Risposte comportamentali a nuove esche proteiche nella mosca mediterranea della frutta, Ceratitis capitata

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Università di Pisa

Dipartimento di Scienze Agrarie, Ambientali e Agro-alimentari

Corso di Laurea Magistrale in Produzioni Agroalimentari e Gestione

degli Agroecosistemi

Risposte comportamentali a nuove esche proteiche nella

mosca mediterranea della frutta, Ceratitis capitata

(Wiedemann)

Relatori:

Prof. Angelo Canale

Dott. Giovanni Benelli

Candidata:

Valeria Zeni

Correlatore:

Prof. Giuseppe Conte

Anno Accademico 2018 - 2019

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“ Le maiuscole erano sempre il modo migliore

di cavarsela con tutto ciò per cui non si aveva una

risposta”

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Indice

Introduzione ……… 5

1. Ceratitis capitata (Wiedemann, 1824) ………7

1.1 Inquadramento tassonomico e distribuzione ………7

1.2 Morfologia ………...9

1.3 Ciclo biologico ………...13

1.4 Tipologia di danno ……….14

1.5 Strategie di difesa ………..16

1.5.1 Mezzi chimici ………..16

1.5.2 Mezzi biologici ………17

1.5.3 Mezzi biotecnici ………...19

2. Materiali e metodi ……….22

2.1 Allevamento di C. capitata ………22

2.2 Biosaggi con l’olfattometro statico ………22

2.3 Biosaggi nel flight tunnel ………...24

2.4 Biosaggi in condizioni di semi-field ………...25

2.5 Feeding test ………...27

2.6 Analisi statistica ……….27

3. Risultati ……….29

3.1 Biosaggi con l’olfattometro statico ………....29

3.2 Biosaggi nel flight tunnel ………...33

3.3 Biosaggi in condizioni di semi-field ………..34

3.4 Feeding test ………...35

4. Discussione ……….36

5. Conclusioni ……….38

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Introduzione

La mosca mediterranea della frutta, Ceratitis capitata (Wiedemann, 1824), è un pest molto dannoso per diverse specie vegetali a livello globale.

Il controllo di questo pest, sebbene sia ancora incentrato sull’utilizzo dei prodotti chimici di sintesi, si sta sempre più indirizzando verso l’utilizzo di mezzi di controllo a minore impatto ambientale.

Tra i diversi metodi di controllo a basso impatto ambientale la tecnica del lure and kill rappresenta una buona metodologia di controllo del pest, sebbene necessiti di ulteriori implementazioni.

Il lure and kill come descritto da Howse et al. (1998) consiste nell’unione di due componenti: il lure che è l’attrattivo e può essere costituito sia da segnali visivi od odorosi sia da una combinazione di entrambi, mentre il kill è la parte costituita da insetticidi, regolatori di crescita, sterilizzanti od organismi patogeni – batteri, funghi, virus etc.. Tra i diversi segnali odorosi utilizzabili ci sono i semiochimici e gli attrattivi di origine alimentare, quest’ultimi capaci di mimare sia il sito di ovideposizione sia la fonte alimentare di cui si nutrono gli adulti (Epsky et al., 2014).

Nel caso della mosca mediterranea della frutta, questi segnali odorosi possono essere sia sesso-specifici attraendo solamente uno dei due sessi – ad esempio l’utilizzo del feromone maschile Trimedilure utilizzato durante il lekking (Shelly et al., 1996) – oppure attrattivi nei confronti di entrambi, come nel caso gli attrattivi di origine alimentare.

La presente tesi, nata dalla collaborazione tra il Dipartimento di Scienze Agrarie, Alimentari e Agro-alimentari dell’Università di Pisa e un’azienda leader nel mercato di attrattivi e feromoni, si pone l’obiettivo di identificare tra cinque esche proteiche di recente formulazione, quella più efficace in termini di

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attrattività nei confronti delle femmine di C. capitata. Infatti, lo sviluppo di nuovi ed efficienti attrattivi alimentari per C. capitata è di fondamentale importanza per la messa a punto di sistemi di controllo affidabili all’interno dell’approccio lure and kill.

Inizialmente, l’attrattività delle cinque nuove esche è stata valutata in condizioni di laboratorio mediante l’utilizzo di olfattometri statici, seguendo il metodo di Benelli et al. (2013) con alcune modifiche. Successivamente, il composto più attrattivo è stato testato sia in flight tunnel sia in condizioni di semi-field, in entrambi i casi a dosi comparabili a quelle da utilizzarsi in campo. Le performances del composto sono state comparate con l’attrattivo commerciale SEDQ lure, uno degli attuali attrattivi presenti sul mercato.

Infine, sono state eseguite alcune osservazioni per la valutazione dell’appetibilità del composto, attraverso la misurazione della durata dell’atto trofico.

Questa tesi rappresenta, dunque, il primo step per la creazione di un innovativo dispositivo per il controllo della mosca mediterranea della frutta, che aumenti l’efficacia del metodo di controllo lure and kill.

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I. Ceratitis capitata (Wiedemann)

1.1 Inquadramento tassonomico e distribuzione

Ceratitis capitata (Wiedemann, 1824), nota anche come mosca mediterranea della frutta o medfly, è un fitofago frugivoro cosmopolita. C. capitata appartiene alla famiglia Tephritidae (Diptera) che comprende più di 5.000 specie diffuse a livello mondiale, un terzo delle quali si sviluppa in frutti carnosi. I quattro principali generi di questa famiglia, Ceratitis, Bactrocera, Anastrepha e Rhagoletis, includono importanti specie infestanti (White and Elson-Harris, 1992). Il genere Ceratitis comprende circa 78 specie, tra le quali la C. capitata è la più nota (White et al., 2000). In termini ecologici la maggior parte dei tefritidi è stenotopica, occupando solamente particolari tipi di habitat e avendo stretti ambiti di tolleranza o specifiche necessità. Al contrario, un piccolo numero di specie, tra le quali C. capitata, è euritopico, ciò significa in grado di adattarsi a diverse nicchie ecologiche avendo minori esigenze per la loro sopravvivenza (Maddison et al., 1989).

C. capitata è originaria dell’Africa sub-sahariana e presenta una notevole capacità invasiva e di adattamento soprattutto nelle regioni a clima tropicale, dove trova le condizioni ottimali per il proprio sviluppo. Attualmente, è presente in Africa, America Latina e Centrale, Australia e nel Sud-est Asiatico. In California, dove fece la sua prima comparsa a metà degli anni 70 del secolo scorso, la medfly è stata eradicata nel novembre 2018. In Europa, grazie alle condizioni climatiche favorevoli al proprio sviluppo, si è ampiamente diffuso nelle zone circummediterranee (Figura 1.1) (EPPO, https://gd.eppo.int/taxon/CERTCA/distribution/US_ca).

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In Italia, il fitofago è stato registrato per la prima volta in Calabria nel 1863 dove, nei pescheti colpiti, il tasso di infestazione ha raggiunto anche il 100%. In seguito l’areale di distribuzione si è ampliato fino ad avere 2-3 generazioni l’anno nella valle del Po’ (Fimiani et al., 1989; Rigamonti et al., 2002) e infestazioni stagionali nella regione del Trentino-Alto Adige (Ioriatti et al., 2013).

Figura 1.1. Dati sulla presenza globale di C. capitata. Paesi/regioni dove la mosca mediterranea della

frutta è presente sono evidenziati in giallo, le aree dalle quali è stata eradicata in verde. (Szyniszewska and Tatem, 2014)

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9 1.2 Morfologia

L'adulto (Figura 1.2) è lungo 4-6 mm, con il corpo a tonalità grigie e giallastre; i maschi sono più piccoli delle femmine. Ha un capo giallastro con occhi rossi e iridescenti nell'insetto vivo; la fronte del maschio presenta due lunghe setole ingrossate all'apice (capitate) a forma di spatole, da cui derivano sia il nome generico che quello specifico (dal greco kera, corno, e dal latino capitatus, a testa grossa); esse hanno, forse, un ruolo nella comunicazione sonora e visiva. Il torace è nero con macchie bianche che formano un disegno caratteristico. L'addome è arrotondato nel maschio, affusolato all'estremità nella femmina ed è di colore giallo-rossastro con due bande grigie nel III e V urite. Le ali (Figura 1.3) mostrano una caratteristica pigmentazione zonale, con una stria longitudinale bruno-aranciata lungo il margine costale e altre due trasversali, più brevi, sempre di colore bruno-aranciato. La femmina presenta un ovopositore di sostituzione ben visibile (Tremblay et al., 1994; Thomas et al., 2019).

