressione arteriosa media varia, ha lo scopo di adattare continuamente l’attività glomerulare alle diverse situazioni emodinamiche sistemiche. Il processo origina a livello delle arteriole afferenti (preglomerulari) che, avendo la capacità intrinseca di dilatarsi o di costringersi, possono modificare le resistenze vascolari renali al fine di mantenere costante il flusso di sangue. Il mantenimento della portata renale plasmatica (PRP) e del volume di filtrazione glomerulare (VFG) è anche dovuto in piccola parte alle modificazioni delle resistenze delle arteriole efferenti (postglomerulari)(4) . La vasocostrizione delle arteriole afferenti provoca la diminuzione del PRP e del VFG, mentre la vasodilatazione di queste arteriole aumenta il PRP ed il VFG.. 2.4 Lesioni dirette provocate da varie sostanze e disfunzioni endocrine Alcune patologie polisistemiche possono provocare lesioni renali dovute a pigmenti (mioglobina, emoglobina), a cristalli (ossalati, calcio) ed a proteine insolubili (amiloide, proteine di Bence Jones). Necrosi tubulare acuta si può verificare in seguito a nefropatia da 28.

(29) pigmenti ed a lesioni renali dovute alla formazione di cristalli. La mioglobinuria è generalmente secondaria a rabdomiolisi. Le necrosi e le gravi lesioni muscolari provocano il rilascio di mioglobina, che viene scarsamente legata dalle proteine plasmatiche e quindi filtrata dai glomeruli nell’urina. L’emoglobinuria è di più frequente riscontro rispetto alla mioglobinuria e, di solito, è associata a disturbi che provocano emolisi intravasale. Sia la mioglobina che l’emoglobina vengono dissociate in ferrematina (ematina) ed una frazione di globina, ad un pH urinario pari od inferiore a 5,6. Sembra che sia l’ematina la componente tossica a cui attribuire la nefropatia indotta da pigmenti, infatti nel cane la somministrazione endovenosa di ematina provoca la comparsa di gravi necrosi tubulari. E’ forse più probabile che si verifichi nefrotossicosi quando si verifica emoglobinuria o mioglobinuria in contemporanea con patologie che provocano diminuzione del pH urinario e della perfusione renale, come disidratazione, ipovolemia o acidosi (4) . La proteina di Bence Jones deriva il suo nome da quello del fisico inglese che descrisse la sua capacità di precipitare quando l’urina viene riscaldata gradualmente (da 45 a 70°C) e di ridissolversi in seguito ad un ulteriore riscaldamento, ad una temperatura prossima a quella di ebollizione. Le proteine di Bence Jones sono identiche alle catene leggere delle immunoglobuline e possono essere osservate nelle urine di 29.

(30) pazienti affetti da disordini neoplastici delle plasmacellule (mieloma multiplo). A livello renale, nei cani con mieloma multiplo si identificano dei reperti istologici costituiti dalla presenza di ostruzioni tubulari formate da materiale proteinaceo e da accumulo interstiziale di plasmacellule (8) Con il termine di “amiloidosi” si indica un gruppo di malattie diverse, caratterizzate dal deposito extracellulare di fibrille formate dalla polimerizzazione. di. subunità. proteiche. con. una. specifica. conformazione biofisica e chiamate struttura unica beta-ripiegata. Questa conformazione biofisica specifica è responsabile delle proprietà uniche ottiche e tintoriali dei depositi di amiloide, così come della loro insolubilità e resistenza alla proteolisi in vivo. I depositi di amiloide mostrano un aspetto omogeneo ed eosinofilo quando colorati con ematossilina-eosina ed osservati al microscopio ottico. Le fibrille di amiloide, quando osservate al microscopio elettronico, sono di lunghezza variabile, non ramificate e di 7-10 nm di larghezza (4) . L’amiloidosi. reattiva. (secondaria). è. una. sindrome. sistemica. caratterizzata dal deposito nei tessuti di proteine amiloide A (AA). I depositi tissutali degli animali affetti da amiloidosi reattiva sistemica contengono proteine AA, che sono frammenti aminoterminali di una fase-acuta reattante chiamata proteina A sierica amiloide (SAA). Esempi di amiloidosi sistemica reattiva sono l’amiloidosi familiare del 30.

