Riassunto
In aggiunta alla sintesi de novo dei nucleotidi, è conosciuto un altro percorso per la formazione di questi composti: la cosiddetta “via di recupero”. Questo processo, che si ritiene essere universale, fa uso di basi e nucleosidi preformati o derivanti dalla degradazione degli acidi nucleici.
La purina nucleoside fosforilasi (PNP) è un enzima chiave nella “via di recupero” delle basi puriniche. La reazione che catalizza è una fosforolisi reversibile del legame N-glicosidico dei (deossi)ribonucleosidi purinici che dà come prodotti la base purinica e il (deossi)ribosio-1α-fosfato. La PNP è stata isolata e caratterizzata in una grande varietà di specie sia eucariotiche che procariotiche; questi studi hanno permesso di rilevare l’esistenza di due forme dell’enzima che differiscono per la loro specificità di substrato e per il loro peso molecolare: una forma omotrimerica di peso molecolare circa pari a 90 kDa, specifica per i ribonucleosidi e i 2'-deossiribonucleosidi della guanina e dell’ipoxantina; una forma omoesamerica di peso molecolare compreso tra i 110 e i 150 kDa che accetta un’ampia gamma di substrati compresi i ribonucleosidi e i 2'-deossiribonucleosidi dell’adenina. In generale si può ritenere che la forma trimerica della PNP sia caratteristica degli eucarioti pluricellulari e unicellulari, mentre quella esamerica sembra prevalere nei procarioti.
Nella presente tesi è stata studiata la PNP estratta da Tetrahymena thermophila, un ciliato oggi molto utilizzato in campo sperimentale, tanto da poter essere definito un vero e proprio sistema modello. In precedenza non erano stati compiuti tentativi di isolare enzimi delle vie di recupero da questo ciliato, pur essendoci in letteratura studi che dimostrano la sua dipendenza dall’apporto di basi puriniche preformate. Le indagini pubblicate sono relative a studi su colture cellulari o misurazioni su estratti grezzi, dai quali risulta che in Tetrahymena la purina nucleoside fosforilasi ha il ruolo principale di convertire i nucleosidi guanosina ed inosina nelle rispettive basi puriniche guanina e ipoxantina. Queste sono substrati dell’enzima ipoxantina-guanina-fosforibosiltransferasi
per la definitiva formazione dei nucleotidi guanilato (GMP) e inosinato (IMP). La sintesi di adenilato (AMP) è invece catalizzata dall’enzima adenina-fosforibosiltransferasi che utilizza la base purinica adenina di probabile derivazione esogena, visto che la purina nucleoside fosforilasi di T.
thermophila non mostra specificità verso l’adenosina. Questo nucleoside può in ogni modo entrare
nella via di recupero purinica grazie all’enzima adenosina deamminasi (anch’essa presente negli estratti grezzi del ciliato) che catalizza la deamminazione dell’adenosina con formazione d’inosina utilizzabile dalla PNP.
Nella presente ricerca è stato ottimizzato un metodo di purificazione della purina nucleoside fosforilasi di T. thermophila partendo da un estratto cellulare. Il preparato ottenuto è stato esaminato per determinare le principali proprietà dell’enzima: peso molecolare in condizioni native e denaturanti, punto isoelettrico tramite isoelettrofocalizzazione, KMper i substrati usati normalmente
nel saggio enzimatico (inosina e fosfato inorganico). Tramite elettroforesi su gel di poliacrilammide sia in condizioni native che denaturanti si è indagato su quale sia la forma di PNP (trimerica o esamerica) presente in T. thermophila.