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Figura 1.2. Vista dorsale dell'adulto della mosca Mediterranea della frutta, C. capitata.

Credits: Ken Walker, Museum Victoria, Melbourne, Australia. www.forestryimages.org

Figura 1.3. Ala di adulto di mosca Mediterranea della frutta, C. capitata. Le ali sono ialine con

striature marroni e nere. È presente una banda giallo-marrone che attraversa il centro dell’ala. Credits: Ken Walker, Museum Victoria, Melbourne, Australia. www.forestryimages.org

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11 L’uovo ha una forma allungata e leggermente ricurva con dimensioni di circa 1 x 0.2 mm, di colore bianco lucente con area micropilare sporgente; la femmina depone più uova all’interno della cavità creata con l’ovopositore nel substrato (Figura 1.4) .

La larva è di forma cilindrica, lunga da 7 a 9 mm e da 1 a 2 mm di diametro; di colore bianco-giallastro pallido, si assottiglia leggermente verso l’estremità cefalica. Oltre alla testa, piccola e retrattile, sono presenti 11 segmenti della stessa lunghezza circa. Nella parte anteriore del capo sono presenti delle strutture sensoriali (sensori e sensilli placoidei) e un apparato boccale dove si individuano gli uncini boccali e i lobi orali. La larva è carpofaga, e vive e si nutre della polpa di numerose specie di frutti che, quando attaccati, subiscono una rapida marcescenza della polpa (Figura 1.5).

Lo stadio di pupa si sviluppa all’interno del pupario, capsula ellittica formata dalla vecchia cuticola larvale indurita, di colore rossastro. Il pupario è lungo 4-5 mm. In alcuni ceppi i pupari da cui sfarfalleranno le femmine sono di colore bianco, quelli da cui sfarfalleranno i maschi sono invece bruno-rossastri (Figura 1.6)(Tremblay et al. 1994;Thomas et al., 2019).

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Figura 1.4. Uova di C. capitata. Credits: Jeffery Lotz, Florida Department of Agriculture

and Consumer Services-Division of Plant Industry; www.forestryimages.org

Figura 1.5. Larva di C. capitata, la zona cefalica è sulla sinistra. Credits: Jeffrey Lotz, Florida

Department of Agriculture and Consumer Services - Division of Plant Industry. www.forestryimages.org

Figura 1.6. Pupa di C. capitata. Credits: JeffreyLotz, Florida Department of Agriculture and

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13 1.3 Ciclo biologico

La mosca della frutta sverna allo stadio di pupa nel terreno, lo farfallamento degli adulti avviene, solitamente, nel mese di maggio-giugno. Dopo l’accoppiamento, la femmina va alla ricerca del frutto ottimale per la deposizione delle uova, prediligendo quelli ad elevato tenore zuccherino, basso grado di acidità e con polpa tenera . Esiste perciò una scala di preferenza che orienta le infestazioni con il procedere della stagione. La prima generazione, a maggio-giugno, si sviluppa sulle Drupacee, per poi passare sulle Pomacee e varietà precoci di kaki nelle generazioni estive-autunnali. Infine, in autunno, si sposta su kaki, su fico d’india e sugli agrumi, prediligendo le varietà precoci di arance (Navel) e le clementine . Il numero di generazioni varia da 2 a 3 in centro Europa, fino a 6-7 generazioni annue nelle zone circumediterranee (Figura 1.7).

All’atto della deposizione, la femmina estroflette l’ovopositore, che penetra l’epicarpo del frutto prescelto, e depone al suo interno da un minimo di 4-6 a un massimo di 10 uova. La femmina effettua diverse punture su uno stesso frutto,

Figura 1.7. Ciclo evolutivo medio della mosca Mediterranea della frutta, C. capitata. In R. Bovay

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ciò comporta la presenza di diverse decine di uova al suo interno. Il periodo di incubazione può variare, a seconda della stagione, da un minimo di 48h nel periodo estivo (T=26-28°C) fino a 4-7 giorni durante la stagione invernale (T=15-16°C).

Successivamente al periodo di incubazione, le larve si sviluppano all'interno della polpa provocandone il disfacimento. A maturità raggiunta, le stesse fuoriescono dal frutto, si lasciano cadere e s'impupano nel terreno. Contrariamente a quanto accade nella mosca delle olive, Bactrocera oleae (Rossi), le larve di C. capitata si impupano sempre esternamente al frutto (Thomas et al., 2019)

Lo sviluppo della mosca dipende fortemente dalle condizioni termiche, infatti la temperatura ottimale è quella intorno ai 32°C, che consente il compimento di una generazione in 2 settimane.

Nelle regioni tropicali e subtropicali, dove sono presenti condizione climatiche favorevoli, la specie è attiva tutto l'anno, risultando così molto dannosa (Fimiani e Tranfaglia 1972).

In Italia meridionale e in generale nelle regioni ad inverni miti, il dittero può avere uno sviluppo continuo senza diapausa (Pollini 1968).

1.4 Tipologia di danno

La mosca mediterranea della frutta è una specie altamente polifaga, che attacca fino a 300 specie differenti di piante sia di interesse commerciale che selvatiche (Liquido et al. 1990, 1991). Il danno è a carico dei frutti, presentando una evoluzione sintomatica differente a seconda della specie attaccata e dei fattori ambientali. In generale si può dire che, nei primi giorni i sintomi sono poco visibili, ma ben presto la parte del frutto circostante la puntura diventa più scura

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15 e, in seguito allo sviluppo larvale la polpa imbrunisce e diventa marcescente. Ad alte temperature il deterioramento di un frutto colpito si verifica in pochi giorni. Negli agrumi si forma un alone intorno alla puntura. Sui frutti verdi si nota una leggera decolorazione in corrispondenza dell'alone, che tende poi a invaiare più precocemente delle zone non punte. Alcune tra le colture più sensibili all’attacco di C. capitata sono l’albicocco, il pesco, il melo, il pero, il kaki, il fico d’india, l’arancio e il clementino (Caponero et al. 2014).

La mosca mediterranea della frutta è inserita nella lista A21_{stilata dall’EPPO su}

gli organismi da quarantena.

Secondo White and Elson-Harris (1992), la stima monetaria dei danni causati ai prodotti vegetali dalle mosche della frutta è difficilmente calcolabile. Essi riportano come esempio applicativo una stima di Anon (1986) secondo la quale, in Australia a fronte di una produzione valutabile in 850.000 milioni di dollari, le perdite produttive, dovute alla mosca della frutta, ammontano a circa 100.000 milioni di dollari.

1_{La lista A2 comprende organismi di quarantena già presenti nell’area, ma non largamente}

diffusi e considerati sotto controllo ufficiale.

Figura 1.8. Danno causato dalla larva di mosca Mediterranea della frutta, C. capitata, su frutti di caffè

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1.5 Strategie di difesa

La difesa dei fruttiferi dalla mosca mediterranea della frutta si è, da sempre, rivelata problematica. Le modalità di controllo di questo fitofago nonostante siano ancora incentrate sull’impiego di insetticidi chimici di sintesi, presentano negli ultimi anni una maggiore diffusione di metodi di controllo a basso impatto ambientale.

1.5.1 Metodi chimici.

Successivamente alla rivoluzione verde, fine anni 60 / inizio anni 70 del secolo scorso, si è verificato un aumento nell’utilizzo di prodotti chimici di sintesi per il controllo degli insetti dannosi. Infatti, negli anni passati, come riporta Tremblay (1973), i prodotti utilizzati per difendere le colture dalla mosca mediterranea della frutta erano principalmente fosforganici ad azione sia larvicida sia adulticida, utilizzati sotto forma di spray. I principi attivi maggiormente utilizzati erano il Mercaptothion, il Parathion e il Dimetoato. I primi due sono stati revocati dal mercato in quanto presentavano effetti nocivi su organismi non-target, mentre il terzo è ancora presente sul mercato come principio attivo, ma in via di revoca il 30 Giugno 2020.