(31) gatto Abissino e del cane Shar Pei. La proteina SAA è uno dei numerosi reattanti fase-acuta sintetizzati nel fegato in risposta a lesioni tissutali. Le citochine, ad esempio l’interleuchina 1 e 6 e fattori di necrosi tumorale, rilasciate dai macrofagi dopo lesione tissutale, stimolano gli epatociti a sintetizzare e a rilasciare la proteina SAA. Questa si lega a lipoproteine ad elevata densità (HDL), dove rimuove altre apolipoproteine. Le concentrazioni sieriche normali di proteina SAA sono di circa 1 mg/ml, ma dopo una lesione tissutale, come infiammazioni, neoplasie, traumi o infarti, le loro concentrazioni aumentano di 100-1000 volte. Le concentrazioni sieriche di proteina SAA iniziano ad aumentare 2-4 ore dopo lo stimolo infiammatorio, raggiungono il picco 12-18 ore dopo e diminuiscono, fino ai valori basali, dopo 36-48 ore, se viene eliminato lo stimolo infiammatorio(1) . Nel cane i depositi di amiloide AA sono più comuni nel rene ed i segni clinici sono quelli dell’insufficienza renale e dell’uremia. E’ comune una proteinuria da lieve a marcata, a causa della prominente localizzazione a livello glomerulare dei depositi. Anche la milza, il fegato, i surreni ed il tratto gastroenterico possono essere interessati, ma non sono frequenti i segni clinici associati. Nel gatto i depositi di amiloide sono ampiamente diffusi, ma i segni clinici sono riferiti al danno renale, con insufficienza renale ed uremia. 31.

(32) Negli animali con amiloidosi midollare, senza contemporaneo interessamento glomerulare, la proteinuria è lieve o assente(4) . Altre sostanze che possono determinare problemi renali sono, ad esempio, gli aminoglicosidi eliminati principalmente per filtrazione glomerulare; circa il 90%. di una dose somministrata per via. endovenosa viene reperita nelle urine dopo 24 ore, la parte restante si accumula nella corticale renale. Gli aminoglicosidi sono attratti dai fosfolipidi anionici molto abbondanti nelle membrane. A livello della corteccia renale è presente una quota elevata di fosfatidilinositolo a cui l’aminoglicoside si lega. Anche le membrane basolaterali dell’epitelio dei tubuli prossimali hanno una capacità di legame degli aminoglicosidi maggiore rispetto a quelle delle cellule dell’orletto a spazzola, proprio per un loro più elevato contenuto di fosfatidilinositolo. La presenza di alte concentrazioni corticali di farmaco è stata collegata alla nefrotossicità(9) . Responsabile della nefrotossicità può essere anche l’amfotericina B. Le sue elevate concentrazioni che si riscontrano nel filtrato glomerulare, provocano danno tubulare diretto con perdita di ioni K+ e acidosi tubulare(9) .. 2.5 Meccanismi patogenetici della proteinuria nelle nefropatie Segno distintivo della patologia a carico del glomerulo è la proteinuria. Un ostacolo selettivo al passaggio delle proteine 32.

(33) plasmatiche in relazione alla loro dimensione e alla loro carica è svolto dalla barriera di filtrazione glomerulare che è formata dalle cellule endoteliali, dalla membrana basale e dai processi (pedicelli) delle cellule epiteliali (podociti). Le malattie glomerulari possono alterare l’integrità della barriera sia dal punto di vista strutturale, osservabile al microscopio ottico, sia da quello della selettività elettrica, determinando una proteinuria di entità variabile. Il termine di glomerulopatia comprende una vasta gamma di alterazioni che differiscono nel meccanismo patogenetico, nelle manifestazioni morfologiche, nel decorso clinico e nella risposta alla terapia. Alcune alterazioni del glomerulo si verificano in corso anche di patologie polisistemiche. Sono molte le patologie primarie che determinano un coinvolgimento renale secondario, ma i meccanismi responsabili di tale coinvolgimento sono in numero ridotto. Le possibili localizzazioni delle lesioni che possono essere indotte sono inferiori in numero rispetto ai meccanismi che originano le lesioni renali secondarie. Il limitato numero dei possibili siti su cui agiscono i meccanismi che provocano le lesioni renali determinano effetti che possono essere evidenziati come patologie renali vascolari e/o glomerulari o come patologie renali tubulo-interstiziali. 33.

(34) Capitolo 3: Classificazione della proteinuria La proteinuria può essere classificata in fisiologica o patologica(6) (Tab. n. 4).. Tabelle n. 4: classificazione della proteinuria. La prima viene definita anche proteinuria funzionale ed è legata allo stress, all’esercizio muscolare molto intenso, alla febbre, alle convulsioni, all’esposizione a temperature estreme(10) . La fisiopatologia della proteinuria fisiologica o benigna non è del tutto conosciuta, ma si ritiene che vi siano coinvolte una vasocostrizione del rene, ischemia e congestione renale. Anche una diminuita attività muscolare può influire sull’escrezione urinaria di proteine nel cane. Un indagine ha permesso di appurare che i cani confinati in gabbie anguste presentano una perdita di proteine con le urine superiore a quella registrata in soggetti che conducono una vita normalmente attiva. E’, però, un fenomeno 34.