Attualmente sono ammesse sostanze attive di contatto, ad esempio i piretroidi, e il neonicotinoide, Acetamiprid. I primi sono gli analoghi sintetici delle piretrine, costituenti naturali dei fiori di Tanacetum cinerariifolium. Esplicano la loro azione per contatto ed agiscono per il prolungamento dell’apertura dei canali del Na+_{e depolarizzazione permanente della membrana assonica, causando}

dapprima paralisi e poi morte dell’insetto. L’Acetamiprid, invece, appartiene alla classe dei neonicotinoidi e ha un’azione acetilcolinomimetica. Una volta ingerito, i neonicotinoidi si sostituiscono all’Acetil-CoA, rendendo permanente

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17 l’apertura dei canali del Na+_{, e causando poi sovraeccitazione, paralisi,}

disidratazione e infine la morte dell’insetto.

Negli ultimi anni sono stati registrati dei fenomeni di resistenza da parte di C. capitata nei confronti di alcuni insetticidi. In particolar modo è stata osservata, in Brasile, la resistenza acquisita al principio attivo della deltametrina, sostanza attiva appartenente ai piretroidi (Lisi Demant et al., 2019). A ragion di ciò, è sempre maggiore la spinta verso la ricerca di nuovi metodi di controllo del pest che siano incentrati sulla difesa integrata (IPM) e/o biologica.

1.5.2 Metodi biologici.

La mosca mediterranea della frutta ha svariati nemici naturali, sia parassitoidi che predatori, ma pochi di loro sono risultati efficaci per il controllo e la maggior parte ha avuto un effetto limitato nel tempo (Clauser 1978).

Tra i tentativi condotti più efficaci per il controllo biologico di C. capitata, si registra l’impiego degli imenotteri braconidi Fopius arisanus (Sonan) e F. ceratitivorus (Wharton) alle Hawaii.

Il primo, introdotto alla fine degli anni 50 del secolo scorso per il controllo della mosca asiatica, Bactrocera dorsalis (Hendel), si è dimostrato efficace anche nel controllo della mosca mediterranea della frutta. È imenottero braconide appartenente alla sottofamiglia delle Opiinae, parassitoide oo-larvale, che parassitizza preferibilmente le uova (Carmichael et al., 2005), e in alcuni casi le larve (Manoukis et al., 2011). La percentuale di parassitizzazione del braconide varia dal 53,6% al 88,4% a diverse latitudini (Vargas et al., 2001). Nonostante l’elevata efficacia, l’impiego di F. arisanus ha riscontrato alcune problematiche, tra cui il limitato areale di diffusione. È infatti noto che, la presenza del parassitoide, è minore ad altitudini elevate rispetto alle pianure. Ciò è da

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ricercare nel fatto che il suo ospite primario B. dorsalis non si sviluppa ad altitudini superiori a 750 m. D’altro canto, è noto che la mosca mediterranea della frutta si adatti meglio ad aree temperate ed è abbondante fino a 1200 m di altitudine (Vargas et al., 1983; Wong et al., 1983). Si è resa dunque necessaria la ricerca di altri parassitoidi che potessero avere una efficacia maggiore anche ad altitudini diverse.

È stata resa nota la presenza di un parassitoide oo-larvale, F. ceratitivorus, che in condizioni di laboratorio risulta avere efficacia, in termini di parassitizzazione, simile a quella di F. arisanus (Wang et al.,2004, 2008). Alcuni esperimenti condotti in Guatemala e in Israele hanno mostrato che F. ceratitivorus abbia una migliore performance in termini di sex ratio e di complessivo tasso di parassitizzazione sia in condizioni di laboratorio sia in prove in gabbia sul campo (Argov and Gazit, 2008; Rendón et al., 2006). Inoltre, è stato osservato che F. arisanus e F. ceratitivorus possono essere lanciati contemporaneamente perché non sussistono delle interferenze intra-specifiche. L’efficacia dell’utilizzo sinergico di questi due parassitoidi è da ricercare, non solo nell’ecologia degli insetti, ma anche nel target. Infatti, F. arisanus parassitizza uova deposte da un numero di ore inferiori rispetto a F. ceratitivorus. L’utilizzo sinergico dei due parassitoidi permetterebbe, dunque, di ampliare l’area di controllo e di contribuire a un migliore controllo nazionale della popolazione di C. capitata (Kroder et al., 2010) (Figura 1.9).

Inoltre C. capitata è suscettibile ad una gamma di funghi entomopatogeni – tra cui Entomorphtora muscae, Beauveria bassiana – e nematodi entomopatogeni, – ad esempio Heterorhabditis bacteriophora, Steinernema riobrave (Argov and Gazit, 2008; Malan and Manrakhan, 2009; Oreste et al., 2015; Uziel et al.,

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19 2003). Sono stati sviluppati formulati commerciali che includono questi agenti patogeni o parassiti che si possono rivelare utili nel controllo della mosca.

1.5.3 Mezzi biotecnici.

Il controllo con i mezzi biotecnici prevede l’uso di prodotti derivati da organismi naturali e manipolazioni intraspecifiche (fisiologiche – etologiche – riproduttive) tramite l’impiego di mezzi tecnici. Nei programmi di difesa integrata vengono utilizzati prodotti attrattivi, repellenti, regolatori e inibitori di crescita. I mezzi biotecnici per eccellenza sono i semiochimici e la tecnica dell’insetto sterile (SIT).

Per quanto riguarda l’utilizzo di semiochimici è nota, nel caso di C. capitata, sia l’azione anti-deponente del feromone marcante della femmina, sia il Trimedlure (1,1- dimetiletil 4 (and 5) cloro-2-metilcicloesano1- carbossilato), che, mimando il ferormone rilasciato dai maschi per rilevare i siti di aggregazione (lekking) pare sia il maggior attraente noto (Shelly et al., 1996).

Nel monitoraggio e controllo del pest, svolgono un ruolo fondamentale le trappole che si basano su segnali visivi o innescate con attrattivi olfattivi – mass trapping e lure and kill.

Il mass trapping è una tecnica che prevede la cattura, di uno o ambo i sessi, mediante l’utilizzo di trappole innescate con semiochimici, diminuendo così il

A B

Figura 1.9. (A) F. ceratitivorus, parassitoide oo-larvale (vista laterale). (B) F. arisanus, parassitoide

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potenziale riproduttivo della specie e portandolo al di sotto di una soglia di danno. Il lure and kill, differisce per una caratteristica, ovvero l’insetto, una volta attirato dal semiochimico, non è “intrappolato”, ma è soggetto a composti che lo uccidono o lo sterilizzano, eliminandolo effettivamente dalla popolazione (Howse et al., 1998). L’utilizzo dei semiochimici è particolarmente indicato per il controllo della popolazione maschile, mentre per le femmine sono utilizzate delle esche alimentari a base di proteine idrolizzate e sostanze ammoniacali che, unite all’azione di un insetticida, portano alla morte dell’insetto (Mazor et al., 1987). Uno degli insetticidi più utilizzato in questo ambito è lo Spinosad, insetticida di origine naturale ad ampio spettro d’azione, estratto dai prodotti del metabolismo di colture artificiali dell’attinomicete tellurico Saccharopolyspora spinosa. È costituito dalla miscela di due tossine prodotte dal metabolismo dell’attinomicete, denominate rispettivamente spinosina A e spinosina B. Entrambe le tossine appartengono ad una categoria di sostanze ad attività biocida, gli spinosoidi o spinosine (Adán et al., 1996).

L’altro mezzo biotecnico di controllo efficace è la tecnica dell’insetto sterile (SIT). È definibile come una lotta autocida ad azione specie-specifica ed è progettato per un utilizzo su ampia scala. Si basa sull’allevamento massale dell’insetto, solitamente dei maschi, sulla sterilizzazione e sul lancio ripetuto degli insetti sterili ottenuti al fine di ridurre progressivamente la capacità riproduttiva della specie dannosa mediante accoppiamenti infecondi tra gli adulti selvatici e quelli resi infecondi (Lance and McInnis, 2005).

Come riportato da Saccone et al. (2007), in Guatemala, dove la mosca mediterranea della frutta mette a rischio la coltivazione del caffè, sono stati rilasciati 150 milioni di maschi sterili di C. capitata a settimana. Le femmine, una volta accoppiate, depongono l’uovo all’interno del frutto dal quale si

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21 svilupperà la larva che, mediante l’atto trofico, causa danni irreversibili al frutto. Con la tecnica dell’insetto sterile, l’unico danno causato dalla femmina di C. capitata è la ferita di ovideposizione. I ceppi di C. capitata utilizzati nella prova sono stati selezionati mediante l’uso di marcatori genetici, mutazioni e traslocazioni cromosomiche.

La SIT può essere utilizzata sia come unica tecnica di controllo del pest sia in combinazione con altri metodi di controllo all’interno dell’IPM. Uno dei grandi limiti di questa tecnica è la necessità di applicarla su ampia scala (Klassen, 2005).

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II. Materiali e metodi

2.1 Allevamento di C. capitata

Il ceppo di C. capitata utilizzato nei biosaggi deriva da allevamenti di laboratorio presenti presso la sezione di Entomologia Agraria dell’Università di Pisa sin dal 1990.

Gli insetti sono allevati come descritto da Canale e Benelli (2012). Le mosche vengono allevate all’interno di gabbie cilindriche in PVC, ognuna delle quali contiene circa 2000 adulti – sex ratio 1:1. Gli adulti si nutrono di una dieta solida, composta da zucchero e lievito (10:1). Le uova sono raccolte ogni due giorni e distribuite in vassoi di plastica (50 x 50 x 2 cm) ognuna contenente 0.5 kg di mezzo di coltura artificiale.

L’allevamento è mantenuto in condizioni di laboratorio a 25 ± 1 °C, 45 ± 5% UR e con un fotoperiodo di 16:8 (L:D).

Per ogni biosaggio eseguito, le femmine di C. capitata accoppiate, di età compresa tra 8 e 12 giorni, sono state scelte casualmente.

2.2 Olfattometro statico

L’attrattività delle cinque nuove esche proteiche nei confronti delle femmine della mosca mediterranea della frutta, è stata inizialmente valutata utilizzando un olfattometro statico descritto da Benelli et al. (2013). Il quantitativo di sostanza testata è stata di 0.3 g e 0.03 g su un disco di carta filtro dal diametro di 6 cm (Whatman n.1). La sostanza è stata fatta areare per 1 ora prima dell’inizio del test. I cinque composti sono stati testati vs. un controllo negativo, costituito da un filtro pulito dal diametro di 6 cm (Figura 2.1).

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23 Per ogni dose, 0.3 g e 0.03 g, sono state rispettivamente testate 40 e 50 femmine accoppiate (8-12 giorni). Le mosche sono state gentilmente trasferite all’interno dell’olfattometro e il numero di medflies presente in ciascuna camera è stato registrato a 1, 5 e 24 ore dall’inizio del test (Benelli et al., 2013). La stanza aveva una temperatura di 25 ± 1°C e UR di 45 ± 5 %.

Le femmine testate sono state affamate 24 ore prima dell’esperimento e l’acqua è stata fornita ad libitum fino al test. Seguendo il metodo di Benelli et al. (2013), in ciascuna replica, le due camere sono state orientate casualmente e l’olfattometro è stato ruotato, in senso orario, di 90° per evitare effetti di posizione. Inoltre, per evitare l’”effetto luce”, ciascun olfattometro è stato coperto da due fogli di carta filtro color bianco. Al termine dell’esperimento, le parti in vetro dell’olfattometro sono state lavate con acqua calda e sapone e poi

Figura 2.1. (a) Rappresentazione schematica dell’olfattometro statico utilizzato nel

biosaggio preliminare per valutare l’attrattività dei baits di nuova formulazione. A e B – vasi di vetro (V= 500 ml) ciascuno contenente il filtro di carta, uno innescato con il bait e l’altro bianco. C – tubo di connessione in PVC. D – Bottiglie (PET) trasparenti (L= 300 mm, ∅l =100 mm, ∅s = 25 mm). E – zona di ventilazione costituita da una rete 5 x 6 cm (F). G – foro di entrata ∅= 30 mm. (b) Set-up completo di un biosaggio.

a

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sciacquate con acqua fredda, le parti in PET sciacquate diverse volte con acqua fredda. Per ciascun attrattivo alimentare sono state fatte almeno 9 repliche. Per validare l’efficacia del test preliminare, è stato testato, con lo stesso procedimento, anche un attrattivo alimentare per C. capitata già presente sul mercato, il SEDQ (Barcellona, Spagna). Sono stati testati 0.03 g di SEDQ vs. un controllo negativo. Una volta pesata la dose, il SEDQ è stato areato per 7 e 3 giorni prima del test, replicando le prove 11 e 12 volte, rispettivamente.

Successivamente, è stato testato un bait di nuova formulazione - bait 5 - teoricamente più efficace in termini di attrattività rispetto al bait 4 in quanto la formulato a partire da quest’ultimo.

2.2 Biosaggi nel tunnel del vento

Per validare ulteriormente l’attrattività delle esche, è stato deciso di testarle nel tunnel del vento (Figura 2.2), seguendo il metodo di Guillén et al. (2016) con alcune modifiche. I biosaggi hanno avuto lo scopo di verificare la risposta delle femmine di C. capitata al bait risultato più attrattivo nei test preliminari, al controllo negativo e, infine, al controllo positivo – SEDQ lure. I test sono stati condotti utilizzando un tunnel del vento in Plexiglass (40 x 40 x 150 cm) con un flusso d’aria laminare continuo di 1.92 L/min (~ 0,02 m/s).

Il bait 4 e il controllo positivo sono stati formulati su un “lure septa” (Wheaton Rubber Straight Plug Stopper, diameter: 20 mm) che è stato fissato al centro di una trappola commerciale bianca (Plastic Delta Sticky Trap Insert, Alpha Scents Inc., 1089 Willamette Falls Dr, West Linn, OR 97068, USA, 16 x 17,5 cm). La dose testata per entrambi i lures è stata 0.03 g. Una volta innescata, la trappola adesiva è stata appesa nella porzione finale del tunnel (settore 1), controvento, mentre 40 femmine – affamate per 24 ore – sono state rilasciate nella porzione

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25 opposta, a favore di vento. Il numero di femmine catturate dalla trappola è stato registrato a 24 ore dall’inizio del test. La percentuale di cattura è stata calcolata dividendo il numero di medflies catturate per singola trappola per il numero totale delle mosche rilasciate nel tunnel (x100%). I biosaggi sono stati condotti in condizioni di laboratorio a 22 ± 1 °C, 75 ± 5% UR e con un fotoperiodo di 16:8 (L:D). Sono state eseguite almeno 9 repliche per ogni composto testato, controlli inclusi.

2.4 Biosaggio in condizioni di semi-field

Le prove in semi-field sono state condotte all’interno della serra tunnel (2 x 9 m), la quale è suddivisa, come si vede in Figura 2.3, in 5 settori. La prova ha avuto luogo nel quarto (2 x 1,8 m).

Il set-up del biosaggio consiste in 4 trappole (40 x 40 cm, della stessa tipologia utilizzata nel biosaggio nel flight tunnel) aventi doppia faccia adesiva (ricavate dall’unione di due singole trappole), ognuna delle quali occupa uno dei vertici di un rettangolo immaginario di 1 m x 1.8 m (Figura 2.3). Due trappole sono state innescate con l’attrattivo di nuova formulazione e altre due con il SEDQ lure, entrambi a dosi pari a 0.3 g. In ciascuna replica, le trappole innescate con lo stesso attrattivo sono state posizionate ai vertici opposti del rettangolo

Figura 2.2 Tunnel del vento a flusso laminare continuo in Plexiglass (40 x 40 x 150 cm,) con un flusso

di aria pari a 1,92 L/min (0,02 m/s). La trappola è stata posizionata nel settore 1 del flight tunnel, mentre le femmine di mosca mediterranea della frutta sono state rilasciate nel settore 6.