(35) differente dalla tipica proteinuria posturale od ortostatica propria dell’uomo, una proteinuria di lieve intensità che si manifesta quando le persone stanno in piedi o sono impegnate in un lavoro, ma che regredisce con il riposo e il decubito(4) . La proteinuria funzionale è tipicamente costituita da un’albuminuria lieve e transitoria. La proteinuria patologica può essere provocata da disturbi connessi all’apparato urinario o anche esterni ad esso. I disturbi che possono essere associati a proteinuria, senza essere direttamente attinenti all’apparato urinario, spesso riguardano la produzione di composti di natura proteica a basso peso molecolare, che vengono filtrati dai glomeruli renali in quantità tale da superare la capacità di riassorbimento dei tubuli prossimali o una riduzione dei siti di legame disponibili nelle molecole di trasporto. Questo tipo di proteinuria viene anche definita da sovraccarico tubulare(10)(Fig. n. 5 ) e, esempi di disturbi che la possono determinare, sono la produzione di immunoglobuline a catena leggera (proteine di Bence Jones) da parte di plasmacellule neoplastiche e il rilascio di emoglobina da parte degli eritrociti danneggiati, in quantità tale da superare le capacità leganti dell’aptoglobina.. 35.

(36) Fig. n. 5 :proteinuria da sovraccarico: a causa dell’aumento della concentrazione sierica delle proteine si ha superamento delle capacità di riassorbimento delle cellule tubulari e quindi le proteine in eccesso vengono perse con le urine.. Anche la congestione renale che può seguire ad insufficienza cardiaca congestizia e alcuni processi infiammatori a carico dell’apparato genitale, per esempio prostatite o metrite, possono dare luogo a proteinuria patologica di tipo non urinario. La proteinuria di Bence Jones è definita anche paraproteinuria. Le proteine di Bence Jones sono frammenti di immunoglobuline (catene leggere libere) prodotte in quantità eccessiva dalle plasmacellule neoplastiche e riscontrabili nel siero e nelle urine (overload proteinuria)(6) . Queste proteine, avendo piccole dimensioni (peso molecolare 22.000-27.000 Da), sono filtrate dai glomeruli e, poiché presenti. in. grandissime. concentrazioni,. sono. riassorbite. solo 36.

(37) minimamente dai tubuli, in seguito al sovraccarico del meccanismo tubulare di riassorbimento e sono quindi riscontrabili nelle urine. La proteinuria di Bence Jones si riscontra, oltre che nel mieloma multiplo, anche nella macroglobulinemia di Waldenstrom, nella amiloidosi da catene leggere immunoglobuliniche monoclonali (AL) e nella malattia da deposizione delle catene leggere (4) . Esiste anche una proteinuria da sovraccarico glomerulare, detta anche. proteinuria. sperimentalmente. da. sovraccarico. somministrando. proteico.. elevate. E’. quantità. stata. indotta. di. proteine. plasmatiche per via parenterale. Quando le concentrazioni di proteine plasmatiche superavano i 9 g/dl, venivano escrete con l’urina grandi quantità di albumine e di altre proteine ad alto peso molecolare. Nei ratti, durante gli episodi di iperproteinemia e proteinuria, sono state evidenziate alterazioni della struttura glomerulare. Le anomalie glomerulari erano rappresentate sia da numerose goccioline di proteine riassorbite che dal rigonfiamento e dall’obliterazione dei pedicelli e delle cellule epiteliali. In seguito alla risoluzione dell’iperproteinemia e della proteinuria, queste alterazioni regredivano completamente. Negli animali con iperproteinemia grave, ad esempio negli animali con mieloma multiplo o ehrlichiosi, dovrebbe essere sospettato, come causa di proteinuria, il sovraccarico glomerulare (11) . La proteinuria patologica che consegue a disturbi dell’apparato urinario, 37.

(38) può avere origine dal rene (proteinuria renale) o dalle vie urinarie in genere (proteinuria post renale). La proteinuria post renale è spesso associata a processi infiammatori o emorragie a carico delle basse vie urinarie. Alcune modificazioni che insorgono nel sedimento dell’urina, di solito rispecchiano la causa fondamentale del disturbo (urolitiasi, neoplasia, cistite di natura batterica o traumatica). La proteinuria propriamente renale può essere legata. ad una. compromissione glomerulare (aumentata filtrazione) o tubulare (ridotto riassorbimento). La proteinuria glomerulare è l’esito di alterazioni patologiche a carico della barriera dei capillari glomerulari che normalmente previene il passaggio delle grosse proteine plasmatiche nel filtrato glomerulare. Questo danno può consistere nella perdita delle cariche negative dei capillari del glomerulo. Le alterazioni strutturali della barriera di filtrazione possono essere causate da patologie primarie, per esempio reazioni anti-membrana basale, infiammazioni o neoplasie, o secondarie come la deposizione di immunocomplessi, l’amiloidosi, l’iperfiltrazione o l’iperadrenocorticismo. Nei pazienti affetti da queste disfunzioni glomerulari,. le. proteine. presenti. nelle. urine. sono. costituite. principalmente da albumine (69.000 Da) e da altre proteine ad alto peso molecolare come immunoglobuline e fattori della coagulazione. Anche 38.