Settore 1 Settore 6 Settore 5 Settore 4 Settore 3 Settore 2

(26)

immaginario – posizione 1,3 o posizione 2,4. Le mosche, 100 femmine accoppiate (8-12 giorni), sono state rilasciate al centro del rettangolo immaginario.

Inoltre, ad ogni replica, le posizioni dei composti sono state invertite in modo da annullare l’”effetto posizione”.

Il dato di cattura delle singole trappole è stato registrato a 24 ore dall’inizio della prova. La percentuale di cattura è stata calcolata dividendo il numero di medflies catturate per singolo attrattivo per il numero di mosche totali rilasciate (x 100%).

Figura 2.3. Apparato sperimentale usato nei biosaggi in semi-field nella serra tunnel.

Sono stati testati il bait 4 vs. SEDQ lure, entrambi a dosi pari a 0.3 g per trappola (2 trappole/attrattivo in una data area). I punti blu (1,2,3 e 4) rappresentano la posizione della sticky trap innescata con i due attrattivi, mentre il punto giallo rappresenta il punto di rilascio delle femmine di medfly.

(27)

27 2.5 Feeding test

Il biosaggio consiste nella valutazione dell’appetibilità di un composto attraverso l’osservazione di un eventuale atto trofico, da parte di una femmina di mosca, e della sua durata (Figura 2.4).

Le osservazioni sono state condotte all’interno di un Petri-dish dal diametro di 10 cm, sul cui fondo è stato posto un disco di carta da filtro dal diametro di 10 cm (Whatman n.1) con una goccia di bait (~ 0.01 g, fatto areare per 30 minuti). All’interno del Petri-dish sono state rilasciate 5 mosche ed è stato osservato il loro comportamento per i successivi 10 minuti. In totale sono state eseguite 10 repliche. La percentuale di mosche che si è nutrita del bait è stata calcolata dividendo il numero di medflies che hanno effettuato l’atto trofico per il numero di mosche totali osservate (x 100%). I biosaggi sono stati condotti in condizioni di laboratorio a 25 ± 1 °C, 45 ± 5% UR e con un fotoperiodo di 16:8 (L:D).

2.3 Analisi statistica

Per comparare il numero di mosche che sceglievano una determinata esca il test del chi quadro con correzione di Yates (Sokal and Rohlf, 1981) è stato utilizzato per la prova preliminare con l’olfattometro statico, per le prove in flight tunnel e in semi-field. Le scelte delle mosche nelle varie repliche sono stata analizzate utilizzando il software JMP 9 (SAS Institute Inc., Cary, NC, United States). Le scelte delle mosche nei diversi biosaggi sono state analizzate utilizzando i test non parametrici di Wilcoxon e di Kruskal-Wallis (Cao et al., 2019), con p=0.05 come soglia di significatività.

È stata utilizzata la statistica non parametrica perchè la “bontà di adattamento” del test che valuta la distribuzione dei dati sottolinea che non sono né

(28)

normalmente distribuiti (Shapiro-Wilk test, p<0.01) né omoschedastici (Levene test, p<0.01).

Per l’analisi statistica del feeding test è stata dapprima calcolata la media delle percentuali delle mosche che si nutrono dell’attrattivo alimentare; successivamente per l’analisi della durata dell’atto trofico è stato eseguito un modello lineare misto a misure ripetute:

Yij =µ + FTi + Ij[FTi] + eij dove

Yij = durata dell’atto trofico

µ = media

FTi = effetto fisso dell’i-esimo feeding test (9 livelli)

Ij[FTi] = effetto casuale della j-esima mosca (32 livelli)

eij = errore casuale

Dall’analisi, è stata esclusa la replica FT_10, in quanto solamente un individuo si è nutrito del bait; ciò potrebbe essere dovuto ad effetti casuali, quali la scelta della mosca o il minore assorbimento dell’attrattivo nel filtro.

(29)

29 III. Risultati

3.1 Olfattometro statico

Nei controlli a 1 ora e a 5 ore per entrambe le dosi testate (i.e., 0.3 e 0.03 g) di tutti e quattro i baits, il numero totale di femmine di C. capitata che ha scelto è molto basso, impedendo quindi l’analisi statistica. Dunque, l’approccio statistico si è incentrato solamente sui dati raccolti a 24 ore dall’inizio della prova, in accordo con gli studi recentemente condotti da Benelli et al. (2013).

Analizzando i dati a 24 ore del test a due scelte (Figura 3.1), è stato osservato che, testando una dose pari a 0.3 g, solamente il bait 4 è risultato essere attrattivo nei confronti delle femmine di C. capitata (χ²=3.72, d.f.=1, p=0.05* ). I dati del bait 2 vs. controllo negativo e del bait 3 vs. controllo negativo non sono, invece, significativi (rispettivamente: χ²=1.050, d.f.=1, p=0.306 e χ²=2.438, d.f.=1, p=0.118). Infine, è stata notata un’innata chemiotassi negativa testando il bait 1 vs. bianco (χ²=7.825, d.f.=1, p=0.005 *).

I risultati a 24 ore dei biosaggi, con dose 0.03 g, hanno confermato il trend osservato nelle precedenti prove con dose 0.3 g. Il bait 4 è risultato significativamente attrattivo nei confronti delle femmine di mosca mediterranea della frutta (χ²=4.383, d.f.=1 p=0.036 *). D’altro canto, non sono state evidenziate significative differenze per quanto riguarda bait 2 vs. bianco (χ²=0.294, d.f.=1, p=0.588), bait 3 vs. bianco (χ²=0.071, d.f.=1, p=0.789) e bait 1 vs. bianco (χ²=2.469, d.f.=1, p=0.116) (Figura 3.2). Nel caso del bait 1 vs controllo a dose di 0.03 g non è stata più riscontrata un’innata chemiotassi negativa, come osservato nel biosaggio con dose 0.3 g.

(30)

Infine, il SEDQ è stato testato come controllo positivo vs. bianco ed è risultato significativo sia dopo tre giorni di arieggiamento (χ²=17.454, d.f.=1, p<0.0001 ***) sia dopo 7 giorni(χ²=5.064, d.f.=1, p=0.024 *) (Figura 3.3).

I test condotti in olfattometro statico, seguendo il protocollo descritto in precedenza, hanno però mostrato che non esistono differenze significative tra il bait 5 e il controllo bianco (χ²=-0.553, d.f.=1. p=0.580) (Figura 3.4), motivo per cui è stata esclusa quest’esca dalle successive prove sia in tunnel del vento sia in semi-field.

(31)

31

24h Bait 1: Stima Y rispetto a X di Medflies (no) per Tested cue Pagina 1 di 3

0 5 10 15 Medfli e s (n o ) Bait 1 Control

Tested cue Tutte le coppie_Tukey-Kramer 0,05 1,95996 q* 0,05 Alpha Control Livello Bait 1 - Livello 6,888889 Differenza media degli score 2,502287 Diff err std 2,753038 Z 0,0059* p-value 5,000000 Hodges-Lehmann

Confronti non parametrici per ogni coppia con il metodo di Wilcoxon

Bait 1 Control Livello 9 9 Conteggio 54,000 117,000 Somma degli score 85,500 85,500 Score atteso 6,0000 13,0000 Media degli score -2,753 2,753 (Media-Media0)/Std0 117 S 2,75304 Z 0,0059* Prob>|Z|

Test a due campioni, approssimazione normale 7,8257 Chi-quadrato 1 DF 0,0052* Prob>ChiQu

Test a una variabile,

approssimazione chi-quadrato

Test di Wilcoxon/Kruskal-Wallis (somme dei ranghi)

2,11991

q*

0,05

Alpha

Confronti per tutte le coppie mediante HSD di Tukey-Kramer Confronti di medie

Analisi a una via di Medflies (no) per Tested cue

0 5 10 15 Medfli e s (n o ) Bait 2 Control

Tested cue Tutte le coppie_Tukey-Kramer 0,05 1,95996 q* 0,05 Alpha Control Livello Bait 2 - Livello 2,444444 Differenza media degli score 2,494438 Diff err std 0,9799579 Z 0,3271 p-value 1,000000 Hodges-Lehmann

Bait 2 Control Livello 9 9 Conteggio 74,000 97,000 Somma degli score 85,500 85,500 Score atteso 8,2222 10,7778 Media degli score -0,980 0,980 (Media-Media0)/Std0 97 S 0,97996 Z 0,3271 Prob>|Z|

Test a due campioni, approssimazione normale 1,0496 Chi-quadrato 1 DF 0,3056 Prob>ChiQu

2,11991

q*

0,05

Alpha

0 2 4 6 8 10 12 14 Medfli e s (n o ) Bait 3 Control

Tested cue Tutte le coppie_Tukey-Kramer 0,05 1,95996 q* 0,05 Alpha Control Livello Bait 3 - Livello -3,77778 Differenza media degli score 2,490505 Diff err std -1,51687 Z 0,1293 p-value -3,00000 Hodges-Lehmann

Bait 3 Control Livello 9 9 Conteggio 103,000 68,000 Somma degli score 85,500 85,500 Score atteso 11,4444 7,5556 Media degli score 1,517 -1,517 (Media-Media0)/Std0 68 S -1,51687 Z 0,1293 Prob>|Z|

2,11991

q*

0,05

Alpha

0 5 10 15 20 Medfli e s (n o ) Bait 4 Control

Tested cue Tutte le coppie_Tukey-Kramer 0,05 1,95996 q* 0,05 Alpha Control Livello Bait 4 - Livello -4,66667 Differenza media degli score 2,476029 Diff err std -1,88474 Z 0,0595 p-value -2,00000 Hodges-Lehmann

Bait 4 Control Livello 9 9 Conteggio 107,000 64,000 Somma degli score 85,500 85,500 Score atteso 11,8889 7,1111 Media degli score 1,885 -1,885 (Media-Media0)/Std0 64 S -1,88474 Z 0,0595 Prob>|Z|

2,11991

q*

0,05

Alpha

Analisi a una via di Medflies (no) per Tested cue a d c b * *

Figura 3.1. Valutazione dell’attrattività di quattro nuove esche alimentari (a-d) nei confronti di

femmine accoppiate di C. capitata. Le esche sono state formulate a 0.3 g e comparate al controllo negativo. Ogni test di scelta è stato condotto in 9 repliche. I box plot indicano la mediana (linea interna ad ogni box plot) e il relativo intervallo di dispersione (quartili superiori e inferiori, outliers). Medie e errori standard sono forniti mediante linee verdi e T-bars in celeste, rispettivamente. Sopra ogni coppia di box plot, la presenza di un asterisco indica una differenza significativa tra l’attrattività dell’esca e del controllo (test di Wilcoxon, p<0.05).

0 2 4 6 8 10 12 14 Medfli e s ( n o ) Bait 4 Control Tested cue 1,95996 q* 0,05 Alpha Control Livello Bait 4 - Livello -5,11111 Differenza media degli score 2,494438 Diff err std -2,04900 Z 0,0405* p-value -3,00000 Hodges-Lehmann

1,95996 q* 0,05 Alpha Control Livello Bait 4 - Livello -5,11111 Differenza media degli score 2,494438 Diff err std -2,04900 Z 0,0405* p-value -3,00000 Hodges-Lehmann

Confronti non parametrici per tutte le coppie con il metodo di Steel-Dwass

Bait 4 Control Livello 9 9 Conteggio 109,000 62,000 Somma degli score 85,500 85,500 Score atteso 12,1111 6,8889 Media degli score 2,049 -2,049 (Media-Media0)/Std0 62 S -2,04900 Z 0,0405* Prob>|Z|

Test a due campioni, approssimazione normale

Chi-Test a una variabile,

Test di Wilcoxon/Kruskal-Wallis (somme dei ranghi) Analisi a una via di Medflies (no) per Tested cue a

d c

b

*

24h Bait 1 2: Stima Y rispetto a X di Medflies (no) per Tested cue Pagina 1 di 3

0 2 4 6 8 10 12 14 Medfli e s ( n o ) Bait 1 Control Tested cue 1,95996 q* 0,05 Alpha Control Livello Bait 1 - Livello 3,777778 Differenza media degli score 2,474709 Diff err std 1,526555 Z 0,1269 p-value 2,000000 Hodges-Lehmann

1,95996 q* 0,05 Alpha Control Livello Bait 1 - Livello 3,777778 Differenza media degli score 2,474709 Diff err std 1,526555 Z 0,1269 p-value 2,000000 Hodges-Lehmann

Bait 1 Control Livello 9 9 Conteggio 68,000 103,000 Somma degli score 85,500 85,500 Score atteso 7,5556 11,4444 Media degli score -1,527 1,527 (Media-Media0)/Std0 103 S 1,52655 Z 0,1269 Prob>|Z|

Test di Wilcoxon/Kruskal-Wallis (somme dei ranghi) Analisi a una via di Medflies (no) per Tested cue

0 1 2 3 4 5 6 7 8 Medfli e s (n o ) Bait 2 Control Tested cue 1,95996 q* 0,05 Alpha Control Livello Bait 2 - Livello 1,222222 Differenza media degli score 2,460140 Diff err std 0,4968101 Z 0,6193 p-value 0 Hodges-Lehmann

1,95996 q* 0,05 Alpha Control Livello Bait 2 - Livello 1,222222 Differenza media degli score 2,460140 Diff err std 0,4968101 Z 0,6193 p-value 0 Hodges-Lehmann

Bait 2 Control Livello 9 9 Conteggio 79,500 91,500 Somma degli score 85,500 85,500 Score atteso 8,8333 10,1667 Media degli score -0,497 0,497 (Media-Media0)/Std0 91,5 S 0,49681 Z 0,6193 Prob>|Z|

0 5 10 15 Medfli e s ( n o ) Bait 3 Control Tested cue 1,95996 q* 0,05 Alpha Control Livello Bait 3 - Livello -0,555556 Differenza media degli score 2,497057 Diff err std -0,222484 Z 0,8239 p-value -1,00000 Hodges-Lehmann

1,95996 q* 0,05 Alpha Control Livello Bait 3 - Livello -0,555556 Differenza media degli score 2,497057 Diff err std -0,222484 Z 0,8239 p-value -1,00000 Hodges-Lehmann

Bait 3 Control Livello 9 9 Conteggio 88,500 82,500 Somma degli score 85,500 85,500 Score atteso 9,83333 9,16667 Media degli score 0,222 -0,222 (Media-Media0)/Std0 82,5 S -0,22248 Z 0,8239 Prob>|Z|

Chi-quadrato DF Prob>ChiQu

Figura 3.2. Valutazione dell’attrattività di quattro nuove esche alimentari (a-d) nei confronti di

femmine accoppiate di Ceratitis capitata. Le esche sono state formulate a 0.03 g e comparate al controllo negativo. Ogni test di scelta è stato condotto in 9 repliche. I box plot indicano la mediana (linea interna ad ogni box plot) e il relativo intervallo di dispersione (quartili superiori e inferiori,

outliers). Medie e errori standard sono forniti mediante linee verdi e T-bars in celeste,

rispettivamente. Sopra ogni coppia di box plot, la presenza di un asterisco indica una differenza significativa tra l’attrattività dell’esca e del controllo (test di Wilcoxon, p<0.05)

(32)

32 a

b

24h SEDQ 7 days: Stima Y rispetto a X di Medflies (no) per Tested cue Pagina 1 di 3

0 5 10 15 20 25 30 Medfli e s (n o ) CONTROL SEDQ Tested cue 1,95996 q* 0,05 Alpha SEDQ Livello CONTROL - Livello 6,090909 Differenza media degli score 2,746899 Diff err std 2,217376 Z 0,0266* p-value 3,000000 Hodges-Lehmann

1,95996 q* 0,05 Alpha SEDQ Livello CONTROL - Livello 6,090909 Differenza media degli score 2,746899 Diff err std 2,217376 Z 0,0266* p-value 3,000000 Hodges-Lehmann

CONTROL SEDQ Livello 11 11 Conteggio 92,500 160,500 Somma degli score 126,500 126,500 Score atteso 8,4091 14,5909 Media degli score -2,217 2,217 (Media-Media0)/Std0 160,5 S 2,21738 Z 0,0266* Prob>|Z|