(39) se con l’entità della proteinuria evidenziata con l’analisi delle urine non si può stabilire con certezza la sua origine, una proteinuria persistente, di entità da modica a elevata, in assenza di ematuria o di piuria, indica una glomerulopatia generalizzata. La proteinuria glomerulare può esitare in ipoalbuminemia. La proteinuria glomerulare può essere ulteriormente distinta in selettiva e non selettiva.. Fig. n. 6: proteinuria glomerulare selettiva in seguito a lesioni limitate della membrana basale glomerulare si ha passaggio di proteine di medio peso molecolare; quelle ad alto peso molecolare, invece, non riescono ad attraversare la membrana glomerulare.. La proteinuria glomerulare selettiva(10) (Fig. n. 6) può essere legata a glomerulopatie di grado da lieve a moderato. I minimi danni a carico delle pareti dei capillari glomerulari consentono il passaggio di proteine plasmatiche con peso molecolare inferiore a 70.000-90.000 Da come 39.

(40) l’albumina (p.m. 69.000) e le transferrine ( p.m. 90.000). Nella proteinuria glomerulare non selettiva, il filtro glomerulare lascia passare anche strutture più voluminose come le IgG (p.m. 160.000) ed a volte anche le α 2 macroglobuline (p.m. 820.000)(10) . (Fig. n. 7). Fig. n. 7: proteinuria glomerulare non selettiva: in caso di danni più severi della membrana basale glomerulare anche le proteine ad alto peso molecolare riescono ad attraversarla.. La proteinuria deriva dall’incapacità del tubulo a riassorbire per intero tali strutture proteiche, come nella sindrome nefrosica. La proteinuria post-renale può essere il risultato delle normali secrezioni genitali, si può verificare, però, anche in seguito al danno dell’epitelio delle vie urogenitali causato da flogosi, neoplasie, ischemia o traumi(10) . (Fig. n. 8) 40.

(41) Solitamente è possibile differenziare la proteinuria post-renale da quella glomerulare, valutando i segni clinici ed il sedimento urinario. La proteinuria post-renale è spesso associata a leucocitaria o eritrocituria o ad entrambe.. Fig. n. 8: proteinuria postrenale: le proteine presenti nelle urine, in questo caso, non hanno attraversato il nefrone ma sono pervenute in un secondo momento, provenendo dalle basse vie urinarie o dalle vie genitali.. La proteinuria tubulare è caratterizzata dall’escrezione di proteine plasmatiche a basso peso molecolare (da 1.500 fino a 45.000 Da), provocata da un riassorbimento difettoso da parte dei tubuli prossimali(10) . (Fig. n. 9). 41.

(42) Fig. n. 9: proteinuria tubulare: in questo caso il glomerulo è intatto per cui non passano le proteine a medio e ad alto peso molecolare. Quelle a basso peso molecolare, a causa di danni delle cellule tubulari non vengono riassorbite e quindi sono eliminate con le urine.. La proteinuria tubulare può essere completa, coinvolgendo tutte le proteine di peso inferiore a 67.000 Da, o incompleta, che determina la comparsa nelle urine di proteine tra 40.000 e 67.000 Da(10) . L’elettroforesi proteica può evidenziare bande α e β prominenti, caratteristiche della proteinuria tubulare. Nell’uomo le proteine escrete comprendono solitamente le. β2 microglobuline, il lisozima, le α-. microglobuline e le glicoproteine α-acide oltre a molti aminoacidi. Questa forma di proteinuria è tipicamente lieve e può non essere rilevata con le analisi qualitative di controllo. Nei cani sono segnalate cause di proteinuria tubulare ereditarie (per esempio la sindrome di Fanconi) ed acquisite ( per esempio intossicazione da gentamicina). Le patologie tubulari non sono responsabili di ipoalbuminemia. 42.

(43) Esiste anche la proteinuria mista, in cui vi sono aspetti comuni sia alla varietà glomerulare che a quella tubulare. Sono presenti proteine con basso, medio e alto peso molecolare contemporaneamente. Si riscontra anche nella sindrome nefrosica, a causa dei danni tubulari per il protratto sovraccarico subito dall’epitelio tubulare di proteine filtrate in eccesso a livello glomerulare. Questa forma può essere l’evoluzione sia di una forma glomerulare che di una forma tubulare ed è il pattern di più comune riscontro. La maggior parte dei pazienti con insufficienza renale, infatti, ha un tracciato di questo tipo.. 43.

(44) Capitolo. 4:. Determinazione. quanti-qualitativa. della. proteinuria Quando si interpretano i risultati delle analisi è necessario prendere in considerazione le variazioni giornaliere di volume e composizione dell’urina, determinate dalla dieta, dall’assunzione idrica, dal metabolismo e da varie patologie. I campioni di urina raccolti casualmente sono di solito adatti ad un controllo diagnostico, ovviamente per verificare il significato di risultati dubbi, può successivamente rendersi necessaria la misurazione della quantità di sostanze contenute nell’urina ottenuta durante determinati periodi di tempo, o il confronto del tasso di escrezione di sostanze quali le proteine con quello della creatinina (rapporto proteine/creatinina urinaria). La quantità e la composizione proteica presenti nelle urine variano anche in condizioni normali. L’esame della proteinuria viene incluso nelle analisi delle urine complete perché, insieme ad altri riscontri clinici e di laboratorio, il suo esito è spesso utile nel rilevare, localizzare e talvolta identificare specificatamente le patologie responsabili. Le proteine presenti nelle urine sono più difficilmente misurabili e identificabili rispetto a quelle sieriche perché: a) presenti in piccole quantità 44.

(45) b) le variazioni della quantità e della composizione proteica da campione a campione sono notevoli c) le proteine presenti nelle urine derivano dal plasma, dall’apparato urinario e, talvolta, da quello genitale d) i prodotti della degradazione proteica vengono concentrati dal rene e possono essere misurati insieme alle proteine intatte(4) . Benché l’esame per la proteinuria possa essere effettuato su campioni non centrifugati, esso dovrebbe venire ripetuto sul surnatante di campioni centrifugati, per eliminare i risultati positivi causati dal materiale proteinaceo presente comunemente nel sedimento (RBC, WBC, cellule epiteliali, cilindri). Come in tutte le analisi delle urine abituali, l’esame dovrebbe essere effettuato su campioni prelevati prima della somministrazione di agenti diagnostici o terapeutici. Possono essere utilizzati sia campioni freschi che refrigerati. In uno studio eseguito su campioni di urina refrigerati a temperature da 4 a 10°C, per quattro settimane non sono state osservate variazioni significative della concentrazione proteica. Una parte fondamentale dell’analisi delle urine è rappresentata dalla loro raccolta o prelievo. I risultati e la loro interpretazione possono venire influenzati sia dalla tecnica di raccolta sia dal contenitore utilizzato. 45.

(46) Si dovrebbe compiere ogni sforzo atto ad ottenere un campione di urina le cui caratteristiche in vitro siano del tutto simili a quelle in vivo. Dovrebbe essere utilizzata una tecnica appropriata, per evitare traumi iatrogeni all’uretra e alla vescica urinaria e prevenire un’infezione iatrogena delle vie urinarie. I campioni raccolti di primo mattino sono da preferire, perché sono più facilmente concentrati. Durante il giorno l’urina tende ad essere meno concentrata, perché in quel periodo il consumo di acqua è il più elevato. Sapere che l’urina è concentrata adeguatamente, fornisce informazioni importanti sullo stato della funzionalità renale(4) . L’urina diluita, con peso specifico inferiore a circa 1.008, liserà gli elementi figurati come i globuli rossi ed i leucociti. L’evacuazione di grandi quantità di urina diluita tende a ridurre la concentrazione di tutte le sostanze presenti nel campione. Il significato dei detriti, delle cellule o degli organismi presenti nel sedimento urinario, dovrebbe sempre essere interpretato alla luce della tecnica di prelievo dell’urina. I principali metodi di raccolta delle urine sono rappresentati dalla minzione. spontanea,. compressione. manuale. della. vescica,. cateterizzazione e cistocentesi. La determinazione quanti-qualitativa della proteinuria è molto più importante dell’entità della proteinuria stessa. Certe patologie possono determinare l’aumento di uno o più singoli componenti o determinare la 46.