Test a due campioni, approssimazione normale 5,0646 Chi-quadrato 1 DF 0,0244* Prob>ChiQu

24h SEDQ 3 days: Stima Y rispetto a X di Medflies (no) per Tested cue Pagina 1 di 3

0 5 10 15 Medfli e s (n o ) CONTROL SEDQ Tested cue 1,95996 q* 0,05 Alpha SEDQ Livello CONTROL - Livello 11,91667 Differenza media degli score 2,872281 Diff err std 4,148851 Z <,0001* p-value 8,000000 Hodges-Lehmann

1,95996 q* 0,05 Alpha SEDQ Livello CONTROL - Livello 11,91667 Differenza media degli score 2,872281 Diff err std 4,148851 Z <,0001* p-value 8,000000 Hodges-Lehmann

CONTROL SEDQ Livello 12 12 Conteggio 78,000 222,000 Somma degli score 150,000 150,000 Score atteso 6,5000 18,5000 Media degli score -4,149 4,149 (Media-Media0)/Std0 222 S 4,14885 Z <,0001* Prob>|Z|

Test a due campioni, approssimazione normale 17,4545 Chi-quadrato 1 DF <,0001* Prob>ChiQu

*

Figura. 3.3. Valutazione dell’attrattività di SEDQ nei confronti di femmine accoppiate di C.

capitata. SEDQ è stato formulato a 0.03 g e comparate al controllo negativo. Il SEDQ è stato

arieggiato per 7 (a) e 3 (b) giorni prima degli esperimenti; i test di scelta sono stati condotti in 11 (a) e 12 (b) repliche. I box plot indicano la mediana (linea interna ad ogni box plot) e il relativo intervallo di dispersione (quartili superiori e inferiori, outliers). Medie e errori standard sono forniti mediante linee verdi e T-bars in celeste, rispettivamente. Sopra ogni coppia di box plot, la presenza di un asterisco indica una differenza significativa tra l’attrattività dell’esca e del controllo (test di Wilcoxon, p<0.05).

Bait 5 0.03 g: Stima Y rispetto a X di Medflies (n) per Tested cue Pagina 1 di 3

0 2 4 6 8 10 12 14 Medfli e s ( n ) bait 5 0.03 g control Tested cue 1,95996 q* 0,05 Alpha control Livello bait 5 0.03 g - Livello -1,58333 Differenza media degli score 2,862805 Diff err std -0,553071 Z 0,5802 p-value -1,00000 Hodges-Lehmann

1,95996 q* 0,05 Alpha control Livello bait 5 0.03 g - Livello -1,58333 Differenza media degli score 2,862805 Diff err std -0,553071 Z 0,5802 p-value -1,00000 Hodges-Lehmann

bait 5 0.03 g control Livello 12 12 Conteggio 160,000 140,000 Somma degli score 150,000 150,000 Score atteso 13,3333 11,6667 Media degli score 0,553 -0,553 (Media-Media0)/Std0 140 S -0,55307 Z 0,5802 Prob>|Z|

Test di Wilcoxon/Kruskal-Wallis (somme dei ranghi) Analisi a una via di Medflies (n) per Tested cue

ns

Figura 3.4. Valutazione dell’attrattività del bait 5 nei confronti di femmine accoppiate di C. capitata.

L’esca è state formulata a 0.03 g e comparate al controllo negativo. Ogni test di scelta è stato condotto in 12 repliche. I box plot rossi indicano la mediana (linea interna ad ogni box plot) e il relativo intervallo di dispersione (quartili superiori e inferiori, outliers). Medie e errori standard sono forniti mediante linee verdi e T-bars in celeste, rispettivamente. Al di sopra dei box plots, ns indica che non ci sono differenze significative rispetto al controllo. (Wilcoxon test, p<0.05).

(33)

33 3.2 Biosaggi nel tunnel del vento.

I biosaggi nel tunnel del vento hanno mostrato che l’efficacia del bait 4 e del SEDQ lure nell’attrarre le femmine di medfly è comparabile. I risultati ottenuti nel tunnel del vento hanno messo in luce che non sussistono differenze significative tra il bait 4 e il SEDQ lure, ma che sussistono tra il controllo negativo e le trappole innescate (c2 _{= 11,53, d.f=2, p <0,0031***), a conferma}

dell’efficacia del biosaggio (Figura 3.5). Sia il bait 4 che il SEDQ lure hanno attratto il 72% circa delle mosche rilasciate.

Il numero delle mosche che, al termine della prova, era posizionato nel settore 1 del tunnel del vento – settore dov’è posizionata la trappola innescata non ha presentato differenze rilevanti tra il bait 4 e il SEDQ lure (i.e., 3,8 ± 1,25 % vs. 6,7 ± 2,71 %, rispettivamente). Infine, una porzione limitata (< 25%) di C. capitata non ha risposto all’attrattivo in entrambi i casi.

senza nome: Stima Y rispetto a X di Trapped medflies (no) per Tested productPagina 1 di 4

0 5 10 15 20 25 30 35 40 Trapped medfli e s ( n o )

Bait 4 SEDQ Blank

Tested product 1,95996 q* 0,05 Alpha SEDQ Blank Blank Livello Bait 4 Bait 4 SEDQ - Livello 0,83333 -5,83333 -5,83333 Differenza media degli score 2,063389 2,074375 2,081666 Diff err std 0,40387 -2,81209 -2,80224 Z 0,6863 0,0049* 0,0051* p-value 2,0000 -23,0000 -26,0000 Hodges-Lehmann

Confronti non parametrici per ogni coppia con il metodo di Wilcoxon

2,34370 q* 0,05 Alpha SEDQ Blank Blank Livello Bait 4 Bait 4 SEDQ - Livello 0,83333 -5,83333 -5,83333 Differenza media degli score 2,063389 2,074375 2,081666 Diff err std 0,40387 -2,81209 -2,80224 Z 0,9140 0,0136* 0,0141* p-value 2,0000 -23,0000 -26,0000 Hodges-Lehmann

Confronti non parametrici per tutte le coppie con il metodo di Steel-Dwass

Bait 4 SEDQ Blank Livello 6 6 6 Conteggio 72,000 78,000 21,000 Somma degli score 57,000 57,000 57,000 Score atteso 12,0000 13,0000 3,5000 Media degli score 1,362 1,925 -3,333 (Media-Media0)/Std0 11,5332 Chi-quadrato 2 DF 0,0031* Prob>ChiQu

Test a una variabile,

approssimazione chi-quadrato

Test di Wilcoxon/Kruskal-Wallis (somme dei ranghi)

Confronti di medie

Analisi a una via di Trapped medflies (no) per Tested product

Figura 3.5.Biosaggio attrattività del bait 4 e del SEDQ lure valutate in flight tunnel nei confronti di femmine accoppiate di C. capitata. È stato inoltre condotto un biosaggio con la trappola non innescata, per corroborare i dati ottenuti (nrep = 6, nfem = 40). Sia l’esca sia il SEDQ lure sono state formulate a dosi pari a 0.03 g. Ogni test di scelta è stato condotto in 6 repliche. I box plot rossi indicano la mediana (linea interna ad ogni box plot) e il relativo intervallo di dispersione (quartili superiori e inferiori, outliers). Medie e errori standard sono forniti mediante linee verdi e T-bars in celeste, rispettivamente. Al di sopra dei box plots, ns indica che non ci sono differenze significative rispetto al controllo. (Kruskal-Wallis test, p < 0,05***).

a a

b ***

(34)

34 3.3 Biosaggi in semi-field

I risultati ottenuti hanno confermato quanto visto nel biosaggio condotto nel flight tunnel. Si può infatti notare che non sussistono differenze significative tra il bait 4 e il SEDQ lure, entrambi testati a dosi pari a 0.3 g per trappola (χ²=0.026, d.f.=1, p=0.873) (Figura 3.6).