(47) presenza di proteine non normalmente evidenziabili nell’urina, senza notare una considerevole modificazione della proteinuria totale. Perciò lo studio clinico della proteinuria, deve unire la valutazione quantitativa a quella qualitativa. Per lo studio delle proteine sono impiegati diversi metodi: metodi di screening semiquantitativi, metodi quantitativi ed infine metodi qualitativi come l’elettroforesi.. 4.1 Metodi semiquantitativi 4.1.1 Strisce reattive La prova con le cartine da immergere nell’urina è economica e facile da eseguire. Questa prova si basa sul fenomeno denominato “errore proteico degli indicatori di pH”. Il rilevamento della proteinuria con una striscia reattiva si basa su un viraggio di colore del blu tetrabromofenolo che si verifica in presenza di proteine. La variazione di colore è più sensibile alle albumine che alle globuline, infatti il risultato dipende dalla capacità dei gruppi amminici delle proteine di legarsi ad alcuni indicatori acidobase, alterandone il colore e le albumine possiedono più gruppi amminici liberi rispetto alle globuline. Uno studio ha rilevato che, per provocare la stessa variazione di colore causata da una determinata concentrazione di albumine, erano necessarie concentrazioni doppie di 47.

(48) globuline e triple di mucoproteine(4) . I reagenti colorimetrici non rilevano neanche le proteine di Bence Jones, a meno che queste non siano presenti in quantità elevate. Per determinare il viraggio di colore, viene effettuato un confronto con una scala colorimetrica graduata standard presente sulla confezione. In ogni caso la lettura, però, è sempre di tipo soggettivo e il confronto spesso non è privo di difficoltà. Il pH urinario di tutti gli animali domestici è di 4,5-5 o maggiore. Le variazioni del pH dell’urina diluita entro i limiti fisiologici, generalmente non alterano i risultati della prova. Risposte falsamente positive si possono ottenere in presenza di un’urina con valori di pH alcalini, che contiene residui di composti di ammonio quaternario oppure se la striscia di carta è lasciata troppo a lungo a contatto con l’urina stessa. In questo caso, infatti, la macerazione della carta può provocare il rilascio dei citrati immessi come sistema tamponante e, quindi, un viraggio anomalo del composto colorato. Nel caso di campioni di urina molto alcalina, i risultati falsamente positivi sono dati dal superamento della capacità tamponante del citrato e tale problema può essere risolto riducendo il pH dell’urina estremamente alcalina o dei campioni concentrati ad un valore di 7, con la quantità necessaria di reagente acido (HCl). Le risposte falsamente negative si possono, invece, riscontrare in 48.

(49) presenza di una proteinuria di Bence Jones o con urine molto diluite o a valore di pH acido. L’intervallo di sensibilità varia dalla presenza di tracce (5 mg/dl) a 5.000 mg/dl o più. La prova non viene influenzata dal grado di torbidità dell’urina.. 4.1.2. Prova turbidometrica con acido solfosalicilico o acido. acetico L’acido solfosalicilico precipita le proteine urinarie, provocando una torbidità approssimativamente uguale alla quantità delle proteine presenti. Questo test viene effettuato mescolando uguali quantità di urina e di una soluzione al 5% di acido solfosalicilico. La torbidità che ne consegue, viene valutata su una scala graduata che, per convenzione, va da 0 a +4 (6) . Probabilmente queste prove sono più affidabili di quelle effettuate con le strisce reattive. Risultati falsamente positivi possono verificarsi se la torbidità è causata da sostanze non proteiche. Un esito positivo può, quindi, essere sovrastimato, se il grado di torbidità dell’urina viene aumentato da sostanze non proteiche. I mezzi di contrasto radio-opachi escreti nell’urina provocano una reazione falsamente positiva e inoltre 49.

(50) provocano un aumento del peso specifico urinario. E’ descritto che dosi massicce di penicillina, cefalotina, cefaloridina e sulfissossazolo causano una reazione falsamente positiva all’acido solfosalicilico. L’urina alcalina altamente tamponata può dare reazioni falsamente negative, specialmente se viene utilizzata una soluzione al 3% anziché al 5% (4) . A causa del fatto che la misurazione del grado di torbidità non è standardizzata, può verificarsi una variabilità dei risultati della prova dovuta ai diversi esaminatori ed ai diversi laboratori. Con questa prova, il conservante urinario timolo può dare una reazione falsamente positiva per le proteine. A differenza però delle prove colorimetriche, l’acido solfosalicilico è capace di rilevare la presenza delle proteine di Bence Jones nelle urine, però anche questo test, risulta essere più sensibile all’albumina rispetto alle globuline. La quantità di proteine che viene determinata mediante questa procedura può anche risultare sovrastimata, qualora siano impiegate urine non centrifugate o eccessivamente torbide. L’intervallo di sensibilità della prova turbidometrica con l’acido solfosalicilico varia dalla presenza di tracce (circa 5-20 mg/dl) a 5.000 mg/dl o più. 50.

(51) Occorre interpretare sempre gli esami semiquantitativi alla luce del peso specifico dell’urina. Ad esempio una lieve proteinuria (1+) in presenza di un basso peso specifico (p.s. 1.005), implica una perdita proteica maggiore rispetto ad una proteinuria lieve (1+) in un campione più concentrato ( p.s.1.040) (4) . La presenza di proteine nell’urina subisce spesso un aumento nei casi di processi infiammatori e/o emorragie a carico delle basse vie urinarie. La diagnosi di vera proteinuria dovrebbe essere emessa. considerando. anche i cambiamenti avvenuti a carico del sedimento urinario, che sono compatibili con le infiammazioni o le emorragie (esempio presenza di batteri e aumento del numero di globuli rossi, globuli bianchi e cellule epiteliali).. 4.2 Metodi quantitativi Una volta stabilito che il paziente è proteinurico è sempre opportuno effettuare una valutazione precisa della quantità delle proteine eliminate con le urine. Non bisogna dimenticare, inoltre, che in alcuni casi i test di screening possono risultare falsamente negativi perché a bassa sensibilità. Questo si verifica soprattutto in presenza di proteinuria di origine tubulare, la quale è di entità molto minore rispetto a quella glomerulare. Per questo 51.

(52) motivo, se il sospetto permane nonostante i test di screening siano risultati negativi, è preferibile effettuare anche una valutazione quantitativa della proteinuria. Le metodiche normalmente utilizzate per il calcolo delle proteine sieriche non sono attendibili perché non sono abbastanza sensibili per la lettura di quantità di proteine così basse. Esistono diversi metodi per il dosaggio quantitativo della proteinuria, ma generalmente le proteine urinarie vengono calcolate mediante Coomassie blu brillante o con Rosso Pirogallo o con il metodo dell’acido tricloroacetico ponceau-S. La determinazione colorimetrica diretta con Rosso Pirogallo prevede che in ambiente acido le proteine modifichino lo spettro di assorbimento del complesso pirogallo red-molibdato. L’intensità di colore che si sviluppa è direttamente proporzionale alla concentrazione di proteine presenti nel campione in esame. Per misurare le proteine urinarie vengono impiegate diverse metodiche colorimetriche e a causa delle diverse basi chimiche della misurazione delle. proteine,. metodiche. diverse. possono. fornire. risultati. considerevolmente diversi. Inoltre bisogna considerare che la concentrazione proteica calcolata su un singolo campione casuale di urine non è attendibile, perché l’escrezione urinaria di proteine è altamente variabile nell’arco della 52.

(53) giornata e dipende da vari fattori, quali l’orario e l’attività fisica. Si può ovviare a questo problema mediante due diversi accorgimenti: la misurazione complessiva delle proteine escrete nell’arco delle 24 ore o il calcolo del rapporto proteine urinarie / creatinina urinaria.. 4.2.1 Contenuto proteico nelle 24h e rapporto UP/UC Il contenuto proteico è costituito dal prodotto del volume di urina per la concentrazione proteica delle urine. La misura della concentrazione proteica delle urine può non riflettere accuratamente le perdite proteiche quotidiane e, quindi, l’entità della proteinuria, a causa della fluttuazione che il volume urinario subisce nel tempo nello stesso soggetto e delle differenze del volume urinario nei diversi pazienti. Conoscere il contenuto urinario delle proteine è meglio che conoscerne la concentrazione, perché viene preso in considerazione il volume di urina prodotta. Per effettuare valide determinazioni del contenuto proteico dell’urina sono necessari campioni prelevati ad intervalli. I campioni di 24 ore evitano i potenziali errori legati ai ritmi circadiani della proteinuria. Per evitare la perdita di quote di urina solitamente è necessaria una gabbia metabolica. Il cane e il gatto dovrebbero acclimatarsi alla gabbia per almeno 24 ore prima di iniziare la raccolta. La vescica urinaria deve 53.

(54) essere. svuotata. o. attraverso. la. minzione. volontaria. o. per. cateterizzazione o per compressione manuale, prima e in conclusione di ogni periodo di 24 ore. Per prevenire il catabolismo microbico delle proteine dell’urina nelle raccolte di 24 ore dovrebbe essere utilizzato un conservante (4) . La raccolta di urina di 24 ore rappresenta il metodo tradizionale e meglio accettato per la determinazione del contenuto proteico dell’urina. Gli svantaggi di questo tipo di metodica di indagine sono rappresentati in parte dal costo della gabbia metabolica, dal fatto che le raccolte di urina delle 24 ore sono scomode , richiedono tempo e, se si effettuano cateterizzazioni multiple, dal rischio di infezioni delle vie urinarie. In teoria la determinazione del rapporto tra le proteine e la creatinina urinaria (UP/UC) di un campione urinario evita l’impegno delle raccolte di 24 ore e fornisce informazioni superiori rispetto alla misura della concentrazione proteica. La creatinina viene escreta dal rene, nel gatto esclusivamente e nel cane quasi esclusivamente, attraverso la filtrazione glomerulare. Correlare la quantità di proteine escreta con le urine all’escrezione di una componente urinaria, quale la creatinina, elimina la variabilità legata alle modificazioni del volume urinario nelle 24 ore. Per il rapporto UP/UC il metodo normalmente utilizzato per l’analisi 54.