Semifield DATA JMP: Stima Y rispetto a X di Trapped medflies (no) per Tested product

Pagina 1 di 3

10 20 30 40 50 Trapped medfli e s (n o ) Bait 4 0.6 g SEDQ 0.6 g Tested product

1,95996

q*

0,05

Alpha

SEDQ 0.6 g

Livello

Bait 4 0.6 g

- Livello

0,1666667

Differenza media

degli score

2,081666

Diff err std

0,0800641

Z

0,9362

p-value

Confronti non parametrici per ogni coppia con il metodo di Wilcoxon

1,95996

q*

0,05

Alpha

SEDQ 0.6 g

Livello

Bait 4 0.6 g

- Livello

0,1666667

Differenza media

degli score

2,081666

Diff err std

0,0800641

Z

0,9362

p-value

Confronti non parametrici per tutte le coppie con il metodo di Steel-Dwass

Bait 4 0.6 g

SEDQ 0.6 g

Livello

6

6 Conteggio

38,000

40,000

Somma

degli score

39,000

Score

atteso

6,33333

6,66667

Media

degli score

-0,080

0,080

(Media-Media0)/Std0

40 S

0,08006

Z

0,9362

Prob>|Z|

Test a due campioni,

approssimazione normale

Chi-Test a una variabile,

approssimazione chi-quadrato

Test di Wilcoxon/Kruskal-Wallis (somme dei ranghi)

Analisi a una via di Trapped medflies (no) per Tested product

Figura 3.6. Biosaggio dell’attrattività del bait 4 e del SEDQ lure valutata in una serra tunnel su

femmine accoppiate di C. capitate; ciascuna prova è stata replicate 6 volte testando 4 sticky trap, due innescate con il SEDQ lure e due con il bait 4 (cross-pattern, ciascuna trappola innescata con 0.3 g di attrattivo, per ciascun prodotto una dose totale di 0.6 g); ciascuna replica è durata 24 ore. I box plot rossi indicano la mediana (linea interna ad ogni box plot) e il relativo intervallo di dispersione (quartili superiori e inferiori, outliers). Medie e errori standard sono forniti mediante linee verdi e T-bars in celeste, rispettivamente. Al di sopra dei box plot, ns indica che non ci sono differenze significative rispetto al controllo. (Wilcoxon test, p<0.05).

(35)

35 3.4 Feeding test

I risultati ottenuti durante i biosaggi di feeding hanno mostrato che il 66% delle femmine di C. capitata testate si sono nutrite del bait 4 (Grafico 3.1).

Un modello lineare misto a misure ripetute è stato eseguito per valutare l’ipotesi di differenze significative nella durata dell’atto trofico tra le differenti repliche (nove in totale, una è stata esclusa in quanto solamente una mosca si nutriva). I risultati mostrano che non sussiste una differenza significativa tra i differenti gruppi di mosche testati in serie (p=0.28) e che inoltre la durata media dell’atto trofico è pari a 23.8 ± 8.7 s. 66 34 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Feeding No-feeding ME DF LI ES F EE DI N G (% )

Grafico 3.1 Percentuale della risposta delle femmine accoppiate di mosca Mediterranea della

frutta durante il biosaggio di feeding. L’istogramma mostra la percentuale delle femmine che si è nutrita del bait e quella delle femmine che non si sono nutrite.

(36)

IV. Discussione

In base agli esperimenti di valutazione dell’attrattività delle cinque nuove esche alimentari eseguiti con l’olfattometro statico, è possibile evincere che il bait 4 sia l’attrattivo più promettente. Infatti, come si può notare già nei grafici riportati in Figura 3.1 e 3.2, quest’esca risulta essere significativamente attrattiva nei confronti delle femmine di mosca mediterranea della frutta, ad entrambe le dosi testate, 0.3 g e 0.03g. D’altro canto, i composti 1, 2 e 3 non presentano alcuna attrattività significativa nei confronti del tefritide. Inoltre, il bait 1, a dose 0.3 g, stimola risposte innate di chemotassi negativa nei confronti di C. capitata (Figura 3.1a).

Il bait 5 è un’esca che è stata fornita dall’azienda in un secondo momento. Infatti, l’obiettivo era quello di modificare la composizione del bait 4 per renderla ulteriormente efficace. Come si può notare nella Figura 3.5, il bait 5 non presenta alcuna attrattività nei confronti di C. capitata, motivo per cui, come per gli altri attrattivi, è stata scartata nelle successive prove.

Successivamente, per corroborare i risultati ottenuti in olfattometro statico, sono stati eseguiti ulteriori biosaggi del bait 4 sia nel flight tunnel sia in semi-field. I risultati del flight tunnel avvalorano quelle che erano le ipotesi iniziali, ovvero che il bait 4 è attrattivo. Eseguendo, i soliti biosaggi con il SEDQ lure – esca proteica già presente sul mercato – è stato osservato che non sussistono differenze significative tra i due attrattivi alimentari. Per validare il metodo è stato eseguito anche un controllo negativo, con trappola adesiva non innescata. La percentuale di cattura del bianco risulta ~ 10 % dimostrando l’adeguatezza del biosaggio.

È stato inoltre notato che, le femmine di C. capitata che non scelgono si trovano nel settore più lontano dalla trappola (Settore 6) e che, al termine delle 24 ore, la

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37 percentuale di femmine che si trovavano nei pressi della trappola innescata – settore 1 flight tunnel – è pari al 3.8% e 6.7%, rispettivamente per il bait 4 e SEDQ lure. È stato deciso di utilizzare una trappola bianca, come riportato nei lavori di Nakagawaet et al., (1978) e Prokopy and Economopoulos (2009), in quanto il colore bianco ha minor effetto attrattivo nei confronti di C. capitata rispetto ad altri colori (giallo, nero, rosso o arancione) permettendo dunque di valutare meglio l’efficacia dell’esca.

Essendo dunque certa l’efficacia del bait 4, è stato deciso di mettere a confronto i due attrattivi, quello di nuova formulazione e quello già presente in commercio, e di valutarne l’efficacia e, se esistessero, delle differenze in condizione di semi-campo.

Sebbene la distanza tra il punto di rilascio e le trappole sia poca (~ 60 cm), i dati ricavati hanno dimostrato che non sussistono differenze significative tra il numero di mosche catturato dalle trappole innescate con il bait 4 e quelle innescate con il SEDQ lure. Ulteriori prove verranno eseguite a distanze maggiori e con dosi inferiori di entrambi i composti per corroborare i risultati fino ad ora ottenuti.

(38)

V. Conclusione

L’idea dell’azienda nasce dalla necessità di creare un prodotto che possa non solo avere le caratteristiche di base di qualsiasi lure, ma che sia, allo stesso tempo, ingerito dalla femmina di C. capitata. In questo modo, il prodotto finale risulterà più selettivo nei confronti della mosca mediterranea della frutta, andando a ridurre quelli che sono i possibili effetti negativi sugli insetti non-target. A ragion di ciò, dopo aver testato l’attrattività del bait, è stato richiesto che fossero eseguiti anche dei biosaggi per valutare se la mosca si nutrisse o meno dell’attrattivo. È stato osservato che il 66% delle femmine di C. capitata si è nutrito del bait 4 e che la durata dell’atto trofico è, in media, 23.8 s.

Questo altro dato ha corroborato la nostra ipotesi, ovvero che il bait 4 sia un buon attrattivo, seppur ovviamente ancora migliorabile.

Una delle possibili motivazioni per cui il bait 4, tra i cinque, sia risultato il migliore, si può ricercare nella sua composizione chimica e nel buon rapporto tra frazione glucidica e frazione proteica rispetto agli altri. La frazione glucidica, all’interno di un attrattivo alimentare può rivelarsi fondamentale in quanto alcuni zuccheri, quali il saccarosio, fungono da fago-stimolanti (James L. Ort et al., 2002; Genç et al., 2006; Manrakhan and Lux, 2008). È inoltre noto che le femmine abbiano un elevato fabbisogno in proteine per deporre le uova e apparentemente anche di zucchero per completare il fabbisogno in energia necessario ad effettuare altre attività (Kouloussis et al., 2017). A ragion di ciò, un possibile modo per implementare questo bait è il miglioramento dell’equilibrio tra queste due frazioni, andando ad approfondire quelle che sono le necessità fisiologiche del pest.

Come riportato da Guillén et al. (2016), è noto che ad oggi esiste una maggior propensione verso lo studio delle risposte comportamentali dei tefritidi ai segnali