(55) della creatinina (metodo Jaffe) non è specifico per la creatinina stessa. Fortunatamente, a differenza del plasma, l’urina del cane contiene solo una piccola percentuale di cromogeni diversi dalla creatinina. Per misurare il rapporto UP/UC , una volta prelevato il campione viene analizzato per determinare la concentrazione delle proteine e della creatinina. I valori vengono espressi per entrambi in mg/dl. Dividendo la concentrazione delle proteine per quella della creatinina, si ottiene il rapporto UP/UC che viene indicato senza unità di misura. Ci sono dei fattori che influenzano il rapporto UP/UC(4) : a) Periodo del giorno. Studi iniziali effettuati su campioni urinari di volume ridotto (spot) prelevati tra le 10:00 e le 14:00 indicano un’eccellente correlazione tra il rapporto UP/UC e i valori delle raccolte di 24 ore. Studi successivi hanno rilevato una correlazione eccellente sia con i campioni prelevati casualmente durante il giorno sia tra quelli diurni e notturni. b) Tecniche di raccolta dell’urina. Non sono state messe in evidenza differenze significative per quanto riguarda la concentrazione proteica tra i campioni ottenuti con la minzione spontanea, con la cistocentesi o per cateterizzazione. Sia nel cane che nel gatto, nei campioni di urina dei maschi raccolta tramite minzione spontanea, era presente una concentrazione proteica superiore rispetto a quella delle femmine. Dato che tale 55.

(56) differenza non si riscontrava nei campioni raccolti per cistocentesi, i ricercatori hanno concluso che le maggiori concentrazioni proteiche presentate dai maschi erano legate alle proteine derivate dalle vie urinarie inferiori. c) Dieta.. L’apporto. proteico. della. dieta. influenza. significativamente il rapporto UP/UC sia nei gatti normali che in quelli con massa renale ridotta. Uno studio effettuato nel cane non ha evidenziato effetti di una dieta particolare sul rapporto UP/UC. La clearance della creatinina può essere aumentata dalle proteine dell’alimento.Un aumento proporzionale della proteinuria non provocherebbe variazioni del rapporto UP/UC, mentre una variazione non proporzionale della proteinuria rispetto alla clearance della creatinina potrebbe modificarlo. d) emorragia. Quando si verificano emorragie a livello delle vie urinarie le proteine plasmatiche si riversano nelle urine. In uno studio eseguito in vitro si è visto che, in seguito all’aggiunta di sangue intero all’urina, il rapporto UP/UC aumentava. e) Infiammazione.. Infezioni. delle. vie. urinarie. indotte. sperimentalmente hanno dimostrato che provocano un aumento del rapporto UP/UC, la cui entità però non è altamente correlata al numero di eritrociti o leucociti evidenziati nelle urine. 56.

(57) f) Esercizio. Nell’uomo l’esercizio fisico strenue può causare una transitoria proteinuria. In cani beagle normali sono stati valutati gli effetti del nuoto e della corsa su ruota. Il nuoto ha determinato un piccolo incremento della proteinuria mentre la corsa non ha provocato nessun effetto(4) . I valori del rapporto UP/UC nei cani normali varia da laboratorio a laboratorio, molto probabilmente a causa della metodica utilizzata per misurare la concentrazione delle proteine urinarie. Per l’interpretazione dei valori del rapporto UP/UC nei cani, si dovrebbero seguire le seguenti indicazioni: • 0-0,3 = normale • 0,3-1 = dubbio • > 1 = anormale Nel caso del gatto, sono stati eseguiti un minor numero di studi e, come limite inferiore dell’intervallo di normalità nell’adulto, è stato indicato un valore inferiore a 0,7. Nei gattini da 4 a 30 settimane di età il massimo rapporto UP/UC è risultato 0,34± 0,18(4) . Il rapporto UP/UC deve essere interpretato contestualmente ad altri dati. Si possono ottenere valori anormali in caso di ematuria o di infiammazione delle vie urinarie (piuria), sia di origine renale che postrenale. Se la causa dell’incremento del rapporto è un’infiammazione o 57.